肺动脉高压与肺纤维化相关大鼠模型的建立与验证

本文介绍了通过将博来霉素注射到气道中来诱导肺动脉高压与肺纤维化相关的肺动脉高压 （PF-PH） 大鼠模型的方法。我们还提供了一种分步方法来验证这种动物模型。

肺纤维化患者患肺动脉高压的风险更高，肺动脉高压是一种预后不良的并发症。目前，人们对这种联系的机制仍然知之甚少。该领域进展的主要障碍是缺乏可靠的动物模型来复制 PF-PH。本研究旨在建立稳定的 PF-PH 大鼠模型。大鼠在干预前禁食过夜。在戊巴比妥钠麻醉 （45 mg/kg） 下，用 PE50 管插管插管至 3 cm 深度（从声门到管的距离）。博来霉素 （BLM） 以单剂量 （5 mg/kg，溶于 0.2 mL 0.9% NaCl） 气管内给药。注射后，立即旋转大鼠以确保 BLM 分布均匀。注射 BLM 后 35 d 大鼠出现肺功能进行性损害，右心室收缩压升高和右心室肥大，揭示了肺动脉高压的病理特征。我们提供了一种通用且可靠的方法来建立 PF-PH 的大鼠模型。

间质性肺病 （ILD） 引起的肺动脉高压 （PH） 在临床上很常见，特发性肺纤维化 （IPF） 患者的患病率估计为 10%-80%，也常见于其他纤维化 ILD ^1,2。大量研究表明，PH 的发展与大量发病率和生存率降低有关 ^3,4,5。与第 1 组肺动脉高压 （PAH） 相比，与肺纤维化 （PF-PH） 相关的肺动脉高压的发病机制仍然知之甚少⁶。建立大鼠 PF-PH 动物模型的目的是为肺动脉高压相关肺纤维化的科学研究提供可靠的框架，并探索临床治疗应用的潜在途径。

博来霉素是动物模型中广泛使用的肺纤维化经典诱导剂⁷。Blackburn 等人 ⁸ 和我们的实验室⁹ 的进一步研究表明，博来霉素还可以触发肺动脉高压的典型病理特征，例如右心室收缩压 （RVSP） 升高和右心室肥大。从机制上讲，博来霉素诱导肺实质纤维化、缺氧性血管收缩和肺血管床密度降低，从而导致肺动脉高压的发展⁶。此外，我们从博来霉素治疗的第 7 天开始观察到肺血管内皮细胞的显着丢失，并且这种丢失在实验过程中逐渐恶化⁹。这种现象表明，博来霉素诱导的肺血管内皮功能障碍可能在肺动脉高压的发生和发展中起潜在作用。

由于肺间质纤维化，IPF 患者长期处于缺氧状态，心肺血管发生代偿性变化，导致肺动脉高压⁶。使用动物模型可以帮助我们进一步了解与肺动脉高压相关的人类特发性肺纤维化的潜在机制。虽然该模型不能完全模拟人类疾病的病理特征，但该模型仍然可以提供有价值的见解。有许多模拟肺纤维化的实验模型，例如博来霉素的单剂量气道输注、转化生长因子的病毒载体递送以及二氧化硅暴露 ^8,10。目前，BLM 模型是应用最广泛和特征最显著的模型，因为它可以在短时间内轻松诱导并且具有很高的重现性。此外，已在博来霉素小鼠模型中评估了肺纤维化的时间变化，其中从第 15-21 天观察到纤维化标志物和与疾病病理相关的基因（如 Col1A1 和 Col1A2）的表达增加⁸。在第 33 天或之后检测到心血管变化，例如右心室肥厚和 RVSP 的显着增加¹¹.同时，我们的实验室之前已经评估了博来霉素⁹ 诱导的大鼠模型的 PH 和 PF 参数的变化。我们发现，除了大鼠进行性肺功能损害和胶原蛋白沉积等肺纤维化 （PF） 特征外，肺动脉高压 （PH） 的典型特征在单次气道滴注博来霉素后 7 至 35 天内逐渐出现。RVSP 和 Fulton 指数显示时间依赖性增加。目前，文献中已经报道了各种患有肺纤维化的动物。一些专家认为，大鼠模型比小鼠模型表现出更明显的纤维化反应¹²。因此，为了更好地研究肺纤维化合并肺动脉高压的进展，博来霉素诱导的大鼠模型是关键。

本研究中描述的动物实验经广州医科大学第一附属医院动物护理与使用专业委员会批准（伦理批准号：2018-456）。

1. 实验大鼠的采购

1. 将大鼠分为两组：正常对照组和模型组，每组 7 只大鼠。使用体重为 200 ± 20 克的 10 周龄雄性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠进行研究

2. PF-PH 大鼠模型的诱导

1. 为了防止手术过程中反流，在建模前将大鼠禁食过夜。
2. 通过腹膜内注射戊巴比妥钠 （45 mg/kg） 麻醉大鼠，以确保手术的准确性和安全性，并最大限度地减少动物的疼痛和压力。通过对脚趾捏伤缺乏反应来确认手术麻醉水平。同时，在大鼠的眼睛上涂抹药膏以防止干燥。
3. 用插入 PE50 管至 3 cm 深度（从声门到管的距离）插入大鼠的气管。
4. 使用 1 mL 注射器 （26G），抽取 0.2 mL 博来霉素（5 mg/kg，溶于 0.2 mL 0.9% NaCl）。将含有 BLM 的注射器作为单剂量通过套管注射到气道中。对于对照组的大鼠，进行无菌生理盐水 （0.2 mL） 的气管内给药。在此过程中，大鼠不需要缓解疼痛。
5. 为确保博来霉素分布均匀，请将大鼠置于仰卧位，轻轻握住并缓慢旋转。推荐的旋转角度为 30°-45°，两侧交替。每次旋转应保持 10-15 秒，重复 3 次至 4 次。
6. 将大鼠放在加热垫上，以帮助维持体温并密切监测它们的状态。观察大鼠何时开始自行移动，并将动物从加热垫转移到单独的笼子中进行恢复。
7. BLM 注射 5 周后，评估大鼠以确定是否可以使用超声心动图监测、血流动力学测量和组织学分析等方法成功建立 PF-PH 模型。

3. 超声心动图监测

1. 使用 4% 异氟醚麻醉大鼠。用脱毛霜去除老鼠的皮毛，然后在它的胸部涂抹超声波凝胶。
2. 用 250 MHz 超声探头评估大鼠右心的功能和结构参数。为了获得心室的最佳长轴视图，请将探头放在动物胸部正中线的左侧。
3. 根据个体解剖结构，将探头相对于左胸骨旁线逆时针旋转 15°，切牙指向右肩，并在 B 模式下调整 x 轴和 y 轴，使整个心脏位于视野的中心。
4. 选择 Color （颜色 ） 以显示血流颜色以区分肺动脉 （此位置的肺动脉血流信号为蓝色）。
5. 选择 PW （PW 多普勒）模式，将采样线置于肺动脉瓣下方，旋转 PW 角度旋钮调整采样线方向，使采样方向与肺动脉血流方向平行（约 25°）。再次按 PW 键，获取肺动脉血流加速时间/射血时间 （PAT/PET）。测量至少 5 个心动周期并取平均值。使用 Cine 保存图像。
6. 将动物调整到低头高脚，将超声探头放在动物心脏心尖处，沿着心尖驱动超声，得到四腔切口面。在 B 模式下调整 x 轴和 y 轴，以确保四个心腔可见。
7. 按住 M 模式显示测量线 2 倍，并将其放置在三尖瓣环和右心室游离壁的交界处。在至少三个心动周期内测量三尖瓣位移距离 （TAPSE），并将其保存在 Cine 中。
8. 将探头放在动物胸部右锁骨的中线，并将探头与动物胸部缺口之间的角度调整到约 45°。在 B 模式下调整图像，以便可以看到右心室室和室间隔。
9. 选择 M 模式 以显示测量线 2 倍，并将测量线放在室间隔的中间。采样线垂直于右心室游离壁。保存图像以获得右心室游离壁的厚度。

4. 肺功能估计

1. 打开 PFT 软件并检查设备是否被识别。根据设备说明书进行校准，以确保流量传感器和压力传感器的准确性。在 PFT 软件中设置测试参数，例如呼吸频率、潮气量、测试持续时间等。
2. 动物检测模式是大鼠研究的模式。打开主控仪表的开关，确保每个信号的开关 amp升压器处于关闭位置。
3. 根据动物的体重设置气流。打开吸气量调节螺母，将吸气设置为 5。打开呼气气流调节螺母，并将慢速呼气设置为 -4。将压力值设置为 60 cm H₂O，然后根据 FRC 流量、流量、高流量和肺压的顺序校准仪器，误差小于 0.5%。
4. 如步骤 2.2 所示，通过腹膜内注射戊巴比妥钠 （45 mg/kg） 麻醉大鼠。沿着颈部中心切开皮肤，逐层去除肌肉。
5. 在暴露的宫颈气管上部，在气管软骨环之间做一个水平切口。将金属套管快速插入气管切口，确保套管位置正确且固定。使用 4-0 丝线缝合线将套管固定在气管上，防止其滑动或移动。将大鼠置于 PFT 动物隔室中，并将气管插管连接到仪器外的气流通道接口。
6. 单击 开始 按钮并检查用力肺活量 （FVC） 和动态肺顺应性。为保证数据一致性，每个指标至少记录 3 次。
7. 测试完成后，数据将被保存并导出到分析软件中。使用统计软件分析数据，比较不同组的肺功能参数。

5. 血流动力学和组织学测量

1. 右心室收缩压 （RVSP） 检测
   1. 如步骤 2.2 所示，通过腹膜内注射戊巴比妥钠 （45 mg/kg） 麻醉大鼠。通过捏住脚趾确认大鼠已正确麻醉，以确保大鼠没有反应。将大鼠腹部向上固定在实验台上，将眼霜涂抹在大鼠的眼睛上，以防止干燥。
   2. 用手术剪刀在颈部右侧切开一个切口（约 4 厘米），然后通过显微手术钳分离颈外静脉。用微型镊子轻轻分离长度约为 1 厘米的静脉，并在远端和近端插入两条手术线。
   3. 插管前，将 PE50 管浸泡在含有 1% 肝素钠或 EDTA 的生理盐水中至少 30 分钟。调整生理记录仪，使压力回到 0 线，并将压力范围调整为 0-150 mmHg。
   4. 用 4-0 丝线结扎颈外静脉远端，轻轻提起近端手术线，置于远端静脉壁上。用小剪刀做一个小切口（约 0.3 毫米）。将 PE50 管插入颈外静脉后，用 4-0 丝线将导管与颈外静脉结扎在一起，以防止血液渗漏。
   5. 观察记录仪上的静脉压波形。将导管缓慢推入右心房，右心房波形可见，振幅约为 0-5 mmHg。导管继续从右心房推进到右心室后，可以看到右心室压力波形。当压力稳定时，记录 RVP 5 分钟，保存数据并使用分析软件进行分析。
2. Fulton 指数检测
   1. 检测到 RVSP 后，在异氟醚麻醉 （5%，2 L/min O₂） 后，通过放血对大鼠实施安乐死。
   2. 开胸手术后，用镊子切除大鼠的完整心脏。用剪刀剪掉心脏附近的耳廓和结缔组织。
   3. 沿肺动脉切开右心室的游离壁。这个组织是右心室 （RV）。其余组织为左心室加室间隔 （LV+S）。分离后，用滤纸引流右心室 （RV） 和左心室加室间隔 （LV+S） 的表面，并使用分析天平分别称量。记录右心室 （RV） 和左心室加室间隔 （LV+S） 的重量后，计算右心室与左心室加室间隔的重量比 （RV/（LV+S））。
3. 组织学染色
   1. 打开胸腔后，使用 10 mL 注射器抽取 3 mL 生理盐水。将注射器插入肺动脉，慢慢注入生理盐水以冲洗肺部，去除血液和其他残留物。
   2. 用剪刀解剖右副肺叶和右前叶。将这两个肺叶放入 4% 福尔马林中固定以保持组织形态和结构。将肺的剩余三个肺叶（如左肺、右中叶和右后叶）迅速放入液氮中冷冻储存，为后续实验做好准备。
   3. 从肺组织表面去除多余的脂肪和结缔组织，以确保组织块干净整洁。将肺叶修剪成 5 毫米 x 5 毫米 x 3 毫米的小块。将修剪过的组织块放入脱水机中，并使用梯度系列酒精（60%、70%、80%、90%、100%）逐渐脱水。
   4. 将肺组织浸入二甲苯中 2 小时以达到透明度。去除后，将其在 56-58 °C 的熔化石蜡中浸泡 2 小时以确保完全浸润。然后，将纸巾放入模具中，将其放置在切割面朝下的位置，以便进行后续切片。
   5. 将蜡块切成切片机上厚度为 4-8 μm¹³ 的切片，并在室温下储存用于病理染色。
   6. 进行 Eosin 和 Masson 的三色染色¹⁴.

6. 羟脯氨酸 （HYP） 的检测

1. 在玻璃管中称取 30-100 毫克肺组织。加入 2 mL 盐酸溶液 （6 mol/L），在 110 °C 的烘箱中消化 2-6 小时，直到看不到大团块。
2. 冷却后，使用 1 mL NaOH 溶液 （10 mol/L） 将 pH 值调节至 6-8 范围，然后将蒸馏水冷凝至 4 mL 溶液。最后，在 25 °C 下以 28,620 x g 离心 20 分钟，并取上清液。
3. 将酶标仪预热 30 分钟，将波长调整至 560 nm，并使用蒸馏水将仪器归零。
4. 用蒸馏水稀释标准溶液，制备浓度为 30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469 和 0.234 μg/mL 的标准溶液。
5. 取 60 μL 样品上清液，与 60 μL 试剂 A 混合，然后在室温下静置 20 分钟。
6. 加入 60 μL 试剂 B 和 120 μL 蒸馏水。将混合溶液置于 60 °C 水浴中 20 分钟。对每种浓度的标准溶液（例如，30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234 μg/mL）遵循相同的步骤并相应地执行作。
7. 在室温下放置 15 分钟后，取 200 μL 溶液在 96 孔板中检测 560 nm 处的光吸收值。以标准溶液的浓度为 x 轴，测量值为 y 轴，绘制标准曲线，得到方程 y=kx+b。将样品的测量值代入方程式中，以确定样品的浓度。

博来霉素诱导的大鼠肺纤维化
据报道，博来霉素在动物模型中是肺纤维化的典型诱导剂⁷。在这里，评估了 BLM 刺激后肺纤维化的指标。首先，在 BLM 治疗 35 天后，我们进行了肺功能测试，发现模型组的 FVC（图 1E）和动态肺顺应性（图 1F）均显着降低。这些结果清楚地表明肺功能明显受损。其次，为了评估肺组织中的胶原蛋白沉积，该研究采用了 Masson 的三色染色和 HYP 测定。Masson 的三色染色显示，模型组肺动脉周围的蓝色染色区域显着增加，表明胶原蛋白积累明显（图 1D）。同时，HYP 测定结果表明，模型组的 HYP 水平显著高于对照组（图 2E），进一步证实了胶原蛋白沉积的增加。此外，我们使用称重法评估了肝脏（图 3A）和肾脏（图 3B）的重量，发现两组之间没有显着差异。

BLM 刺激的肺动脉高压进展
接下来，测量肺动脉高压的特征性血流动力学变化。BLM 治疗 35 天后，使用右心导管插入术评估右心室收缩压 （RVSP）。结果表明，模型组的 RVSP （图 1A，C） 显著高于对照组。同时，通过计算大鼠心脏的富尔顿指数，发现右心室与左心室加房间隔重量的比值 （RV/（LV+S）;图 1B）BLM 治疗 35 天后显着增加。升高的 RVSP （图 1A，C） 和 RV/（LV+S） 增加 （图 1B） 共同表明肺纤维化联合肺动脉高压 （PF-PH） 模型的成功建立。此外，组织学分析显示模型组与肺血管重塑相关的典型组织病理学变化（图 1D）。为了进一步评估心脏功能，我们进行了超声心动图检查，结果显示模型组的 PAT/PET （图 2A） 、 TAPSE （图 2B） 、 RVFAC （图 2C） 和 CO （图 2D） 的比率显着降低。综上所述，这些结果表明 BLM 是成功构建 PF-PH 大鼠模型的有效诱导剂。

图 1：BLM 处理的大鼠表现出血流动力学指数增加、血管重塑和肺功能功能障碍。 （A） RVSP、（B） RV/LV+S 和 （C） 代表性迹线显示对照组和模型组的血流动力学指标。（D） 伊红和 Masson 三色染色，显示每组肺切片内肺动脉的组织学变化。（E） 条形图显示 FVC （F） 和动态肺顺应性。结果表示为 SEM ±平均值，并通过学生 t 检验评估显着性。每组 n = 8 （A， B）;每组中 n = 6 （E， F）。*p < 0.05，表明存在显著差异。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：BLM 治疗后检测到右心功能障碍和胶原蛋白沉积。 条形图显示了 （A） PAT/PET、（B） TAPSE、（C） RVFAC、（D） CO 和 （E） HYP 浓度的比率。结果表示为 SEM ±平均值，并通过学生 t 检验评估显着性。n = 6 个。*p < 0.05，表明存在显著差异。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：模型组和对照组之间的肝脏和肾脏重量相当。 条形图显示 （A） 肝脏和 （B） 肾脏的权重。结果表示为 SEM ±平均值，并通过学生 t 检验评估显着性。*p < 0.05，表明存在显著差异。（C） 建立 PF-PH 大鼠模型的方案示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。

特发性肺纤维化是一种进行性的致命疾病，从诊断开始的中位生存期为 2-3 年，表明预后很糟糕⁹。肺动脉高压是 IPF 的常见合并症，IPF 会迅速恶化，预后恶化¹⁵。更重要的是，IPF-PH⁷ 的治疗选择有限。因此，必须更深入地了解 PF-PH 的潜在分子机制，这可能为该疾病提供潜在的治疗方法。

拟议的协议概述了一种用于生成 PF-PH 大鼠模型的成熟且稳定的方法。该模型对于研究疾病的病理生理机制至关重要，并在验证新的治疗方法方面发挥着至关重要的作用。PF 动物模型可以通过多种方法建立，包括给药、照射、二氧化硅暴露、病毒载体、转基因和人成纤维细胞转移¹⁶。每种建模方法都有其优点和缺点。例如，照射既昂贵又耗时（需要 30 多周）;二氧化硅治疗比 PF 更可能引起尘肺病;病毒载体和转基因动物模型的程序相对复杂，需要高级技能;而人成纤维细胞的转移导致低重现性和高成本¹⁶。相比之下，药物诱导的 PF 模型，例如使用博来霉素、胺碘酮、甲氨蝶呤和氮芥的模型，易于实施、有效且可重复⁷。

该模型有三个关键步骤，包括剂量和给药方式、性别选择和制作模型的时间。尽管通过气管内或口咽途径输送单剂量 BLM （0.1-6 mg/kg） 是 PF 建模的常用方法¹⁷。我们进行了一些改进。在本研究中，探讨了 BLM 给药的最佳剂量和模式，并选择了 5 mg/kg 的气管内给药剂量。因为雌性 Sprague-Dawley 大鼠的肺动脉高压 （PH） 比雄性大鼠¹⁸ 岁更严重，雄性大鼠对肺小动脉重塑更敏感;我们在这项研究中使用了雄性大鼠。根据我们之前的研究，博来霉素组的 RVSP 和 Fulton 指数在博来霉素治疗后 7-35 天内逐渐升高，显著高于对照组。因此，模型的建模时间建议在 35 天左右。

我们以前的研究使用各种方法成功建立了肺动脉高压大鼠模型，包括 hypoxia¹⁹ 、 Sugen-hypoxia²⁰ 、 monocrotaline¹⁹ 、 pulmonary artery 结扎²¹ 和肾切除术¹⁵。在这些肺动脉高压动物模型中观察到的特征性变化包括 RVSP 增加、RV/（LV+S） 比率升高、肺血管重塑和右心功能障碍，与本研究的结果一致

尽管很容易获得 BLM，但这种动物模型有几个局限性。首先，BLM 的气道输注导致药物浓度分布不均匀，导致肺部局部纤维化。其次，BLM 是一种对研究人员构成健康风险的化疗药物。第三，研究表明 BLM 诱导的纤维化过程可能是自限性的¹⁶。

综上所述，我们使用 BLM 成功建立了 PF 相关 PH 大鼠模型。该动物模型表现出 PF 的典型特征，包括肺功能受损和胶原蛋白沉积升高。此外，我们在这种 BLM 诱导的大鼠模型中观察到代表性的血流动力学变化，例如 RVSP 和 RV/（LV+S） 比率增加，以及血管重塑和右心功能障碍。重要的是，建立 PF-PH 大鼠模型对于了解 PF-PH 的潜在机制和提供新的治疗方向很有价值。

作者没有相关的财务披露。

这项工作得到了国家自然科学基金（82370063、82170069、82120108001、82241012）、广州国家实验室研发计划（GZNl2023A02013）、国家重点研发计划（2022YFE0131500）、广东省科学技术厅（2024A1515011208、2022A1515012052、2024A1515013104、202102020019、202201020538、202201010069、2023A03J0334）、 广州医科大学广东省医学研究基金 （A2023379） 呼吸疾病国家重点实验室独立项目 （SKlRD-Z-202513） 和广州医科大学第六附属医院（清远人民医院）关于加强 GMU 科研和开放研究基金的计划 （202201-101）。