具有可调纳米尺度尺寸和成分的锰铁氧体簇的稳定水悬浮液

我们报告了锰铁氧体簇（MFC）的一锅水热合成，可对材料尺寸和成分进行独立控制。磁分离允许快速纯化，而使用磺化聚合物的表面功能化可确保材料在生物相关介质中不聚集。由此产生的产品非常适合生物医学应用。

锰铁氧体簇（MFC）是数十至数百个初级纳米晶体的球形组件，其磁性在各种应用中都很有价值。在这里，我们描述了如何在水热工艺中形成这些材料，该过程允许独立控制产品簇尺寸（从30到120nm）和所得材料的锰含量。酒精反应介质中加入的水总量和锰与铁前驱体的比例等参数是实现多种类型的MFC纳米级产品的重要因素。快速纯化方法使用磁分离来回收材料，使磁性纳米材料的克数生产非常有效。我们克服了磁性纳米材料聚集的挑战，将高电荷的磺酸盐聚合物应用于这些纳米材料的表面，产生胶体稳定的MFC，即使在高盐度环境中也保持非聚集性。这些非聚集、均匀和可调的材料是生物医学和环境应用的优秀前瞻性材料。

与纯氧化铁相比，在适当的条件下，在氧化铁晶格中加入锰作为掺杂剂可以增加材料在高外加磁场下的磁化。因此，锰铁氧体（MnxFe3-xO4）纳米颗粒由于其高饱和磁化，对外部磁场的强烈响应和低细胞毒性而成为非常理想的磁性纳米材料^{1，2，3，4，}5。单域纳米晶体以及这些纳米晶体的簇（称为多域粒子）已在各种生物医学应用中进行了研究，包括药物递送，用于癌症治疗的磁热疗和磁共振成像（MRI）^6，7，8。例如，Hyeon小组在2017年使用单结构域锰铁氧体纳米颗粒作为Fenton催化剂来诱导癌症缺氧，并利用该材料的_T2contrast进行MRI跟踪⁹。令人惊讶的是，鉴于这些和其他对铁氧体材料的积极研究，与纯氧化铁（_Fe3O4）纳米材料相比，几乎没有体内演示，也没有报道在人类中的应用^9，10。

将铁氧体纳米材料的特征转化为临床时面临的一个巨大挑战是产生均匀的、非聚集的纳米级簇^{11、12、13、14}。虽然传统的单域纳米晶体合成方法已经发展良好，但这项工作中感兴趣的多域簇不容易以统一和受控的方式生产^15，16。此外，铁氧体组成通常是非化学计量的，并且不仅仅与前驱体的起始浓度相关，这可能进一步模糊这些材料的系统结构功能表征^{9，12，13，17}。在这里，我们通过展示一种合成方法来解决这些问题，该方法可以对锰铁氧体纳米材料的簇尺寸和组成进行独立控制。

这项工作也为克服铁氧体纳米材料的胶体稳定性差提供了一种手段^18，19，20。磁性纳米颗粒通常由于强烈的颗粒 - 颗粒吸引力而容易聚集;铁氧体受这个问题的影响更大，因为它们较大的净磁化放大了粒子聚集。在相关的生物介质中，这些材料产生足够大的聚集体，使材料迅速收集，从而限制了它们与动物或人的接触途径^20，21，22。Hilt等人在研究磁热加热和染料降解时发现了颗粒- 颗粒聚集的另一个后果²³。在颗粒浓度略高或暴露于场中的时间增加时，随着材料随着时间的推移而聚集并且活性颗粒表面积减小，材料的有效性降低。这些应用和其他应用将受益于簇表面，这些表面旨在提供空间位阻，排除粒子 - 粒子相互作用^24，25。

在这里，我们报告了一种合成方法，用于合成具有可控尺寸和成分的锰铁氧体簇（MFC）。这些多域颗粒由硬聚集的初级锰铁氧体纳米晶体的组装组成;初级纳米晶体的紧密结合增强了它们的磁性，并提供了50-300 nm的整体簇尺寸，与纳米医学的最佳尺寸很好地匹配。通过改变水和氯化锰前体的量，我们可以独立控制整体直径和成分。该方法利用简单有效的一锅水热反应，允许频繁的实验和材料优化。这些MFC可以很容易地纯化成浓缩的产品溶液，通过赋予胶体稳定性的磺化聚合物进一步修饰。它们的可调性、均匀性和溶液相稳定性都是纳米材料在生物医学和环境工程中的应用具有重要价值的特点。

1. 控制中间商联总直径和铁氧体组成的中间商联苯合成

1. 清洗并彻底干燥所有用于合成的玻璃器皿。合成中的水量会影响MFC的尺寸，因此确保玻璃器皿中没有残留水至关重要^16，26。
   1. 要清洗玻璃器皿，请用水和洗涤剂冲洗，并用烧瓶刷擦洗以清除碎屑。彻底冲洗以除去所有洗涤剂，然后用去离子水冲洗完毕。
   2. 要干燥玻璃器皿，请摇动玻璃器皿表面的水滴，然后放入60°C的烤箱中直至完全干燥。
   3. 用37%盐酸冲洗聚苯搪（PPL）反应器，以除去以前使用中的任何碎屑。为此，将反应器及其盖子放在一个大烧杯中，并充满盐酸，直到反应器完全淹没。让它静置30分钟，然后倒出盐酸。用水连续冲洗装有反应器的烧杯1-2分钟，然后将反应器放入烤箱中晾干。
2. 使用自动移液器将 20 mL 乙二醇转移到带有磁性搅拌棒的 50 mL 烧杯中。
3. 称出所需量的氯化铁（_FECl3·_6H2 O，固体）以达到1.3mM的最终浓度，并将其加入烧杯中。将烧杯放在搅拌盘上，以480 rpm的速度打开，开始连续搅拌烧杯。
   注意:由于这是水合物，因此必须快速测量和添加，以避免从环境空气中意外吸收水分。
4. 称取250mg聚丙烯酸（PAA，Mw〜6，000，粉末）并将其加入烧杯中。加入PAA后，溶液变得不透明，颜色略浅。
5. 称取1.2克尿素（CO（_NH2）₂，粉末），并将其添加到烧杯中。
6. 使用移液器，将0.7 mM氯化锰（_MnCl2·_6H2O aq，3.5 M，0.2 mL）加入烧杯中。
7. 最后，使用移液器将所需量（0.5 mL）的超纯水加入烧杯中。
8. 让溶液搅拌30分钟，注意颜色变化。它将呈现为半透明的深橙色。
9. 将反应混合物转移到聚苯搪（PPL）反应器中。请注意，在溶液搅拌后，一些固体可能积聚在烧杯的侧面。
   1. 使用磁铁（立方永久稀土磁铁，40 x 40 x 20 mm，以下称为所有分离和磁性收集程序的"磁铁"）将搅拌棒拖到烧杯壁周围，以确保积聚在侧面的任何固体分散到反应溶液中。
   2. 一旦溶液混合并准备就绪，将其转移到50 mL PPL衬里反应器中。
   3. 使用夹具和杠杆将反应器尽可能紧密地密封在不锈钢高压釜中。将反应器容器夹在稳定的表面上，并使用插入盖子的杆作为杠杆，推动反应器密封。请注意，密封的反应器不应能够用手打开。这一点至关重要，因为烘箱的高压环境要求在反应器上密封。
10. 将反应器放入烘箱中，在215°C下20小时。
11. 水热反应完成后，将反应器从烘箱中取出，使其冷却至室温。烤箱的压力将使反应器能够用手打开。请注意，此时，反应器中将含有分散在乙二醇中的MFC产物与其它杂质，例如未反应的聚合物，并且会是不透明的黑色溶液。产品将在以下步骤中被隔离。

2. 磁粉的磁选和纯化

1. 将200毫克钢丝球放入玻璃瓶中。用来自反应器的反应混合物中途填充玻璃小瓶。用丙酮填充小瓶的其余部分并摇匀。请注意，钢丝球增加了小瓶中的磁场强度，并有助于纳米团簇与溶液的磁性分离。
2. 将小瓶放在磁铁上以进行磁性收集。结果将是底部有沉淀物的半透明溶液。
   1. 倾倒上清液，而MFC通过在浇注时将磁铁固定在小瓶底部来磁性捕获钢丝球。乙二醇将在此步骤中大部分被除去。
   2. 开始用低丙酮与水的比例洗涤，并在随后的洗涤中增加该比例，直到纯净。这样做3-4次。
3. 从磁铁上取下小瓶并装满水。摇匀以溶解MFC。现在产品将完全分散在水中。
4. 重复前两个步骤几次，直到MFC的水溶液在摇动时不产生气泡。结果将是一个黑暗的，不透明的铁磁流体，它将对磁铁产生强烈的反应。
   注意:在用20mL乙二醇的典型合成中，将获得约80mg的MFC产物。

3. 多功能一体机的表面功能化，实现超高胶体稳定性

注意:硝基多巴胺和聚（AA-co-AMPS-co-PEG）的合成可以在我们之前的工作中找到¹⁶。共聚物是通过自由基聚合制成的。在10毫升N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中加入0.20克2，2′-偶氮二（2-甲基丙腈）（AIBN），0.25克丙烯酸（AA），0.75克2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸（AMPS）和1.00克聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯（PEG）。在70°C水浴中加热混合物1小时，然后将其转移到水中的透析袋（纤维素膜，3 kDa）。AA、AMPS 和 PEG 的重量比为 1:3:4。这些单体的聚合具有100%的转化率，通过冷冻干燥和称重证实。

1. 将10 mL纯化纳米颗粒（约100mg）与10mL饱和N-[2-（3，4-二羟基苯基）乙基]硝酰胺（硝基多巴胺）溶液（约1mg / mL）混合。等待5分钟。
2. 使用磁选清洗硝基多巴胺包被的MFC。倒出淡黄色的上清液。加水，用力摇晃。然后，使用磁铁倒出水以保留产品。重复这种洗涤几次，将深棕色的集合留在小瓶中。
   注意:准备浓度为20 mg / mL的水溶液，浓度为100 mg / mL的缓冲溶液和浓度为20 mg / mL的聚（AA-co-AMPS-co-PEG）聚合物溶液。
3. 混合1 mL EDC溶液，1 mL MES缓冲液和3 mL聚合物溶液。通过旋转混合物轻轻搅拌，静置约5分钟。当完全结合时，它应该是一个透明和无色的溶液。
4. 将此混合物添加到MFC集合中，并将小瓶放入冰浴中。将探头超声仪放入溶液中，然后将其打开（20 kHz时功率为250瓦）。
   1. 经过5分钟的超声处理后，在超声仪仍在运行时向小瓶中加入约5 mL超纯水。继续监测容器，确保没有产品溢出。将冰保持在冰水混合物中，因为由于超声处理的强度和热量，一些初始冰会融化。
   2. 让混合物再超声处理25分钟，总共30分钟。
5. 将小瓶放在磁铁顶部以分离MFC并倒出上清液。
6. 用去离子水清洗改良的MFC几次。
7. 用超纯水填充含有MFC的小瓶。用0.1μm聚醚砜膜过滤器将这种液体移入真空过滤系统中，以除去任何不可逆聚集的MFC。确保冲洗漏斗壁以尽量减少产品损失。
8. 真空过滤溶液。重复此过程2-3次。结果将是单分散MFC的纯化水溶液。
   注意:大约10%的产品将被不可逆地聚集，这种材料将保留在过滤器上，应丢弃。

水热处理后，反应混合物变成粘稠的黑色分散体，如图 1所示。纯化后的结果是高度浓缩的MFC溶液，其行为类似于铁磁流体。当放置在手持式磁铁（<0.5 T）附近时，小瓶中的液体在几秒钟内就会做出反应，形成宏观的黑色团块，当磁铁放置在不同的位置时，可以四处移动。

该合成产生的产物的尺寸和铁氧体组成取决于反应混合物中加入的水量和锰与铁前驱体的比例。 图2 说明了簇形态如何取决于水和前体浓度;它还详细说明了用于获得 表 1中列出的样品的反应条件。我们发现MFC直径受添加水量的影响，MFC组成取决于前驱体中铁和锰的比例。因此，可以独立控制这两个参数，以制作具有不同尺寸和锰含量的MFC库。

虽然这是一个非常简单的综合过程，但方法执行中的错误可能会导致产品失败。 图3 描绘了具有不规则MFC形态的样品。在 图3A中，如果水完全排除在反应环境中，则会产生奇形怪状的MFC。缺水阻碍了初级纳米晶体的动态组装，并导致纳米簇尺寸和非球形形状的分布非常广泛¹⁶。 图3B 所示的样品反应时间不足（6-12小时），因此没有足够的初级纳米晶体生长。这些较差的结果表明，对于实现一致和均匀的团簇，需要适量的反应物以及反应时间。

水热合成完成后，将铁氧体MFC分离并用磁分离纯化。在溶液下方放置一块磁铁，以迫使它们在容器底部收集。然后可以倾析合成过程中形成的杂质和非磁性副产物以及多余的溶剂，以产生纯净和单分散的^MFC27。 图 4 显示了在添加和不添加钢丝绒的情况下对 MFC 进行几乎完整的磁性收集所需的时间。在磁分离过程中放置在小瓶中的钢丝球增加了小瓶内磁场的梯度，从而实现了更快的分离²⁸。

与使用更传统的超速离心工艺纯化的MFC相比，使用磁选纯化的MFC显示出高度的均匀性。 图5 显示了使用磁分离（A和B）获得的MFC与使用超速离心（5，000g持续30分钟）（C和D）相比的尺寸分布。与超速离心相比，磁分离导致簇直径分布更窄，是MFC的首选纯化策略。

合成的MFC涂有聚丙烯酸酯（PAA），其提供带负电荷的表面和一定程度的颗粒间排斥，从而防止颗粒间聚集（图6A）。然而，通过与硝基多巴胺进行配体替代反应（图6B），我们可以用P（AA-co-AMPS-co-PEG）的共聚物涂层代替PAA涂层，这允许在更高离子强度的溶液中具有更高的稳定性。 图7显示了该表面功能化过程的示意图。分散在PBS缓冲液中的MFC的胶体稳定性在 图8中很明显。涂有PAA的合成MFC在30分钟内迅速聚集并从溶液中分离出来，在生物应用中几乎没有用处。相反，用聚磺酸盐涂层功能化的MFC在该溶液中保持良好分散超过2天，没有任何聚集迹象。这里描述的合成后表面改性为形成适合引入生物环境的MFC的均质溶液提供了一条途径。

图1:锰铁氧体纳米簇合成原理图。 将试剂、氯化铁（III）、氯化锰（II）、聚丙烯酸（PAA）、尿素、水和乙二醇在水热条件下结合，生成锰铁氧体纳米团簇。本品在纯水中形成稳定的胶体溶液，如中间所示。合成中的水添加量和前驱体中锰与铁的比例分别用于调整团簇大小和铁氧体组成。磁分离后，纳米团簇形成铁磁流体，如右图所示，表明它们对即使是很小的外加磁场也具有高度响应性。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2:锰铁氧体纳米团簇的透射电子显微镜（TEM）图像及其直径分布。 在图像A-D中，由于合成中加入的水量减少，簇直径（Dc）增加。A、B、C 和 D 的平均簇直径分别为 31、56、74 和 120 nm，组成为 _{Mn0.15Fe2.85O4}。在图像E-H中，铁氧体组成与前驱体的Mn/Fe比成比例地单调变化。尽管它们的组成不同，但实现了几乎相等的簇直径。我们的合成允许独立控制团簇直径和铁氧体组成，这两个特征对于纳米级铁氧体的磁性都很重要。请点击此处查看此图的放大版本。

表1:合成纳米团簇样品的反应条件 如图2所示。 其他合成参数为:20 mL乙二醇、250 mg PAA和1.2 g尿素。将反应混合物在200°C水热加热20小时。对于 A、B、C 和 D，降低含水量同时保持其他参数不变会导致直径较大的聚类。对于E、F、G和H， 增加_MnCl2与_FeCl3in的比值， 初始反应混合物中锰的比值增加， 团簇结构中锰的比例较高.同时改变水的E，F，G和H的量允许不同成分但接近等效直径的簇。

图3:失败和不完全反应的TEM图像。 在这些图像中观察到的小的，低对比度的特征是尚未发展成纳米簇的初级纳米晶体。 图3A 中的样品是在没有额外水的情况下制备的，而 图3B 中所示的材料反应时间不足，为四小时。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:纳米团簇磁分离的比较。 磁选纳米簇的比较，没有（A）和（B）在容器中添加钢丝球。钢丝绒增加了小瓶内磁场的梯度，以允许纳米团簇的更快磁分离。因此，可以在不牺牲样品质量的情况下有效地扩大纳米簇的生产规模。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 5:超速离心和磁选的比较。 超速离心（A，B）和磁选（C，D）的比较及其对纯化团簇均匀性的影响.A和C是纯化簇的TEM图像，B和D分别是A和C中簇的大小分布。y 轴表示计数的聚类数，对于每个样本，总共调查了 150 个聚类。 请点击此处查看此图的放大版本。

图6:表面改性步骤中使用的聚丙烯酸（PAA）（A）和硝基多巴胺（B）的结构。 合成中使用的初始PAA包衣在生物或酸性介质中并不理想，因为羧酸容易被质子化。硝基多巴胺用于取代PAA涂层，产生官能团以锚定磺化共聚物。 请点击此处查看此图的放大版本。

图7:簇表面改性工艺的示意图，（A）原始PAA涂层，（B）中间硝基多巴胺涂层和（C）最终P（AA-co-AMPS-co-PEG）涂层。在 （C） 中，蓝色、红色和绿色曲线分别表示 AA、AMPS 和 PEG 单位。簇的组成可以是_Fe3O4或MnxFe3-xO4。请点击此处查看此图的放大版本。

图8:聚磺酸盐纳米簇的表面功能化导致材料在许多不同的水性条件下胶体稳定。 具有两种不同表面涂层的簇，即合成的PAA涂层（A）和P（AA-co-AMPS-co-PEG）表面功能化（B）溶解在与生物环境相关的PBS缓冲溶液中，并随着时间的推移观察到它们的胶体稳定性。 请点击此处查看此图的放大版本。

这项工作证明了锰铁氧体纳米晶体的改性多元醇合成，这些纳米晶体聚集在一起形成均匀的纳米级聚集体²⁹。在该合成中，氯化铁（III）和氯化锰（II）进行强制水解反应和还原，形成_分子MnxFe3-xO4。这些铁氧体分子在反应器中的高温和高压下形成初级纳米晶体，最终组装成球形聚集体，这里称为磁铁矿铁氧体簇（MFC）。没有足够的反应时间或足够的水，聚集过程不能完全完成，导致颗粒不均匀，形成不良。相反，给定足够的时间和足够的水，金属氧化物结晶和组装过程完成并产生包含数十至数百个初级纳米晶体的均匀球形团簇。这些材料中的初级纳米晶体是硬聚集的，共享一些晶体界面，导致高初始敏感性，并且即使对手持式永磁体可用的小场也具有明显的磁响应²⁷。因此，这些材料在药物输送，磁热疗，磁共振成像和磁粒子成像方面具有巨大的应用潜力^30，31，32。

我们发现，添加到初始反应混合物中的水量控制着组装簇的直径。随着反应物中水分含量的增加，团簇的直径和聚集的初级纳米晶体的数量减小。最佳范围是0.8 M至5.0 M水，条件分别产生150 nm至30 nm的簇直径。水在这一过程中起着重要作用，因为必须确保金属前体的快速水解，初级微晶的更快聚集，从而更小的团簇¹⁶。由于合成对水非常敏感，在不同湿度的环境条件下处理的反应物可以从空气中吸收不同量的水。这可能会影响产品的后续尺寸和形态。虽然大多数研究实验室的湿度控制（例如，30%-60%RH）足以最大限度地减少此问题，但这是报告程序中系统误差的一个来源。通过改变锰与铁前体的比例，可以控制产品中的锰与铁的比例。这是令人惊讶的，因为在许多热液反应中，产物的掺杂水平通常不仅仅与起始材料的化学计量有关^4，6，^{8，12，13，17}。然而，对于这些条件，通过金属前体的比例可以很好地预测产品成分。总而言之，通过直接操作起始反应物混合物，可以独立控制团簇直径及其组成。

通常，从反应介质中纯化纳米颗粒是产生高质量材料中最耗时和最复杂的步骤。超速离心通常用于此目的，虽然这可有效从分子副产物中分离纳米颗粒，但它不适合去除不需要的固体产品。当应用于纳米材料的纯化时，超速离心产生具有可变尺寸和形状的相对多分散的颗粒。通过应用磁分离来提高最终产品的均匀性和纯度，利用这些材料的磁响应要有效得多。我们通过使用浸入溶液中的钢丝球和在样品容器外部施加稀土永磁体，在宏观小瓶内创建非常高的磁场梯度来加速磁分离。这种安排允许在30分钟内以高产量（约90%）回收均匀的样品。重要的是要将引入溶液的钢丝球量与预期的MFC簇直径相匹配。例如，平均直径为40 nm的MFC需要100至200mg的钢丝绒才能快速分离，而较大的材料可能需要更少甚至不需要钢丝球。众所周知，较小的磁性纳米颗粒由于其较小的磁性体积而对外加磁场的反应较差^15，17，26。因此，磁分离过程提供了一种提高这些材料均匀性的方法，因为该过程无法有效地保留较小的簇¹⁶。使用这种磁选方法不仅可以节省实验室时间，还可以使产品具有更大的直径均匀性。

虽然合成的MFC在纯水中是稳定的，但它们在pH值较低或离子强度较高的溶液中表现出较差的胶体稳定性。锰铁氧体具有较大的磁化密度，因此对于这些直径，团簇具有导致颗粒间吸引的磁偶极子。在材料形成过程中使用的天然聚丙烯酸酯涂层赋予颗粒表面负电荷，并有助于防止颗粒 - 颗粒聚集。然而，在较低的pH值下，羧基团被完全质子化，从而消除了维持均匀的MFC分散所需的静电斥力;或者，在较高离子强度的介质中，电荷斥力降低，导致更多的颗粒聚集。MFC的聚集产生宏观材料，这些材料不会均匀地分散在溶液中，这使得 在体内 或需要大而可用的纳米颗粒表面的应用中使用这些材料变得具有挑战性。出于这些原因，我们在反应中引入了第二种聚合物，以取代原来的PAA涂层。共聚物P（AA-co-AMPS-co-PEG）包括中性聚乙二醇（PEG），以提供生物相容性和一定程度的空间位阻。此外，聚磺酸盐组分（PAMPS）既具有比聚丙烯酸酯更大的电荷密度，又具有低得多的pKa的官能团，因此具有更大的工作pH范围（pKa~1.2）²⁴。用这些表面涂层修饰的锰铁氧体簇在酸性和生物介质中显示出显着提高的稳定性。但是，确保正确表面改性的过程很详细，必须仔细遵循以确保样品得到有效涂层。具体而言，该方法要求在用探针超声仪处理反应混合物时对其进行持续监测，以确保均匀，完全替换初始聚丙烯酸酯涂层。同样重要的是，使用适当尺寸的玻璃器皿，以最大限度地减少剧烈超声处理过程中的任何产品损失，并对超声处理混合物施加冰浴，以最大限度地减少探针超声处理引起的聚合物的热降解。

总之，该方法可以快速有效地生产具有可调直径和锰铁成分的锰铁氧体簇（MFC）。反应物含水量以及铁与锰的比例是定义材料产品特性的重要参数。利用手持式磁铁和钢丝球的简单磁分离技术提供了一种有效的方法，可以在合成后纯化产物，产生更均匀的簇。最后，将磺化PEG共聚物施加到材料上，以确保它们在各种不同的pH和离子强度介质中保持不聚集。与纯氧化铁（_Fe3O4）纳米材料相比，这些锰掺杂的氧化铁的磁响应性增加，使得开发用于应用外部场以操纵体内材料的装置更简单，更便宜，更容易。它们改进的表面涂层也很重要，因为磁性纳米颗粒在药物输送，水修复和高级成像系统中的应用都需要在各种生物和环境介质中非聚集和均匀的材料。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了布朗大学和先进能源联盟的慷慨支持。我们非常感谢张青波博士建立的氧化铁MFC合成方法。