定量自动放射法测定维沃脑蛋白合成区域速率

蛋白质合成是细胞的关键生物过程。在大脑中,它是自适应变化所必需的。测量完整大脑中蛋白质合成率需要仔细的方法学考虑。这里我们介绍了L-[1-14C]-亮细胞定量自射方法,用于测定体内脑蛋白合成的区域速率。

蛋白质合成是神经元功能发育和维护所必需的,并参与神经系统的适应性变化。此外,人们认为神经系统蛋白质合成障碍可能是某些发育障碍的核心表型。准确测量动物模型中脑蛋白合成率对于了解这些疾病非常重要。我们开发的方法被设计用于研究醒着、有行为的动物。它是一种定量的自动放射学方法,因此可以同时产生大脑所有区域的速率。该方法基于示踪氨基酸L-1-14 C+-亮氨酸的使用,以及L-亮氨酸在大脑中行为的动力学模型。我们选择L-1-14 C+-亮氨酸作为示踪剂,因为它不会导致外在标记的代谢产物。它要么被整合到蛋白质中,要么被快速代谢,产生14CO2,在大脑中大量未标记的CO2中稀释。 该方法和模型还允许从组织蛋白解基中提取的无标记亮氨酸对蛋白质合成的组织前体池的贡献。该方法具有空间分辨率,可确定细胞和神经层以及下丘脑和颅神经核的蛋白质合成率。为了获得可靠且可重复的定量数据,必须遵循程序细节。这里我们介绍了定量自放射学L-1-14 C+-亮氨酸法的详细程序,用于确定体内蛋白质合成的区域速率。

蛋白质合成是神经系统长期适应性变化的重要生物^过程。抑制蛋白质合成会阻止无脊椎动物和脊椎动物^的长期记忆储存2。蛋白质合成对于维持某些形式的长期强效 (LTP) 和长期抑郁症 (LTD) 3、发育过程中的神经元存活率⁴以及神经元及其一般维持的后期阶段至关重要突触连接⁵.大脑蛋白质合成率的测量可能是研究适应性变化以及与学习和记忆相关的神经发育障碍和紊乱的重要工具。

我们已经开发出一种量化清醒动物体内脑蛋白合成率的方法,它与其他估计脑组织外体或体外制剂速率的技术具有固有的优势。最重要的是适用于清醒动物大脑中完整大脑的测量。这是一个关键的考虑因素,因为它允许具有突触结构和功能的测量,而不必担心验尸后的效果。此外,我们采用的定量自动放射学方法实现了高度的空间定位。^虽然14C的能量是,我们不能本地化示踪剂在亚细胞或细胞水平,我们可以测量速率的细胞层和小大脑区域,如下丘脑核,大约25μm分辨率7。

用放射性追踪器进行体内测量的一个挑战是确保测量的放射性标签是在感兴趣的反应产物中,而不是未反应的标记前体或其他无关标记的代谢产物6。我们选择L-1-14 C+-亮氨酸作为示踪氨基酸,因为它要么被整合到蛋白质中,要么迅速代谢成14CO2,在大脑中未标记的CO2大池中稀释,因为高速率能量代谢⁸.此外,^任何14C未纳入蛋白质主要存在作为自由[14 C]-亮氨酸,在60分钟的实验期间,几乎完全从组织6清除。蛋白质然后固定到组织与形式素,然后用水冲洗,以去除任何免费的 [¹⁴C]-亮氨酸之前,自体。

另一个重要考虑因素是组织蛋白解中未标记氨基酸稀释前体氨基酸池特定活性的问题。我们已经表明,在成年大鼠和小鼠中,大脑中蛋白质合成的前体亮氨酸池中约有40%来自来自蛋白质^分解6的氨基酸。这必须包括在脑蛋白合成(rCPS)的区域速率的计算中,并且必须在可能改变这种关系的研究中得到确认。该方法的理论基础和假设已在其他地方详细介绍。本文着重论述了该方法应用的程序问题。

该方法已用于测定地松鼠9,绵羊10,河河猴11,大鼠12,13,14,15,16的rCPS^{,17,18,19,20,21、}一种小鼠模型的管状硬化复合22,小鼠模型脆弱的X综合征23,24,25,26,脆弱的X预突变^小鼠27,和苯丙酮尿的小鼠^模型28。在本手稿中,我们介绍了使用体内自放射学 L-1-14 C+-亮氨酸法测量rCPS 的程序。我们在醒着的控制鼠标的大脑区域中呈现rCPS。我们还证明,在体内对一种翻译抑制剂的抗声霉素的分管,可以消除大脑中的蛋白质合成。

注:所有动物程序均获得国家精神卫生动物护理和使用委员会的批准,并按照国家卫生研究院《动物护理和使用指南》进行。

图 1中提供了该协议的概述。

1. 分别在股骨静脉和动脉中植入导管,分别用于给导管和采集时导动脉血样。在给动剂前至少22小时完成手术。手术大约需要1小时才能完成。

1. 收集必要的材料:无菌手术器械(手术剪刀、微剪刀、钳子、三个手术皮肤钩)、非脱氧麻醉设备(非氧气蒸发器、活性气体清除剂、密封麻醉室、麻醉室鼻锥),无菌手术阶段,毛皮夹子,70%乙醇,贝塔丁,无菌纱布,手术胶带,商业手暖器,手术显微镜,无菌0.9%氯化钠(盐),无菌肝素100 USP单位/mL在0.9%氯化钠(肝素化)盐水),无菌5条20厘米的6-0可吸收缝合,无菌25厘米的PE-8和PE-10聚乙烯导管,一端切在45 o,无菌1cc注射器,无菌32表针,烧结设备,无菌15-20厘米空心不锈钢钢棒(内径2.5毫米,外径3毫米),局部麻醉剂(布比瓦卡因和利多卡因药膏),以及带有旋转附件设置的动物外壳(带按钮、旋转、旋转支架和臂的30厘米弹簧系绳,20 X 13 cm 透明圆柱形容器)。
2. 准备动物手术。
3. 确保按照您所在机构的要求使用适当的无菌和无菌技术。
   1. 称量动物。动物必须至少25克才能成功手术。
   2. 将动物放在密封的有机玻璃室内,并将腔室连接到异法兰麻醉装置。将男性的流速设置为2.5升/分钟,在O₂中为1.5%的雌性,为3.0升/分钟。大约 2 分钟后,确保鼠标因缺乏退出反射和脚趾捏合而适当镇静。
   3. 镇静后,将鼠标从腔室中取出,并将其置于一个易感位置,其面部位于麻醉鼻锥内。设置鼻锥以接收来自蒸发器的气体,并将气体返回气体清除器。拾荒者将在木炭过滤器中捕获除胶剂。
   4. 使用剪毛机在肩部刀片之间剃毛。确保正确消毒被刮过的区域,在贝他当和乙醇磨砂之间交替三次。
   5. 将鼠标翻转到保持鼻锥中的面部位置。将左腿向下带到手术阶段,并使用剪子从左内大腿到左上腹部的毛皮。确保正确消毒被刮过的区域,在贝他当和乙醇磨砂之间交替三次。
   6. 在鼠标下方滑动已激活的市售暖手器,用纱布包裹。将右腿下到手术阶段。
4. 将导管插入左股骨静脉。
   1. 在手术显微镜的帮助下,使用手术剪刀从左大腿上部向中线旋转1厘米切口,露出股动脉和静脉。
   2. 用手术皮肤钩缩回松弛的皮肤,以进一步暴露囊泡。
   3. 在暴露区域涂抹无菌 0.9% 氯化钠,以保持足够的水分。
   4. 使用钳子钝化解剖,在股动脉和静脉的一小部分周围分离结缔组织。小心地分离动脉和静脉 (图 2)。
   5. 使用钳子在切口最横向点将一股可吸收缝合线(绞合 A)在股骨静脉和动脉下穿线。将缝合线拉过一半,使两端均匀。
   6. 在较接近腹股沟的点处,使用钳子在股骨静脉下螺纹第二缝合线(斯特兰德 B)。轻轻打上一个半结,用来限制血液流动。
   7. 在斯特兰德 A 和斯特兰德 B 之间的某个点,使用钳子仅在股骨静脉下螺纹第三个缝合线(链 C)。轻轻地绑一个完整的结,将被用来限制血液流动。小心不要撕裂静脉。
   8. 轻轻拖拽第 B 股以限制血液流动。使用血位轻轻拉Strand B以保持受限的血流。
   9. 用微剪刀在股骨静脉的禁区内切一个小洞,并小心地将PE-8管的角端(以前用肝素盐水冲洗)朝向斯特兰德B。插入后,释放Strand B的张力,并引导导管进一步向上静脉。拧紧包含导管的静脉周围的绞线 B。
   10. 使用斯特兰德 C,在导管周围打一个附加结。确保这个结不会抓住股动脉。
   11. 轻轻拉回注射器筒,将管子部分注入血液,以确保导管已正确植入。
5. 按照相同的步骤,将PE-10导管插入左股动脉。
6. 完整的外科手术。
   1. 一旦股骨静脉和动脉导管都固定好,将Strand A绑在两个导管周围的结中。
   2. 切掉所有多余的缝合线,并去除皮肤钩。用肝素盐水冲洗动脉导管,以防止凝血。烧结两个导管的末端以创建密封件。
   3. 将鼠标放在易发位置,在颈部底部进行小切口,并将盐水涂在暴露区域。
   4. 将空心金属棒从颈部切口插入股骨切口。把导管穿过空心杆,从颈部切口中挖出来。拆下空心杆。下部植入导管可以防止小鼠损坏导管。
   5. 在伤口的两侧涂抹布普瓦卡因。用缝合线关闭股骨切口。在封闭、缝合的伤口上添加利多卡因膏。
   6. 通过30厘米柔性空心管(弹簧系绳)将导管蛇过,并在皮肤下缝合弹簧绳的纽扣。在伤口的两侧涂抹布普瓦卡因。缝合皮肤下的弹簧绳的按钮。在封闭、缝合的伤口上添加利多卡因膏。
   7. 在恢复期间,用旋转支架和手臂将鼠标移到一个透明圆柱形容器(20 厘米高,直径 13 厘米) 中。在容器下放置一个暖手器,以保持动物的温暖。
   8. 将弹簧系绳的顶部拧到旋转上,并将旋转固定到连接到圆柱形容器的旋转臂上。确保鼠标具有全范围的运动,并且可以访问导管。
   9. 将开槽盖放在动物外壳上,不会干扰旋转机构。有关完整设置,请参阅图3。
   10. 允许鼠标恢复。建议至少 22 小时。

2. 制备L-+1-14 C_亮氨酸溶液用于注射和16%(w/v)5-硫酸(SSA)二水合物溶液,用于脱蛋白血浆样品。在SSA溶液中,还包括0.04 mM诺列辛和1μCi/mL[H3]亮氨酸作为氨基酸分析和酸溶性血浆馏分示剂浓度的内部标准。将 SSA 储存在 4°C 下长达两个月。

1. 购买市售的L-1-14 C_亮氨酸(50-60 mCi/mmol),作为2%乙醇或0.1 N HCl溶液出售。 在温和的氮气流下吹干示踪剂的已知活性,并在无菌正常盐水溶液中重组浓度高达100μCi/mL。

3. 静脉注射L-+1-14 C_leucine,并收集动脉血样。

1. 收集必要的材料:18个1.5 mL微管,用于脱蛋白血浆样品(向每管中加入70mL的去离子水),17个250mL玻璃瓶插入件(15个用于收集动脉血样本的插入件和2个用于收集死区血液的插入件重新注入。为了限制额外和不必要的血液的收集,小而薄的玻璃瓶插入物具有锥形底部,允许上清血浆的可访问移液,2微毛细管(32 X 0.8mm,用于血球测量),1 肝素和氟化锂涂层微离心管(分别防止凝血和糖解),赫莫塔(用tygon管盖住尖端,使钳子不会损坏PE管),血糖监测仪,血压传感器,1 mL无菌注射器(用于盐水冲洗),以及市售的安乐死溶液(在去离子水中稀释1:1(小鼠)。
2. 在实验开始时确保动物处于正常的生理状态。
   1. 将动脉管从末端夹住约 2 厘米,并切断尖端,为血液流动创造开口。然后松开管并收集死空间血液(((c. 30 mL),以收集先前抽吸中残留的盐水和/或血液,并在单独的管中收集控制样本(约30 μL)、血球样本(约毛细管体积的一半)和葡萄糖样品(约 20 μL)。
   2. 用密封剂腻子和离心机在4500 x g下堵住一端1分钟,测量血球的体积与总血量之比。如果动物的造异于30%以下,不要继续研究。
   3. 使用市售的血糖监测仪测量一滴血液中的血糖水平。
   4. 离心控制样品在18,000 x g下2分钟分离等离子体。以下对血浆样品进行脱蛋白:在1.5 mL微管中加入5μL的等离子体至70μL的去离子水,加入16%SSA溶液和涡旋的25μL。在干冰上冷冻前,在冰上放置30分钟。
   5. 通过静脉线将死空间血液返回给动物,然后冲洗肝素盐水,以防止失血过多。
   6. 将动脉线连接到血压传感器,以测量平均动脉血压。
   7. 取样后,确保重新夹紧动脉线,用小体积(50 mL)肝化盐水冲洗管。
3. 静脉注射示踪剂,收集及时动脉血样。
   1. 使用 Y 连接器将一个注射器与示踪剂 (100μCi/kg) 和一个带 50 mL 无菌盐水的注射器连接,在注射示踪剂后冲洗静脉线。将 Y 连接器连接到静脉线。
   2. 通过同时启动停止监视和注射示踪剂来启动研究。注射后立即用盐水冲洗静脉线(如100mL)。
   3. 在实验的前2分钟内以同样方式连续采集血液样本1-7。收集第7个样本后,在每个剩余样本之前收集30μL死空间血液。样品8-14分别在3、5、10、15、30、45和60分钟采集。
   4. 采集后立即处理血液样本,如对照样本所述。如果出现延迟,将样品放在冰上。通过动脉导管小心地将死空间血液重新注入动脉,并与肝素盐水冲洗。
   5. 在实验过程中的某个点,通过加入25μL 16% SSA、0.04 mM诺列辛和1 mCi/mL =³H_leucine 到 75 μL 水、涡流和放置在冰上,处理三个内部标准。
   6. 在60分钟内收集第14个样本后,将大约0.2 mL的B-安乐死-D注射到静脉线中,使动物安乐死。记录死亡时间。
   7. 将动物从旋转支架上拧下,然后从动物外壳中取出。小心地取出大脑,放在铝箔上,并冻结在干冰上。不要用液氮冻结大脑,因为大脑可能会破裂。将大脑、样品和内部标准储存在-80°C,直到准备处理。处理后可在任何点执行。

4. 分析血浆样品中亮氨酸和L-+1-14 C_亮氨酸的浓度。

1. 在 2°C 下将冰、涡流和离心机 18,000 x g 上的样品和内部标准解冻 5 分钟。上清部分将包含免费标记和未标记的亮氨酸。
2. 将40μL的上清液转移到液体闪烁小瓶中,并加入闪烁鸡尾酒。通过液体闪烁计数和用于同时双标签(3 H 和¹⁴C)计数的淬火曲线,量化³H 和¹⁴C的每分钟分解 (DPM)。
3. 要量化血浆亮氨酸浓度,请使用具有钠阳离子交换柱的HPLC系统,并使用o-邻苯二甲醛和氟测量检测的柱后衍生物。
   1. 将 HPLC 设置为以下规格:330 nm 的荧光计激发和 465 nm 的排放。移动相由埃卢安钠、pH 7.40 和 eluant 钠 + 5% 磺烷、pH 3.15 组成。将缓冲液流速设置为0.400 mL/min,将导流仪表流速设置为0.300 mL/min。将柱温度设置为48°C,将反应器温度设置为45°C。
   2. 校准系统,其氨基酸浓度范围在30至500pmol/10mL之间。校准曲线是线性的。测试的 10 mL 注射样品的氨基酸浓度属于此校准曲线的范围。

5. 进行定量自成像。

1. 准备大脑部分20微米的厚度为自成像。在-20°C处通过低温器截断大脑。
2. 在明胶涂层的幻灯片上安装串行大脑部分。空气干燥。
3. 将幻灯片在五次变化中洗涤 10% 形式,每次更换 30 分钟,然后连续流水 1 小时。用箔松散地覆盖滑轨,以避免灰尘,并让干燥 24 小时。
4. 将幻灯片与一套¹⁴C_甲基丙烯酸酯标准一起排列在 X 射线胶片盒中(建议安装 20X25 厘米乳腺X光片的盒式磁带),这些标准以前根据已知¹⁴C 浓度的组织进行校准,作为描述²⁹.标准可以商业购买,但确保它们涵盖2-300 mCi/g的组织范围,并针对20μm组织厚度进行校准。在红色安全灯下,将一块乳腺成像胶片,乳液侧下,在部分的顶部。
5. 密封盒,放入黑色更换袋中,并存放在柜子里 40-45 天。
6. 根据制造商的指示开发薄膜。注意:不建议进行自动胶片开发,因为背景可能不均匀,可能会影响定量。

6. 分析图像。

注意:建议使用市售的图像分析程序,以及 CCD 摄像机和具有均匀照明的荧光灯盒。CCD相机可检测到发光膜中的相对光学密度。

1. 根据薄膜上校准标准集的 OD,构建光学密度 (OD) v. 组织¹⁴C 浓度的校准曲线。将这些数据(包括空白或背景)与多项式方程拟合。第二度或第三度多项式方程非常适合。
2. 要分析特定的大脑区域,请与大脑地图集进行比较,将感兴趣的区域 (ROI) 定位到六到八个部分。在所有部分记录 ROI 范围内像素的 OD,并根据校准曲线计算每个像素中的组织¹⁴C 浓度。计算 ROI 中的平均组织¹⁴C 浓度。

7. rCPS 的计算。通过以下公式计算每个 ROI 中的 rCPS:

其中 P*(T) 是 ROI 中¹⁴C 的加权平均组织浓度,C_p(t) 和 C⁼_p(t) 是当时未标记和标记的亮氨酸的动脉血浆浓度,t,T 是动物死亡的时间( 约60分钟),α是来自血浆的组织前体池中的亮氨酸部分。在一个单独的实验中进行α^的评估。* 已在 WT、Fmr1 敲除、Tsc ^+/-和 PKU小鼠6、22、25、28 中进行了评估。如果实验涉及可能影响蛋白质合成、降解或代谢率的遗传或药理学变化,则应在新的条件下进行评估。

这里展示了一个代表性的实验,演示了蛋白质合成抑制剂先前对rCPS的影响。正常盐水中的苯二恶客在开始rCPS测定前30分钟给一只成年C57/BL6雄性野生型小鼠皮下(100毫克/千克)施用。与车辆处理的对照动物相比,异种素治疗的效果表明,在异种霉素处理小鼠中,rCPS几乎无法检测到(图4)。这些数据表明,体内自放射学L-1-14 C+-亮氨酸法测量大脑中蛋白质合成率的验证。

我们在大脑的四个级别上提出了L-[1-14 C]-亮素自射量图,以演示该方法的分辨率(图5)。图中所示为嗅球中的细胞层(图5A和B)、海马(图5C)和小脑(图5G)。下丘脑核(图5D),庞(图5E和F)和脑干(图5H)也清楚地出现在自动放射图中。 我们还显示了典型对照动物前额皮层(5.88 nmol/g/min)和背海马(5.35 nmol/g/min)(图6B)中蛋白质合成的定量区域速率。

图 1:表示整个 rCPS 协议步骤的架构。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:暴露股动脉和股骨静脉的图像。股动脉平行地平行地位于股骨静脉上方。股骨静脉也比股动脉更红。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:rCPS实验推荐的动物外壳设置图像。它采用一个清晰的圆柱形动物外壳,旋转附属件连接到弹簧系绳上。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:与使用异种霉素(100毫克/千克,皮下)治疗的动物相比,汽车处理动物(A)的代表性图像在示踪剂(B)前30分钟。蛋白质合成率与图像中的黑暗程度成正比。Anisomycin 大大降低了蛋白质合成的测量速率,表明该方法的特异性。A 右上角的刻度条表示 1 mm,适用于两个图像。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:在嗅球(A、B)、下丘脑(C、D)、庞氏(E、F)、小脑(G)和脑干(G、H)水平上,从醒着的老鼠身上的数字化自动放射图。较暗的区域具有较高的 rCPS。面板 G 中的比例尺适用于面板 A、C、E 和 G。 右侧的自动放射线(B、D、F 和 H)是从左侧图像上指定的区域放大的图像,面板 H 中的刻度条适用于面板 B, D、 F 和 H. 缩写如下: FrA, 前额关联皮层;OB,嗅球;AO,前嗅核;Gl,球状层;EPl,外部有机形态层;BLA,巴索边杏仁核;py,金字塔状细胞层;dHi,背海马;DG,变性陀螺;MHb, 中联法本拉;Rt, 水底状细胞核;VMH,腹腔中下丘脑核;弧形,弧形核;EW,埃丁格-威斯特法尔核;R,红色核;PN,蓬丁核;ML,分子层;GL,粒度层;Pc,Purkinje细胞层;库,库尼特核;AP,区域后雷玛;10、背运动核的迷走;12、低光泽核。请点击此处查看此图的较大版本。

图6:从觉醒行为控制小鼠在前额皮质(A)和背海马(B)的水平进行数字化自动放射报。脑蛋白合成率根据右侧显示的色条在图像中进行颜色编码。A 左下角的刻度条表示 1 mm,适用于两个图像。请点击此处查看此图的较大版本。

提出了一种定量测定实验动物体内脑蛋白合成(rCPS)区域速率的方法。与现有方法的方法,这种方法具有相当大的优势:1.测量是在清醒的有行为动物中进行的,因此它们反映了大脑中正在进行的过程。2. 测量是通过定量自辐射法进行的,能够同时确定大脑所有区域和分区域的rCPS。3. 该方法的动力学模型考虑到从组织蛋白降解中产生的未标记氨基酸的回收可能性及其对蛋白质合成前体池的影响6。

此方法的主要限制是既耗时又苛刻。虽然使用更简单、更高的吞吐量方法很诱人,但必须承认获得的数据的局限性。

由于在完整小鼠中测量 rCPS 的复杂性,因此可能会遇到维持正常生理状态、收集足够的血液样本以及避免可能干扰的情况。静脉和动脉导管的手术植入具有挑战性。与任何外科手术一样,尤其是处理细腻的血管,动物有死亡的内在风险。对我们来说,这是罕见的(约1%)。在随后的22小时恢复期间,偶尔(约4%)动物会拔掉导管。在测量过程中,导管是专利和动物处于正常生理状态,这一点很重要。根据我们最近的经验,在大约2%的动物中不能采集动脉血液,大约1%的动物有低血球(<40%)或动脉血压低(<85毫米汞柱),表明手术和/或恢复期间失血。

在为自光成像准备大脑截面时,必须确保截面厚度为 20 μm,因为这是已校准的 14 C_甲基丙烯酸酯标准的截面厚度。小心确保良好的质量部分,即没有撕裂,褶皱或气泡,因为这些缺陷将干扰自动放射分析。我们用手而不是自动胶片处理器来开发自动放射膜,因为我们发现,在自动处理后,背景光学密度可能参差不齐,这可能会影响定量。

在rCPS的方程中,我们包括一个因素,lambda (+),即来自动脉血浆的亮氨酸的馏分,其余部分来自从组织蛋白^降解6中衍生的氨基酸的回收。我们在WT和Fmr1 KO(易碎X型)C57Bl/6J小鼠的单独实验中对α进行了评估,并表明其值为0.603。* 的值可能因物种、遗传背景或基因突变的存在而异。因此,如果为其他模型设计蛋白质合成实验,则需要先对α进行评估,然后才能获得精确的测量。

我们在神经发育障碍的基因小鼠模型方面的研究表明,这种方法揭示了这些模型中rCPS的变化,在某些情况下,对药理学治疗的反应22,23,25^,26.可以想象,rCPS测量也可能监测大脑在诸如阿尔茨海默氏病、帕金森病、脆弱的X震颤性失常综合征、创伤性脑损伤等条件下的退行性变化。这些模型,有可能跟踪早期退行性的变化,也可能对早期干预的反应。rCPS方法可与免疫性化学在平行部分一起使用,以进一步检查特定的大脑^变化25。总之,定量自放射L-1-14 C+-亮氨酸法是准确测定体内rCPS值的理想选择。与现有方法一起,它在准确性和对体内条件的适用性方面具有相当大的优势。

提交人没有利益冲突可披露。

作者感谢曾燕夏对小鼠的基因分型,汤姆·伯林的氨基酸和薄膜的加工,和梅琴进行一些rCPS实验。这项研究得到了NIMH的内学研究计划,ZIA MH00889的支持。RMS 还得到了自闭症讲博士后奖学金 8679 和 FRAXA 博士后奖学金的支持。