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* Estos autores han contribuido por igual
Aquí, se presenta el método de inducción de hipertensión arterial pulmonar asociada con fibrosis pulmonar (PF-PH) modelo de rata mediante la inyección de bleomicina en la vía aérea. También proporcionamos un enfoque paso a paso para validar este modelo animal.
Los pacientes con fibrosis pulmonar tienen un mayor riesgo de desarrollar hipertensión pulmonar, una complicación de mal pronóstico. En la actualidad, el mecanismo de este vínculo sigue siendo poco conocido. Un obstáculo importante para el progreso en esta área es la falta de un modelo animal confiable para replicar el PF-PH. Este estudio tuvo como objetivo establecer un modelo estable de rata PF-PH. Las ratas fueron ayunadas durante la noche antes de la intervención. Bajo anestesia con pentobarbital sódico (45 mg/kg), la tráquea se intubó con un tubo de PE50 insertado a una profundidad de 3 cm (la distancia entre la glotis y el tubo). La bleomicina (BLM) se administró por vía intratraqueal en dosis única (5 mg/kg, disuelto en 0,2 mL de NaCl al 0,9%). Después de la inyección, las ratas se rotaron inmediatamente para garantizar una distribución uniforme de la BLM. A los 35 días después de la inyección de BLM, las ratas mostraron un deterioro progresivo de la función pulmonar y un aumento de la presión sistólica del ventrículo derecho y de la hipertrofia ventricular derecha, revelando las características patológicas de la hipertensión pulmonar. Proporcionamos un método general y confiable para establecer un modelo de PF-PH en ratas.
La hipertensión pulmonar (HP) por enfermedad pulmonar intersticial (EPI) es frecuente clínicamente, con una prevalencia estimada del 10% al 80% en pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (FPI), y también se observa con frecuencia en otras EPI fibróticas 1,2. Numerosos estudios han demostrado que el desarrollo de HP está relacionado con una morbilidad sustancial y una menor supervivencia 3,4,5. En comparación con la hipertensión arterial pulmonar (HAP) del grupo 1, la patogenia de la hipertensión arterial pulmonar asociada a la fibrosis pulmonar (PF-HP) sigue siendo poco conocida6. El propósito de establecer un modelo animal de PF-PH en ratas es proporcionar un marco confiable para la investigación científica sobre la fibrosis pulmonar asociada con la hipertensión pulmonar y explorar posibles vías para aplicaciones terapéuticas clínicas.
La bleomicina es un inductor clásico de la fibrosis pulmonar ampliamente utilizado en modelos animales7. Investigaciones posteriores de Blackburn et al.8 y nuestro laboratorio9 han revelado que la bleomicina también puede desencadenar características patológicas típicas de la hipertensión pulmonar, como el aumento de la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP) y la hipertrofia del ventrículo derecho. Mecánicamente, la bleomicina induce fibrosis del parénquima pulmonar, vasoconstricción hipóxica y una reducción de la densidad del lecho vascular pulmonar, lo que conduce al desarrollo de hipertensión pulmonar6. Además, observamos una pérdida significativa de células endoteliales vasculares pulmonares a partir del día 7 de tratamiento con bleomicina, y esta pérdida empeora progresivamente a lo largo del experimento9. Este fenómeno sugiere que la disfunción endotelial vascular pulmonar inducida por bleomicina puede desempeñar un papel potencial en el inicio y la progresión de la hipertensión pulmonar.
Debido a la fibrosis intersticial pulmonar, los pacientes con FPI se encuentran en un estado de hipoxia durante mucho tiempo y se producen cambios compensatorios en los vasos cardiopulmonares, lo que conduce a la hipertensión pulmonar6. El uso de modelos animales puede ayudarnos a comprender mejor los mecanismos subyacentes de la fibrosis pulmonar idiopática humana asociada con la hipertensión pulmonar. Aunque este modelo no puede simular completamente las características patológicas de las enfermedades humanas, aún puede proporcionar información valiosa. Existen muchos modelos experimentales que simulan la fibrosis pulmonar, como la infusión de bleomicina en las vías respiratorias en una sola dosis, la administración de factores de crecimiento transformantes por vectores virales y la exposición a sílice 8,10. En la actualidad, el modelo BLM es el más utilizado y caracterizado porque se puede inducir fácilmente en poco tiempo y tiene una alta reproducibilidad. Además, se han evaluado los cambios temporales en la fibrosis pulmonar en un modelo de ratón con bleomicina, donde se observó un aumento de la expresión de marcadores de fibrosis y genes asociados con la patología de la enfermedad, como Col1A1 y Col1A2, desde los días 15-218. Se detectaron alteraciones cardiovasculares, como hipertrofia ventricular derecha y aumento significativo de la RVSP, a partir del día 3311. Al mismo tiempo, nuestro laboratorio ha evaluado previamente los cambios en los parámetros de PH y PF de modelos de rata inducidos por bleomicina9. Encontramos que además de las características de la fibrosis pulmonar (PF), como el deterioro progresivo de la función pulmonar y la deposición de colágeno en ratas, las características típicas de la hipertensión pulmonar (HP) emergieron gradualmente dentro de los 7 a 35 días después de una sola instilación de bleomicina en las vías respiratorias. El RVSP y el índice de Fulton mostraron un aumento en la dependencia del tiempo. Actualmente, se han reportado varios animales con fibrosis pulmonar en la literatura. Algunos expertos han sugerido que los modelos de rata exhibieron una respuesta fibrótica más pronunciada que los modelos de ratón12. Por lo tanto, para estudiar mejor la progresión de la fibrosis pulmonar combinada con la hipertensión pulmonar, la clave es un modelo de rata inducido por bleomicina.
Los experimentos con animales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou (número de aprobación ética: 2018-456).
1. Adquisición de ratas experimentales
2. Inducción del modelo de rata PF-PH
3. Monitorización ecocardiográfica
4. Estimación de la función pulmonar
5. Mediciones hemodinámicas e histológicas
6. Detección de hidroxiprolina (HYP)
Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratas
La bleomicina ha sido reportada como un inductor clásico de fibrosis pulmonar en modelos animales7. En este caso, se evaluaron los índices de fibrosis pulmonar tras la estimulación con BLM. En primer lugar, después de 35 días de tratamiento con BLM, realizamos pruebas de función pulmonar y descubrimos que tanto la FVC (Figura 1E) como la distensibilidad pulmonar dinámica (Figura 1F) en el grupo modelo se redujeron significativamente. Estos resultados indican claramente que la función pulmonar estaba marcadamente deteriorada. En segundo lugar, para evaluar la deposición de colágeno en el tejido pulmonar, el estudio empleó la tinción tricrómica de Masson y el ensayo HYP. La tinción tricrómica de Masson reveló un aumento significativo en las áreas teñidas de azul alrededor de las arterias pulmonares en el grupo modelo, lo que sugiere una acumulación pronunciada de colágeno (Figura 1D). Mientras tanto, los resultados del ensayo HYP demostraron que los niveles de HYP en el grupo modelo fueron significativamente más altos que los del grupo de control (Figura 2E), lo que confirma aún más el aumento de la deposición de colágeno. Además, evaluamos los pesos del hígado (Figura 3A) y de los riñones (Figura 3B) utilizando un método de pesaje y no encontramos diferencias significativas entre los dos grupos.
Progresión de la hipertensión pulmonar estimulada por BLM
A continuación, se midieron los cambios hemodinámicos característicos de la hipertensión pulmonar. Después de 35 días de tratamiento con BLM, se evaluó la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP) mediante cateterismo cardíaco derecho. Los resultados mostraron que la RVSP (Figura 1A,C) en el grupo modelo fue significativamente mayor que en el grupo control. Por su parte, al calcular el índice de Fulton de corazones de rata, se encontró que la relación entre el ventrículo derecho y el ventrículo izquierdo más el peso del tabique (RV/(LV+S); Figura 1B) aumentó significativamente después de 35 días de tratamiento con BLM. La elevación de la RVSP (Figura 1A,C) y el aumento del VD/(LV+S) (Figura 1B) indicaron colectivamente el establecimiento exitoso de la fibrosis pulmonar combinada con el modelo de hipertensión pulmonar (PF-PH). Además, el análisis histológico reveló cambios histopatológicos típicos relacionados con el remodelado vascular pulmonar en el grupo modelo (Figura 1D). Para evaluar más a fondo la función cardíaca, realizamos una ecocardiografía, que mostró que el grupo modelo exhibió proporciones significativamente reducidas de PAT/PET (Figura 2A), TAPSE (Figura 2B), RVFAC (Figura 2C) y CO (Figura 2D). En resumen, estos resultados demuestran que BLM es un inductor eficaz para construir con éxito el modelo de rata PF-PH.
Figura 1: La rata tratada con BLM mostró un aumento de los índices hemodinámicos, remodelación vascular y disfunción de la función pulmonar. (A) Las trazas representativas de RVSP, (B) RV/LV+S y (C) muestran índices hemodinámicos para los grupos de control y modelo. (D) Tinción de eosina y tricrómico de Masson, que exhibe los cambios histológicos en las arterias pulmonares dentro de las secciones pulmonares de cada grupo. (E) Los gráficos de barras muestran la FVC (F) y la distensibilidad pulmonar dinámica. Los resultados se expresan como media ± SEM, y la significancia se evaluó mediante la prueba t de Student. n = 8 en cada grupo (A, B); n = 6 en cada grupo (E, F). *p < 0,05, lo que indica una diferencia significativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Se detectó disfunción cardíaca derecha y depósito de colágeno después del tratamiento con BLM. Los gráficos de barras muestran la relación entre (A) PAT/PET, (B) TAPSE, (C) RVFAC, (D) CO y (E) concentración de HYP. Los resultados se expresan como media ± SEM, y la significancia se evaluó mediante la prueba t de Student. n = 6 en cada grupo. *p < 0,05, lo que indica una diferencia significativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los pesos del hígado y del riñón fueron comparables entre el modelo y el grupo control. Los gráficos de barras muestran los pesos del hígado (A) y del riñón (B). Los resultados se expresan como media ± SEM, y la significancia se evaluó mediante la prueba t de Student. *p < 0,05, lo que indica una diferencia significativa. (C) Esquema del protocolo para el establecimiento del modelo de rata PF-PH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La fibrosis pulmonar idiopática es una enfermedad progresiva y mortal con una mediana de supervivencia de 2-3 años desde el diagnóstico, lo que sugiere un pronóstico sombrío9. La hipertensión pulmonar es una comorbilidad frecuente de la FPI, que se deteriora rápidamente con un pronóstico peor15. Además, las opciones terapéuticas para la FPI-PH7 eran limitadas. Por lo tanto, es esencial obtener una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares subyacentes de la PF-PH, lo que puede proporcionar un enfoque terapéutico potencial para la enfermedad.
El protocolo propuesto describe un método bien establecido y estable para generar un modelo de rata PF-PH. El modelo es esencial para estudiar los mecanismos fisiopatológicos de las enfermedades y desempeña un papel crucial en la verificación de nuevos enfoques terapéuticos. Los modelos animales de PF pueden establecerse a través de varios métodos, incluyendo la administración de fármacos, la irradiación, la exposición a sílice, vectores virales, transgénicos y la transferencia de fibroblastos humanos16. Cada método de modelado tiene sus fortalezas y debilidades. Por ejemplo, la irradiación es costosa y requiere mucho tiempo (tarda más de 30 semanas); Es más probable que el tratamiento con sílice cause neumoconiosis que PF; Los procedimientos para los vectores virales y los modelos animales transgénicos son relativamente complicados y requieren conocimientos avanzados; y la transferencia de fibroblastos humanos resulta en baja reproducibilidad y altos costos16. Por el contrario, los modelos de PF inducidos por fármacos, como los que utilizan bleomicina, amiodarona, metotrexato y mostaza nitrogenada, son fáciles de implementar, eficaces y reproducibles7.
El modelo tiene tres pasos clave, que incluyen la dosis y el modo de administración, la selección del sexo y el tiempo para hacer el modelo. Aunque una dosis única de BLM (0,1-6 mg/kg), administrada por vía intratraqueal u orofaríngea, es un enfoque comúnmente utilizado para el modelado de la PF17. Hemos hecho algunas mejoras. En el presente estudio, se exploraron la dosis óptima y el modo de administración de BLM, y se seleccionó una dosis de 5 mg/kg administrada por vía intratraqueal. Debido a que las ratas hembras de Sprague-Dawley exhibieron hipertensión pulmonar (HP) menos severa que las ratas macho18 y las ratas macho son más sensibles a la remodelación de la arteriola pulmonar; En este estudio se utilizaron ratas macho. Según estudios previos realizados, el RVSP y el índice de Fulton en el grupo de bleomicina aumentaron gradualmente dentro de los 7-35 días posteriores al tratamiento con bleomicina, significativamente más alto que en el grupo de control. Por lo tanto, se recomienda que el tiempo de modelado del modelo sea de unos 35 días.
Nuestros estudios previos establecieron con éxito modelos de ratas con hipertensión pulmonar utilizando varios métodos, incluyendo hipoxia19, Sugen-hipoxia20, monocrotalina19, ligadura de la arteria pulmonar21 y nefrectomía15. Los cambios característicos observados en estos modelos animales de hipertensión pulmonar incluyen aumento de RVSP, relaciones RV/(VI+S) elevadas, remodelación vascular pulmonar y disfunción cardíaca derecha, en línea con los hallazgos del presente estudio
A pesar del fácil acceso a BLM, este modelo animal tiene varias limitaciones. En primer lugar, las infusiones de BLM en las vías respiratorias provocan una distribución desigual de las concentraciones del fármaco, lo que conduce a la fibrosis local de los pulmones. En segundo lugar, BLM es un agente quimioterapéutico que presenta riesgos para la salud de los investigadores. En tercer lugar, las investigaciones indican que el proceso fibrótico inducido por BLM puede ser autolimitado16.
En conclusión, establecimos con éxito un modelo de rata PH asociado a PF utilizando BLM. Este modelo animal exhibía características típicas de PF, incluyendo deterioro de la función pulmonar y elevación de la deposición de colágeno. Además, observamos cambios hemodinámicos representativos, como el aumento de las proporciones RVSP y RV/(LV+S), junto con la remodelación vascular y la disfunción cardíaca derecha en este modelo de rata inducido por BLM. Es importante destacar que el establecimiento de un modelo de rata PF-PH es valioso para comprender los mecanismos subyacentes a PF-PH y proporcionar nuevas direcciones terapéuticas.
Los autores no tienen información financiera relevante.
Este trabajo fue respaldado en parte por las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82370063, 82170069, 82120108001, 82241012), el Programa de Investigación y Desarrollo del Laboratorio Nacional de Guangzhou (GZNl2023A02013), el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2022YFE0131500), el Departamento de Ciencia y Tecnología de Guangdong (2024A1515011208, 2022A1515012052, 2024A1515013104, 202102020019, 202201020538, 202201010069, 2023A03J0334), el Proyecto Independiente del Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Respiratorias (SKlRD-Z-202513), la Fundación de Investigación Médica de Guangdong (A2023379), la Universidad Médica de Guangzhou y el Plan para mejorar la investigación científica en GMU y los Fondos de Investigación Abierta del Sexto Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou (Hospital Popular de Qingyuan) (202201-101).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bleomycin | MedChemExpress | HY-17565A | |
Coupling agent | HYNAUT | BX-CSRH | |
Formalin fixative | Biosharp) | BL401B | |
Hair removal cream | LUSEN | LS-B-TMG-50 | |
Hematoxylin eosin (HE) staining kit | Beyotime | C0189S | |
Isoflurane | RWD Life Science(China) | R510-22-10 | |
Masson Tri-color dyeing kit | Beyotime | C0189S | |
Normal saline | KERONG | SLYS-001 | |
syringe | Beyotime | FS701-50pcs |
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