鼠屈肌腱损伤修复手术

在手屈肌腱通常受伤，导致受损的手部功能。然而，疤痕组织愈合反应不能很好地表征。屈肌腱愈合的小鼠模型在这里展示。该模型可以增强愈合过程的全面了解和评估治疗方法，以改善愈合。

肌腱连接骨骼肌肉和骨骼，便利几乎整个身体的运动。在手，屈肌腱（FTS）使手指和一般手功能的屈曲。受伤的罚球是常见的，满意的治疗往往是受损由于过度的疤痕组织和肌腱与周围组织粘连之间。然而，知之甚少FT修复的分子和细胞成分。为此目的，该概括在人类愈合的许多方面，包括范围受损的运动和减小的机械性能的FT修复的鼠类模型，已开发和如前所述。这里这种手术过程的深入示范设置，涉及横断和在小鼠的后爪的趾长屈肌（FDL）腱的后续修复。这种技术可以用来进行不同类型的细胞的谱系分析，评估基因增益或功能失的影响，并以测试艾菲在愈合过程中的药理学干预cacy。不过，也有这种模型的两个主要限制:i）如鼠后爪，其中，发生在横断和修理的中间部分的FDL肌腱，不是由滑膜鞘包围。因此，该模型没有考虑护套的给瘢痕形成过程中的潜在贡献。 ⅱ）为了保护修复部位的完整性，对FT被释放在腱交界处，减少腱的机械力，可能有助于瘢痕形成增加。从期间流式细胞分析愈合过程中的FT的肉芽组织足够细胞分离已证明具有挑战性;细胞学离心浓缩这些细胞是用另一种方法，并且允许进行一代细胞制剂的可以在其上进行免疫荧光标记。用这种方法，FT愈合期间的细胞或感兴趣的蛋白质的定量成为可能。

在音乐会的手工作与前臂的屈肌和数字鞘屈肌腱启用的位弯曲和手的抓握功能​​。屈肌腱沿手的掌面运行;这种相对位置表浅创伤手时常常导致伤及肌腱。肌腱愈合通过瘢痕组织反应，而不是正常的肌腱组织¹再生。虽然这种疤痕组织提供连续性肌腱，功能显着相对健康的肌腱下降。肌腱瘢痕组织复合材料的特点是受损的机械性能^1，使修复后的肌腱更容易破裂。此外，疤痕组织缺乏天然腱胶原纤维结构的组织，从而增加在肌腱尺寸和体积。由于肌腱鞘单元的解剖限制，即使是适度增加肌腱的大小可以大大的红UCE肌腱的滑翔功能，因此，运动和手功能的数字范围。

在此之前的1960年的伤及屈肌腱，特别是那些在手的II区，没有定期修理由于在愈合严重并发症，与这些维修²产生的。手的这个区域被称为"无人区^"3。然而，在外科技术，缝合模式和理疗康复协议的改善大大提高了屈肌腱修复²的结果。尽管有这些进展，修理的高达40％造成足够的粘合形成阻碍手功能^4。因此，需要一种生物的方法，以改善愈合。遗憾的是，很知之甚少在细胞和分子水平上的腱愈合过程。因此，我们的目标是开发可用于提高基本相互理解鼠模型克屈肌腱愈合和瘢痕形成反应的细胞和分子成分，以识别新的治疗目标，以提高愈合的手段。

更大的动物模型已经在促进屈肌腱愈合过程的认识工具。犬和兔的研究已经证明既屈肌腱^5,6的内在和外在的愈合能力，早期控制被动运动的相对粘连形成最小化的固定化⁷的重要性，以及不同的缝合图形的对愈合过程⁸的影响^，9。此外，犬模型已在测试平移组织工程方法来改善愈合¹⁰有用。但是，也有在利用鼠相对于大型动物模型的模型，其中包括的相对成本，鼠特异性试剂的可用性几个重要的优点，以及便于产生全球KNOC的K-切口或组织特异性缺失/过表达构建体。此外，人类和老鼠之间的功能类似相对于肌腱¹¹表明在开发的小鼠模型的潜在效用。

屈肌腱切断术和修复模拟临床愈合的许多方面，包括丰富的疤痕组织和受损的力学性能形成的小鼠模型的建立。这里描述的模型不是临床实践的真实概括由于在肌腱交界处FDL的横断为了保护维修站点。此外，该模型没有考虑滑膜鞘细胞对愈合响应的贡献，因为没有滑膜鞘覆盖，其中修复发生肌腱的中间部分。尽管有这些限制，这种模式有运动限制性粘连发生范围，这还没有的优点在小鼠模型更CLOS待证实伊利近似临床情况。该模型已被用于评估敲除小鼠模型^12,13，并以测试不同的药理学方法来改善愈合^14-17。这种模式的组织学分析，采用免疫组化和原位杂交，可以愈合期间提供关键基因和蛋白质的本地化的重要见解。然而，组织学仅提供一剖空间分析和不允许在整个组织定量。流式细胞仪代表更加定量的方法，但只是细胞的数量非常有限可在小鼠模型中的愈合腱组织中分离，并且这个数字期间固定，透化和洗涤步骤进一步降低。采取这一到帐户，流式细胞术成为不可行的方法由于是将需要的动物的数量。另一种方法是需要保留的大多数这种小细胞群，以便以进一步表征愈合环境。用于实现此目的的方法，在这里显示的，涉及经由细胞学离心分离的细胞的浓度到载玻片，随后通过免疫细胞化学。在本研究的EdU（5-乙炔基-2'脱氧尿苷，胸苷类似物）掺入和随后的标记被用来确定在愈合部位细胞的相对增殖状态。这种方法可以应用到测试对细胞增殖，基因敲除或过表达的药物治疗的功效，或确定和量化不同的细胞群。

大学委员会的动物研究在罗切斯特大学批准的所有动物实验。十-12周龄雌性C57BL /使用了6J小鼠。

1.屈肌腱手术动物的制备（约15分钟）

1. 高压灭菌手术器械消毒，戴整个无菌手套，并保持无菌操作领域。
2. 麻醉通过腹膜内注射（IP）用氯胺酮对应于体重的体积（80毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）鼠标。通过没有脚趾捏反射确认镇静深度。
3. 通过皮下注射施用先发制人镇痛（丁丙诺啡，0.05-0.1毫克/千克）。应用眼药膏，以防止眼睛干燥。
4. 通过裁剪对整个后肢皮毛准备手术部位。通过依次用聚维酮碘，接着用70％乙醇洗涤用聚维酮碘消毒皮肤，并再次。

2。鼠屈肌腱损伤修复手术（约1​​0分钟）

1. 找到趾长屈肌（FDL）肌腱，小腿内侧表面方面可见。使用手术刀，使一个小0.5-1厘米的切口在与微型剪刀将皮肤暴露肌腱。
2. 使用镊子的FDL肌腱与周围组织分离并跟踪它的肌腱交界处。切筋在该路口与弹簧剪刀将其释放，注意避免胫后动脉。
3. 关闭用5-0尼龙缝合皮肤。
   注意事项:应使用立体显微镜来进行FDL横断和修理（步骤2.4）。
4. 使在使用弹簧微型剪刀的后爪的后外侧面3毫米切口。轻轻缩回周围的软组织和肌肉用钳子，确保最大限度地减少组织损伤，并确定FDL肌腱。
   1. 轻轻抬起FDL肌腱和使用MI完全横切它CRO剪刀。缝合FDL的两端肌腱一起用8-0缝线修改凯斯勒模式，通过用生理盐水润湿定期它避免了肌腱的干燥。
   2. 更换软组织和肌肉在肌腱，然后关闭用5-0尼龙缝合切口。
5. 放置在37℃的滑动温暖组小鼠中，以维持体温，直到从麻醉中恢复。
6. 监测小鼠手术后的损伤或感染的迹象，包括增加发声和皱皮。注射丁丙诺啡（50微升/鼠标）镇痛每隔12小时，直到小鼠不再显示疼痛或痛苦的迹象。
7. 让小鼠愈合继续下一步骤之前期10天，手术后的。
   注:细胞可以在任何时间点手术后收获。这里，10天被选择为在此时给定的组织的相对高的细胞构成这些代表性实验。

3. Labeli骑自行车细胞纳克（约10分钟）

1. 制备的EdU（5-乙炔基-2'脱氧尿苷）溶液（10毫克/毫升在无菌磷酸盐缓冲盐水[PBS] + 1％二甲亚砜[DMSO]，以增加溶解度）。
2. 通过腹腔注射注射用100μl的EdU（50毫克/公斤）小鼠处死前24小时。

4.收集细胞细胞学离心（2.5小时，约30分钟的手工操作时间）

1. 制备3毫克/毫升胶原酶我于PBS中。
2. 安乐死通过二氧化碳窒息小鼠在不超过3升/分钟的流速，以及执行颈椎脱位作为次要措施。
3. 使用上述步骤2.4定位修复肌腱，并通过削减约2毫米的受伤部位用微型剪刀的两边隔离肌腱组织。
   1. 与在培养皿用1ml的3毫克/毫升胶原酶手术刀切碎组织，然后通过18G的针头几次传混合物，打破了组织。收集混合物到1.5毫升离心管中。
   2. 消化腱组织进行1小时，在37℃振荡。
   3. 自旋组织向下（300×g离心5分钟），吸胶原酶，然后通过上下吹打数次重悬在PBS中500μl的3％牛血清白蛋白（BSA）的细胞/组织。
   4. 通过一个70微米的细胞滤网过滤细胞悬浮液以除去碎片和大块肌腱，并在37℃培养箱中备用​​。
   5. 肌腱组织放入另外150毫升离心管中，并用1 ml胶原酶溶液刷新，上下吹打混匀。
   6. 孵育组织另一小时，在37℃振荡。
   7. 降速消化肌腱组织（300×g离心5分钟），然后在PBS中500μl的3％BSA中通过上下吹打数次重悬。
   8. 通过一个70微米的细胞滤网过滤细胞悬液，用悬挂在4.3.3中分离结合起来，再算上用血球细胞。
   9. 用在PBS中的3％BSA洗涤细胞一次，然后重悬到3-6×10 ^百分之四微升。
4. 附加细胞学漏斗至带正电的滑动和锁定到滑动载体。插入整个装置成细胞学离心机和100μl的细胞悬浮液添加到该漏斗中。离心机在300×g离心5分钟以分散到幻灯片的细胞。

5.免疫细胞化学检测埃杜（2小时，〜45分钟的手工操作时间）

注意:应在黑暗中进行所有的温育步骤，限制荧光团的光漂白。

1. 圈单元与疏水性屏障笔，以减少所需要的以下步骤溶液中，然后立即固定用在PBS中15分钟150μl的3％多聚甲醛在室温（RT）。
   1. 为5分钟，在PBS中的150微升3％BSA洗涤两次。
   2. 通透细胞用0.5％Triton-X的PBS 20分钟在RT 100。
   3. 重复洗涤步骤为5.1.1。
2. 准备的EdU反应cocktAIL按试剂盒说明书不超过30分钟后使用。
   1. 加入150微升鸡尾酒每一张幻灯片，在室温孵育30分钟。
   2. 重复洗涤步骤为5.1.1。
3. 2000在RT PBS 30分钟:用150微升核染剂Hoechst33342稀释孵育。
   1. 5分钟用150微升1×PBS中洗两次。
4. 加入1-2滴防褪色的安装介质细胞，再缓慢降低盖玻片防止泡沫。
   1. 允许安装介质的RT的黑暗治愈过夜。
   2. 使用透明指甲油密封盖玻片的幻灯片。
5. 使用配备有能够检测DAPI（Hoeschst33342）激发/发射滤​​光片的荧光显微镜在40X放大率图像的幻灯片，和德克萨斯红（的Alexa Fluor 594）。

在趾长屈肌（FDL）肌肉，位于小腿，行为经屈肌腱弯曲鼠标后爪的数字（蓝色轮廓图1A和图2A组织学显示），它从肌腱近端运行结并在远端指骨终止。在这个模型中屈肌腱愈合，所述FDL腱中的后爪的数字（红色箭头， 图1A）横切，并在脚中间修复，近端分叉。以防止修复，这将排除实验分析的破裂，肌腱（和相邻肌肉）被切断，或释放，在腱结（在图1B的黄色箭头， 图1C所示的释放）。虽然此步骤不是代表临床情况的，关键是通过在损伤部位减小应变，以保护维修。 图2D是一个破裂的屈肌腱修复的组织学例子相比，在图2C所示的成功修复。在后者中，肉芽组织显示大大增加的细胞构成相比未受伤的肌腱（ 图2B）作为和该细胞群然后可以通过细胞学离心到滑动随后通过免疫细胞化学进一步分析。 图3概述了用于评价的实验步骤从通过的EdU掺入愈合筋10天修复后到新合成的DNA中收集的细胞的增殖状态。因此的EdU标记仅显示那些在以下在活小鼠中的EdU脉冲的24小时的时间内即积极地增殖，如在图4中所见的细胞。增殖的愈合肌腱的肉芽组织的定量评估然后可以通过点计数来确定的整个细胞制剂。以这种方式，prolife的基线配给可以在每个时间点确定，并由于遗传或药理学干预的任何变化可以被评估。

图1 :. 鼠后肢解剖及屈指肌腱长肌腱的鉴定。在趾长屈肌（FDL）弯曲在小鼠后爪数字和沿后爪掌面运行（FDL轮廓为蓝色）的地方分叉成数字（红色箭头）（图1A）。近端的FDL肌腱通过跗管（黑色箭头）运行，到小腿，在肌腱交界处（黄色箭头）（图1B）结束。在腱交界处，以防止断裂肌腱的释放图1C所示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2: 取消受伤，正常愈合和破裂屈肌腱修复的代表性组织学图像中的鼠后爪的FDL腱的解剖学示于图2A。比例尺条为1毫米。在图2B-D中，肌腱在8X放大到未损伤肌腱组织（图2B）相比较，以一个完整的和破裂的修理（图分别2C＆2D）。整后爪样品固定在中性缓冲的福尔马林，石蜡包埋，切成3微米的部分，并如前所述¹³爱茜蓝/苏木/橙G染色。本机肌腱在蓝色轮廓，肌腱/肉芽组织复合材料在绿色标示，和黑色的箭头表示缝线。刻度条表示200μm左右。 P租赁点击此处查看该图的放大版本。

图3: 实验过程来执行的EdU点击它的化学细胞制剂第10天，手术后愈合FDL肌腱从小鼠后爪解剖。筋切碎，然后消化胶原酶两小时，我以解离细胞。将细胞悬浮液应变以除去碎片，并〜6×10 ^4个细胞纺成的单层上用细胞学离心机正电的载玻片。将细胞与疏水屏障笔进行盘旋，然后用多聚甲醛立即固定。用Triton X-100透化后，将细胞用的EdU检测鸡尾酒治疗，和一点击化学反应结合的Alexa Fluor 594结合的EdU。的Hoechst 33342用作核染色剂，将细胞WER Ë在10-40X用荧光显微镜进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4: 自行车的EdU标记细胞的免疫细胞化学分析期间屈肌腱愈合愈合FDL筋从小鼠的后爪10天手术后收获并用胶原酶以获得细胞悬液消化。使用离心这些细胞分散成幻灯片上的单层，其次是免疫细胞图像的EdU结合。图4A和图4B是以下免疫细胞化学分析细胞分别在10倍和40倍拍摄的图像。核染色的Hoechst 33342是蓝色的，和已纳入的EdU细胞点缀着红色。刻度条表示50微米。HREF ="htt​​ps://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

为完整横断和屈指长肌腱修复的鼠类模型中的外科手术过程，提出了这项研究。除了聚光用细胞学离心机小细胞群体的一种新颖的应用表明，允许屈肌腱愈合期间蜂窝环境的定量免疫细胞化学分析。屈肌腱修复的此模型表明可再现愈合反应，这可以被用来评估使用基因敲除模型或在治疗过程中的变化与药理干预。手术后，炎性反应开始24小时，在此期间，细胞被招募到损伤部位和纤维组织的愈伤组织开始形成内。增殖性阶段如下4点钟左右的一天，包括大大增加细胞数，并在维修现场混乱的细胞外基质的沉积丰富，导致粘连形成14-21天之间。组织重塑孔蒂nues至35天，此时连续性和屈肌腱组织被恢复，并且细胞结构被减少^18。

目前，除了这里介绍一个屈肌腱修复的几个小鼠模型。 Tsubone。等，已经描述了屈肌腱愈合¹⁹的体外模型。虽然这种模式可以随时间评估基因表达的变化，它不能考虑外在细胞或发生在体内的炎性/细胞因子环境的变化的募集。 在体内 ，局部横断的两个模型已使用或者切口或切除已开发缺陷^20,21。最近，王等人 ，其特征屈肌腱损伤的II区模型小鼠模型^22。这是一个重要的发展，因为它允许定义滑膜鞘来源细胞的愈合过程的贡献。然而，没有量化的在滑翔功能的改变一直在用这个模型来描述。每个模型都有自己的优点和必须考虑的，包括技术自如，临床相关性和解剖学的限制。此处描述的模型的一个主要限制是，愈合腱可先于评价破裂，使得它不能用于进一步的分析。收获足够的细胞是在这些情况下作出不可行，任何组织化学分析是不可行的，因为破裂腱不遵循上述标准愈合过程。因此释放所述FDL肌腱近侧上愈合肌腱减小应变为预防，尽管它不是临床相关的关键步骤。在进行手术单方面也降低破裂的速度。另一个限制是不能跟踪围腱鞘细胞的贡献，滑膜鞘不包围即在这个模型受伤FDL肌腱的段。

The authors declare that they have no competing financial interests

这项工作是部分由美国社会的试点手奖和美国国立卫生研究院/ NIAMS 1K01AR068386-01（到AEL）和NIAMS / NIH P30AR061307外科支持。