قد تساعد الطريقة المختبرية الموضوعية المعروضة هنا في دراسة تفاعل فرط الحساسية التلامسية في الفئران ، والذي يحاكي التهاب الجلد التماسي التحسسي لدى البشر. يمكن قياس تفاعل فرط الحساسية الملامس ليس فقط عن طريق وذمة الأذن ، ولكن أيضا عن طريق الاختبارات المعملية المختلفة التي تسمح بدراسة الآليات الخلوية المشاركة في هذا التفاعل. يمكن لنموذج فرط الحساسية الأكثر ملامسة اختبار العوامل المختلفة والبيئية والمواد الجديدة لإظهار ما إذا كانت العوامل المختبرة تعدل الاستجابات المناعية المعتمدة على الخلايا التائية ، والتي يمكن استخدامها لتنفيذ علاجات جديدة.
ابدأ بحلق جلد الفأر بشفرة حلاقة ووضع علامات على المخلب. قبل ست ساعات من تحريض فرط الحساسية للتلامس ، أو CHS ، ضع صابونا رماديا بالماء واحلق مساحة 2 سم مربع على صدر وبطن الماوس. في نفس اليوم ، قم بتوعية الفئران عن طريق تطبيق 150 ميكرولتر من 5٪ hapten الطازجة على المكان المحلوق مسبقا.
في ماوس التحكم ، قم بتطبيق السيارة فقط. جفف بقعة hapten لمدة 30 ثانية قبل إعادة الحيوان إلى القفص. في اليوم الرابع ، قم بقياس سمك أذن فأر مخدر باستخدام ميكرومتر عند ساعة الصفر بواسطة مراقب غير مدرك للمجموعات التجريبية.
بعد ذلك ، ضع 10 ميكرولتر من 04٪ hapten المحضرة حديثا على جانبي الأذنين في مجموعات الاختبار والتحكم واتركها تجف لمدة 30 ثانية. في اليوم الخامس ، بعد 24 ساعة من تطبيق 0.4٪ hapten السابق ، كرر قياس سمك الأذن للقياس على مدار 24 ساعة. بعد 24 ساعة من قياس سمك الأذن ، عندما لا يزال الفأر في التخدير العميق ، قم بقطع الأذنين بالقرب من الجمجمة قدر الإمكان باستخدام المقص.
في الجانب البعيد من الأذنين ، قم بعمل لكمة قطرها ستة ملليمترات باستخدام لكمة خزعة. قياس وزن كل خزعة الأذن على الميزان التحليلي ، والتعبير عنها بالملليغرام. بالنسبة لفحص الميلوبيروكسيديز ، أو MPO ، ضع خزعات الأذن في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر مع حبات من الفولاذ المقاوم للصدأ وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحضر.
تجانس الخزعات لمدة 10 دقائق في الخالط ثم تبريد العينة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية قبل تجانسها مرة أخرى لمدة 10 دقائق. أخرج الخرزات بمجرد تجانس الخزعات. قم بتجميد التجانسات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة.
إذابة ودوامة العينات ، وتكرار إجراء التجانس والتجميد ثلاث مرات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتجانس عند 3،000 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. احصد المادة الطافية باستخدام ماصة لقياس نشاط MPO ، والتعبير عنها بوحدات لكل ملليغرام من البروتين.
لإجراء اختبار نفاذية الأوعية الدموية ، قم بتوعية الفئران في اليوم صفر ، وفي اليوم الرابع ، تحدى مباشرة من خلال تطبيق hapten على الأذنين باستخدام الإجراء المذكور سابقا. بعد 23 ساعة ، حقن 8.3 ميكرولتر لكل جرام من وزن الجسم بنسبة 1٪ صبغة إيفانز الزرقاء في محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، أو DPBS ، إلى الفأر المخدر. بعد ساعة واحدة ، قم بتخدير الماوس مرة أخرى لجمع خزعات الأذن ، كما هو موضح سابقا.
لاستخراج الصبغة من الأنسجة ، احتضان الخزعات في الأنابيب التي تحتوي على ملليلتر واحد من الفورماميد عند 37 درجة مئوية في جو من 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 ساعة. بعد جمع خزعات الأذن ، عندما لا يزال الماوس تحت التخدير العميق ، قم بإزالة مقلة العين بالملاقط. ضع ضغطا لطيفا على الماوس واجمع الدم من الجيب الحجاجي الخلفي إلى الأنبوب لجمع المصل.
اقلب الأنبوب ست مرات وانتظر 30 دقيقة حتى يتجلط الدم. ثم ، الطرد المركزي الأنبوب في 1،300 إلى 2،000 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. توعية الفئران المانحة ب TNCB hapten في اليوم صفر باستخدام الإجراء المذكور سابقا في اليوم الرابع ، بعد تطهير الجلد ، قم بعزل الغدد الليمفاوية الإبطية والأربية ، أو ALNs ، من الفأر المخدر باستخدام الملقط ، متبوعا بعزل الطحال.
هرس الأنسجة بين الأطراف المتجمدة لشريحتين مجهريتين وقم بتمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية بحجم مسام 70 ميكرومتر. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS المكمل بمصل بقري جنيني 1٪ وطردها مركزيا عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. صب المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية المتبقية في واحد إلى خمسة ملليلتر من DPBS.
قم بإعداد خليط 1: 1 من ALNs والطحال لتحقيق تركيز يصل إلى 7.0 مرات 10 إلى الخلايا السابعة في 200 ميكرولتر من DBPS قبل حقن خليط الخلايا المستجيبة CHS عن طريق الوريد في فأر مخدر. قم بقياس سمك الأذن عند ساعة الصفر وبعد 24 ساعة من التحدي. أظهرت البيانات أن الفئران التي تحسست ل TNCB وتحدت في الأذنين بعد أربعة أيام طورت زيادة كبيرة في تورم الأذن ، مقارنة بالفئران الضابطة التي تحسست للوهم.
أدت الزيادة في وذمة الأذن في مجموعة الاختبار إلى زيادة وزن الأذن ، ونشاط MPO ، وتركيز إنترفيرون جاما في مستخلصات الأذن ، وتغيرات الأدمة الوذمية في الفحص النسيجي ، ونفاذية الأوعية الدموية للأذن كانت الأجسام المضادة IgG1 الخاصة ب TNP مرتفعة في أمصال فئران الاختبار عند مقارنتها بالحيوانات الضابطة. أظهرت الحيوانات التي تلقت خلايا CHS-respondor من المتبرعين الذين تم تحسسسهم سابقا مع TNCB زيادة كبيرة في تورم الأذن ، مقارنة بالحيوانات التي لم تتلق الخلايا. اللحظة الأكثر أهمية هي تحفيز فرط الحساسية للتلامس.
حل Hapten متقلب للغاية وحساس للضوء ، لذلك يجب تطبيقه بسرعة على جلد الحيوانات. يمكن إجراء اختبارات إضافية على الخلايا المستجيبة المعزولة. على سبيل المثال ، يمكن إنشاء مزارع الخلايا لتقييم القدرة على التكاثر في وجود المستضدات.
