血脑屏障的高分辨率共聚焦成像: 成像、3D 重建和 Transcytosis 的量化

在这里, 我们提出了一个 microscopy-based 协议的高分辨率成像和三维重建的小鼠神经血管单位和血脑屏障使用脑漂浮部分。这种方法可用于血脑屏障内细胞器的可视化、分析和量化。

血脑屏障 (BBB) 是一种动态的多细胞界面, 调节分子在循环和大脑之间的传输。Transcytosis 横跨 BBB 调节激素, 代谢物, 和治疗性抗体的大脑实质的交付。在这里, 我们提出了一个协议, 结合免疫荧光的自由漂浮部分与激光扫描共聚焦显微镜和图像分析, 以可视化的细胞器内的细胞在血脑屏障。将此数据与3D 图像分析软件结合在一起, 可以对毛细血管体积和表面积的半自动分割和定量, 以及 BBB 内细胞器的数量和强度。用小鼠内源性免疫球蛋白 (IgG) 检测细胞内囊泡, 并在血脑屏障上进行量化。该协议可用于研究不同分子的脑血脑屏障 transcytosis 的机制, 即体内。

血脑屏障 (BBB) 是一种由星形胶质细胞、周、神经元和内皮干细胞形成的连续细胞屏障, 它将中枢神经系统 (CNS) 与血液循环¹分离。对血脑屏障转运的调节在维持脑内稳态方面起着至关重要的作用, 并由大脑内皮细胞 (bec) 的特殊特性介导。bec 之间存在紧密的胞间连接和低的基底率的 transcytosis 限制细胞和 transcellular 运输的血液传播分子, 分别为²。最近, transcytosis 通路在 bec 已经被利用, 以提高治疗大分子的交付给大脑^3,4。然而, transcytosis 跨 BBB 的机制尚未完全被描绘成^5,6。

广泛的工作已经做了体外破译细胞和分子机制, 调节细胞内传输横跨 bec^{7,8,9,10, 11}, 但此类系统无法重述神经血管单元 (NVU) 的复杂结构和生理学。另一方面, 研究在体内^12,13提供了详细的传输速率的量化信息, 但不提供深入了解的细胞内的运输机制。因此, 调查 NVU 的细胞和细胞内的成分在体内和ex 体内仍然是非常具有挑战性的¹⁴。只有有限数量的技术可以用来分析 NVU 细胞内的亚单位结构。大多数研究使用电子显微镜, 但这种技术是有限的复杂协议所需的适当组织准备和样品处理。因此, 我们建立了一个基于高分辨率共焦显微镜的方法, 这将促进脑标本的处理, 分析和量化 NVU 细胞内的亚单位。

在这里, 我们描述了一个协议, 利用小鼠大脑自由浮动的部分, 以执行定量成像的 BBB 和 NVU 在细胞和亚型水平。我们测试和验证了一些抗体的图像和重建的 NVU 在三维度。此外, 这个协议允许成像在最大的光学衍射有限的分辨率的细胞器内的脑毛细血管。结合图像分析, 本协议可用于研究不同实验条件下的大分子在血脑屏障内的细胞内转运, 如神经的小鼠疾病模型。

这项研究的道德批准由瑞士联邦食品安全和兽医局提供。所有动物实验都是严格遵守《瑞士联邦法令》关于动物保护和福利的, 以及根据《实验室动物护理国际评估和认可协会 (AAALAC) 规则》进行的.

1. 大脑自由浮动部分的生成

1. 以确保最佳的取样质量, 在灌注的当天为磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 制备2% 甲醛 (粉煤灰) 的新溶液.
   注意: 粉煤灰是适度毒性皮肤接触和可能致癌物。使用丁腈手套处理粉煤灰, 并准备在化学油烟罩的解决方案。
   1. 每只动物准备60毫升的煤灰溶液.
   2. 通过增加 180-200 和 #181 的 pH 值, 将粉煤灰转化为溶液; 每100毫升 PBS 的 5 M KOH 溶液, 并将溶液加热至60和 #176; C.
      注: 不应使用氢氧化钠, 因为它对组织保存后的固定有负面影响.
   3. 让溶液冷却到室温, 并使用 HCl 将 pH 值降低到 7.4. 使用滤纸筛选解决方案 (请参阅 材料表 ).
2. 通过 transcardial 灌注进行完整的鼠标固定, 如前所述 ¹⁵ 进行了一些修改。首先, 冲洗血液从血管使用20毫升 PBS 然后灌注与40毫升2% 粉煤灰.
3. 从头骨中删除大脑, 如前所述 ¹⁵ .
4. 浸泡一个新鲜的2% 粉煤灰灌流和 #160; 20 毫升2% 粉煤灰 7 h 在4和 #176; C post-fixation.
   注: 不建议增加粉煤灰中的孵育, 因为它能防止细胞内结构的检测.
5. 用 ice-cold PBS 广泛冲洗大脑.
6. 在琼脂糖中嵌入固定的大脑.
   1. 使用微波加热在 PBS 中制备3% 琼脂糖溶液。轻轻旋转的解决方案降温, 但避免凝固.
   2. 在塑料容器中浸泡到琼脂糖溶液中之前, 先将 PBS 周围的多余部分晾干。在琼脂糖内旋转大脑以消除气泡。让琼脂糖凝固, 冷却在冰上.
   3. 小心地从塑料容器中取出琼脂糖块, 用刀片将大脑周围的立方体切掉。使用氰胶水将大脑安装在 vibratome 标本架上 (请参见 材料表 ) (请参阅 材料表 )。在进行切片之前, 允许有足够的时间来固化胶水.
7. 将标本持有者的大脑转移到填充 PBS 的 vibratome 缓冲托盘中。使用 vibratome 100 和 #181; m 脑切片 (矢状或冠状)。收集先前充满 PBS 的6井盘中的脑部.
8. 在完成脑切片后, 小心地移除 pbs, 用1:1 的 pbs/甘油溶液代替.
9. 在-20 和 #176 中存储 PBS/甘油中的部分; C.

2。免疫荧光染色的细胞或器官的标记

1. 将大脑部分小心地转移到以前充满500和 #181 的24孔板的井中; 每井的 PBS。该节将保持在同一井, 直到程序结束.
2. 用500和 #181 冲洗该节两次; PBS 的 L 在温和的鼓动下5分钟.
3. 移除 PBS 并执行同时阻断和性的脑切片.
   1. 在 PBS 中准备一个0.3% 卫一 x 和10% 驴血清的阻断和性溶液.
      注: 驴血清可被山羊血清替代, 以匹配寄主物种的特定二次抗体使用.
   2. 在室温下以250和 #181 的方式孵育剖面; 在温和的搅动下, 性溶液为1小时.
4. 删除解决方案, 并在适当的稀释中添加含有5% 驴血清和主抗体的 PBS 解决方案 (如 、1:100 到1:1、000)。在4和 #176 夜间孵育; 在温和的鼓动下.
   注意: 有关使用此协议成功标记 NVU 的不同单元格类型的抗体列表, 请参见 材料表 。主要抗体的最佳的稀释必须经验主义地被确定。对于不同抗原的同时标记, 在同一溶液中稀释所有主抗体。所有的主要抗体必须在不同的物种中提出。为了提高抗体的穿透能力, 可以在4和 #176 中孵育72小时的样品; C.
5. 在室温下温和搅拌的情况下, 在 PBS 中移除抗体溶液和洗涤部分三次, 以10分钟。删除 pbs 并添加250和 #181; L pbs 溶液含有5% 驴血清和适当的 species-specific 荧光标记的二级抗体。在室温下孵育1小时在温和的鼓动下的部分.
   1. 有关与此协议一起使用的次要抗体列表, 请参见 材料表 。
6. 在室温下温和搅拌下, 在 PBS 中删除抗体溶液并清洗三次, 10 分钟.
7. 删除 PBS 并添加250和 #181; 4 和 #39; 6-diamidino-2-吲 (DAPI) 解决方案与 #160; 最后集中1和 #181; g/毫升。在室温下孵育10分钟, 在温和的鼓动下。删除 DAPI 解决方案和洗涤部分3次, 5 分钟与 PBS.
8. 在接合显微镜幻灯片 ( 例如, 组织键玻璃幻灯片) 上安装大脑部分。小心地在幻灯片上删除多余的 PBS。添加一滴安装介质 (见材料表) 在大脑部分的顶部, 并小心地覆盖它与0.17 毫米 (No. 1.5) 硼硅酸盐玻璃片.
   1. 将示例存储在4和 #176; C 在执行图像获取之前保护不受光照.

3。血脑屏障的高分辨率共聚焦成像

1. 使用合适的激光扫描共聚焦显微镜 (参见材料 表 ) 用激光线在405、488、561和 633 nm 进行图像采集, 以激发荧光在蓝色, 绿色, 橙色, 和红色区域的光频谱。对于图像采集, 使用一个数字孔径为1.4 的63X 油目标.
2. 在采集菜单中控制显微镜的软件, 设置图像采集参数。在 #8216 的下拉菜单中; 图像大小和 #8217; 选择一个 1024年 x 1024 像素的值。通过调整 #8216 的值, 将像素大小修改为介于200和 300 nm 之间的值; 缩放和 #8217; 菜单. #8221;
   注意: 对于细胞内结构的分析, 将像素大小减少到 75 nm。此图像大小设置极大地增加了捕获时间, 并可以减少到 512 x 512 像素, 通过成像较小的视场来减少捕获时间.
3. 在 #39; 获取速度和 #39; 下拉菜单中, 选择一个值 400 Hz, 即 每秒400行。在和 #39; 系统设置和 #39;菜单中, 选择 #39;P ixel 深度和 #39; 下拉菜单, 并将该值更改为12位.
4. 在显微镜软件中, 在 #39; 获取和 #39; 选项卡上, 切换用于顺序帧获取的选项。通过修改 #39;P inhole 和 #39; 菜单中的值, 将光学剖面厚度设置为每个通道的0.75 和 1 #181; m.
5. 在面板中进行荧光激发, 激活所需的激光以最佳激发样品中的荧光, 例如 488 nm 的激光线为绿色发射的荧光.
   注意: 使用荧光频谱查看器 (请参阅 材料表 ) 选择足够的激发激光器.
6. 在用于荧光检测的面板中, 移动滑块以选择将在每个通道中测量的波长, 例如, 在510和 550 nm 之间进行绿色发射的荧光.
   注意: 使用荧光频谱查看器 (请参阅 材料表 ) 选择适当的探测波长.
7. 添加一滴浸入式油, 其折射率1.52 在片的顶部与大脑部分, 以匹配的折射率的玻璃片和目标。将样品放在显微镜下, 打开 epifluorescent 灯, 用显微镜望远镜对样品进行可视化.
8. 使用显微镜支架上的按钮, 更改过滤轮以选择适合于可视化 DAPI 染色核的过滤器。使用粗糙的焦点, 使信号从 DAPI 染色的细胞核进入焦点.
9. 使用显微镜支架上的按钮, 更改滤镜以可视化血管标记 (例如胶原或 CD31) 的信号, 并将视场集中在单个毛细管段上.
10. 按下按钮以启动实时扫描模式。在扫描过程中, 调整每个通道的增益和激光强度, 以最大化图像的动态范围, 避免像素饱和.
    注意: 使用查找表来标记饱和像素以直观地评估饱和。为了避免信号饱和, 请使用预期具有最高荧光信号的样品来调整设置.
11. 将行的平均值设置为 2.
    注意: 当使用较高的采集速度时, 增加此值以降低噪音.
12. 建立开始和结束部分, 用于执行横跨毛细管的整个体积的光学 z 堆叠。使用0.45 和 #181 的步骤大小; m.
    注意: 如果图像将用于后续量化, 请为完整的数据集保留相同的获取设置.
13. 对于量化, 从至少三不同的小鼠中每节获得10到 20 z 堆栈进行统计比较.
    注: 在同一时段内获取完整的数据集, 以减少样品漂白和激光强度波动引起的变化.

作为从这里所描述的协议中获得的图像的典型例子, 小鼠脑切片上的抗体被识别出 NVU 的不同成分, 包括基底膜、星形胶质细胞、周和内皮细胞膜 (见用于特定抗体的材料表(图 1A、D、和E)。在这个分辨率下, 可以区分个别的星过程和与毛细血管直接接触的端脚。

为了强调该协议对检测细胞内结构的适用性, 从周边注射了人类抗 Tau mAb86 抗体¹⁶的动物脑切片染色了荧光标记的人抗体 (图 1B)。mAb86 是已知的具体目标神经元表达的病理形式头¹⁶。使用本文所述的协议, 在神经元内的单个水泡结构内检测到 mAb86 的衍射限制分辨率 (图 1B-C)。此外, 内源性小鼠 IgG 检测在内皮细胞内部结构, 但不是在周 (图 1D-E和图 2)。

获得高分辨率的脑血管的共焦 z 栈可以在 BBB 中进行三维的毛细血管和胞内泡的分割。图 2显示了呈现和分割带有胶原和小鼠 IgG 阳性胞内泡的毛细血管标记过程的示例。通过量化一个完整的分割图像的数据集, 例如通过测量每毛细管体积泡的数量, 可以研究在不同条件下的细胞内传输过程的变化。图 3b-C显示了 mIgG 泡数和荧光强度的差异, 对应于脑实质的 mIgG, 分别在血小板生长因子-b 中的细胞损耗鼠标模型, 如先前报告的¹⁷. 同样的方法最近也被用来分析不同大脑区域之间血脑屏障内转运的变化¹⁸。

图 1:神经血管组织多细胞类型和亚单位结构的标记.具有本协议获得的神经血管单元 (A和D) 和细胞内囊泡 (B) 或内皮细胞 (E) 中的有代表性的图像。在A (顶部) 中的最大强度投影图像显示了胶原 (绿色) 周围的毛细血管内的胶质细胞阳性星状突起 (红色) 的分布。箭头指向单个星进程。缩放条 = 20 µm。在这个分辨率下, 单个星形胶质细胞的过程和端脚是清晰可见的, 如在盒装区域 (底部) 的放大图像中所示。箭头指向星端脚。缩放条 = 10 µm。在B中的图像显示了在海马神经元内 mAb86 (绿色) 的外围注射抗体的积累。箭头指向单个 mAb86-positive 泡。缩放条 = 10 µm。C中的关系图显示单个泡的线轮廓强度。囊泡大小估计从全宽的一半最大的高斯拟合 (黑实线) 的强度曲线 (绿线和圆圈)。D中的图像显示了一个三维重建的内皮细胞 (绿色), 周围的细胞 (红色) 在基底叶片 (胶原, 灰色)。下面板显示了单个荧光通道。缩放条 = 10 µm。E中的图像显示 mIgG (红色) 在内皮细胞内囊泡中的定位 (左面板, CD31 绿色), 但不周 (右面板, CD13 绿色)。在所有图像中, DAPI 染色的细胞核显示为蓝色。缩放条 = 5 µm. 已从引用¹⁷中修改了面板 D 和 E。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 三维毛细血管和胞内囊泡在血脑屏障上的呈现.通过所述的协议, 获得了胶原阳性毛细血管 (绿色) 和小鼠 IgG 胞内泡 (红色) 的高分辨率共焦图像 (A)。左面板显示带有剖面的单个光学截面。箭头指向脑内皮细胞内的单个 mIgG 阳性囊泡。右侧的面板显示了使用图像处理软件的完整 z 堆栈的3D 重建 (请参见材料表)。毛细管体积 (B) 和单个囊泡 (C) 以三维度呈现, 并使用图像处理软件进行量化 (参见材料表)。在所有图像中, DAPI 染色的细胞核显示为蓝色。缩放栏 = 5 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 定量的 mIgG 细胞内定位在 BBB.具有代表性的图像显示 (A) 三维毛细血管重建 (标签为胶原、绿色) 和 C57BL/6 小鼠的 mIgG (红色) 分布, 在血小板生长因子-b 中, 细胞衰竭的小鼠以前在¹⁹中进行了描述。缩放条形图 = 10 µm。B中的图像显示了胶原掩码内的胞浆内部泡的分割。届B中的 e 图显示了每个毛细血管体积的 mIgG 泡数的量化和比较。每个点表示来自单个毛细管段的测量。实线显示平均值, 误差条表示数据的标准偏差。C中的图像在胶原掩码外显示 mIgG 荧光信号. 同样, 在C中的图显示了 C57BL/6 小鼠和血小板生长因子-b 细胞衰竭小鼠的脑实质中 mIgG 荧光强度的定量和比较。荧光强度单位是由所有 C57BL/6 小鼠的平均 mIgG 软组织强度正常化。此图已从引用¹⁷中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.

上面所述的协议描述了脑屏障的高分辨率显微镜的制备、荧光染色、图像采集和分析参数。该方法最近被用于研究抗体传递平台的定位³, 内源性 IgG 在 bbb¹⁷中的传输, 以及 bbb 在细胞损失时的异质性,¹⁸。可以修改协议中的不同步骤以适应实验的具体目标。首先, 使用厚 (100 µm) 的部分, 方便他们在免疫和安装过程中处理。它还允许3D 重建毛细管网络, 神经血管单位, 并为毛细管和 NVU 横断面的产生。然而, 抗体在组织切片中的渗透可能会有所不同, 一些抗体染色可以限制在表层的组织接近片。该协议可以通过增加洗涤剂浓度在性步骤和/或性步骤的长度, 以改善抗体渗透到组织。第二, 由于光散射以及折射率不匹配的光学像差, 图像质量可能会受到影响, 因为它在组织内部 (通常是20到30µm) 中的图像更深层。为了解决这个问题, 新的组织清除和活性抗体渗透的方法²⁰可以与该协议相结合, 以图像更大的组织体积。再次, 在图像采集后进行反褶积, 提高图像的轴向分辨率。本协议中使用的盲反卷积算法的选择是基于 (i) 它的易用性, 因为不需要点扩展函数的计算, (ii) 它对提高图像质量的鲁棒性²¹, 以及 (iii) mIgG 上缺少人工制品细胞内结构的实施。根据样本中可视化的胞内结构, 其他反褶积算法可能会导致较高的图像质量。下面的参考资料^21,22提供了关于图像反褶积的附加算法的优点和局限性的广泛讨论。最后, 利用图像分析软件包允许在三维度中对毛细血管和细胞内结构进行分割。显然, 图像分析不限于协议中描述的软件, 而替代包 (例如, 参考²³中讨论的软件包) 可以用于分割图像。通过对图像分割精度的评估, 验证了不同软件程序对脑屏障内细胞结构分析的适用性。

由于这种方法是基于固定样本, 它不提供直接信息的动态 transcytosis 横跨 BBB。然而, 它可以与时效实验相结合, 例如, 通过静脉注射的兴趣分子和测量其在注射后不同时间点 bec 内的积累, 重建的动力学细胞内转运这种方法的优点是, 它允许对深部大脑区域进行分析, 如¹⁸所示, 活体实时成像方法目前无法访问它们。在该协议的关键步骤是仔细监测组织固定。固定与4% 粉煤灰显著降低细胞器的免疫原性和内源性或外围管理免疫球蛋白¹⁷ (图 1B)。该协议的一个限制是它的要求, 高质量的抗体 (即, 低非特异性染色, 低交叉) 适合免疫荧光。如果有这种试剂, 该方法可用于研究任何感兴趣的蛋白质的细胞内定位。例如, 该协议用于识别脑血管内皮细胞中的溶酶体¹⁷。还应该指出, 由于该协议是基于共焦显微镜, 横向分辨率受到衍射的限制, 无法解析小于大约175到 250 nm 的结构 (图 2)。

以前的研究通过共聚焦显微镜对神经血管单元的细胞组成进行了详细的分析^25,26。然而, 研究 BBB 内的细胞内转运主要依赖于透射电子显微镜的使用^19,27,28。虽然这种方法提供了最高的横向分辨率的细胞内结构, 电子显微镜仍然是一个具有挑战性的技术, 低吞吐量。此外, 可以被 EM 可视化的不同分子靶数是非常有限的。该协议提供了一种可访问的替代方法来调查 BBB 的细胞内转运。完整的程序, 从大脑收集到图像分析, 可以在5天到6日进行。如果有合适的抗体, 免疫荧光可以同时检测多个细胞类型/分子在同一样本。此外, 该协议还可以与超分辨率显微技术相结合, 以克服空间分辨率²⁹中的局限性。总的来说, 上述的协议, 使量化的变化, 在细胞内定位的蛋白质利益的神经血管单位。它适用于不同的遗传或药理干扰将允许调查 BBB在体内的细胞结构和传输功能。

作者受雇于罗氏。

车的工作得到了罗氏博士后奖学金 (2014-2017) 的支持。