接触超敏反应作为过敏性接触性皮炎的小鼠模型

这里介绍的客观实验室方法可能有助于研究小鼠的接触性超敏反应，其类似于人类的过敏性接触性皮炎。接触性超敏反应不仅可以通过耳水肿来测量，还可以通过各种实验室测试来测量，这些测试可以研究参与该反应的细胞机制。接触性更强的超敏反应模型可以测试各种环境因素和新物质，以显示测试因素是否调节T细胞依赖性免疫反应，可用于实施新疗法。

首先用剃须刀片刮掉老鼠的皮肤并标记爪子。在诱导接触性超敏反应（CHS）前六小时，用水涂抹灰色肥皂，并在小鼠的胸部和腹部剃掉两厘米见方的区域。在同一天，通过在先前剃光的斑点上施用150微升新鲜制备的5%半抗原来使小鼠敏感。

在控制鼠标中，仅应用车辆。将半抗原点干燥 30 秒，然后将动物放回笼子中。在第四天，由不知道实验组的观察者在零小时使用千分尺测量麻醉小鼠的耳朵厚度。

然后，在测试组和对照组中，在耳朵两侧涂抹 10 微升新鲜制备的 04%hapten，并使其干燥 30 秒。在第五天，即上一次 0.4% 半抗原应用后 24 小时，重复测量耳朵厚度以进行 24 小时测量。耳朵厚度测量24小时后，当小鼠仍处于深度麻醉状态时，用剪刀尽可能靠近颅骨切断耳朵。

在耳朵的远端侧，使用活检打孔器打一个直径六毫米的冲头。在分析天平上测量每个耳活检的重量，并以毫克为单位表示。对于髓过氧化物酶或MPO测定，将耳活检放入带有不锈钢珠的两毫升微量离心管中，并加入500微升制备的缓冲液。

在均质器中均质化活检10分钟，然后在4摄氏度下将样品冷却15分钟，然后再次均质10分钟。活检均质化后取出珠子。将匀浆在零下 20 摄氏度下冷冻 30 分钟。

解冻并涡旋样品，重复均质和冷冻过程三次。完成后，将匀浆在3， 000 G下在4摄氏度下离心30分钟。用移液管收获上清液以测量MPO活性，并以每毫克蛋白质的单位表达。

为了进行血管通透性测试，在第零天和第四天使小鼠敏感，通过使用前面提到的程序在耳朵上涂抹半抗原来直接激发。23小时后，在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水或DPBS中静脉注射每克体重8.3微升的1%Evans蓝色染料给麻醉小鼠。一小时后，如前所述，再次麻醉小鼠以收集耳活检。

为了从组织中提取染料，将活检在含有一毫升甲酰胺的管中，在37摄氏度的5%二氧化碳气氛中孵育18小时。收集耳活检后，当小鼠仍处于深度麻醉状态时，用镊子取出眼球。对小鼠施加轻轻的压力，并将血液从眶后窦收集到管中以进行血清收集。

将试管倒置六次，等待 30 分钟让血液凝结。然后，在室温下以1， 300至2， 000g离心管10分钟。使用前面提到的程序在第0天用TNCB半抗原使供体小鼠敏感 第四天，在对皮肤进行消毒后，使用镊子从麻醉小鼠中分离腋窝和腹股沟淋巴结或ALN，然后分离脾脏。

将组织捣碎在两个显微镜载玻片的磨砂端之间，并将细胞悬液通过孔径为70微米的细胞过滤器。然后，用补充有1%胎牛血清的DPBS洗涤细胞，并在4摄氏度下以300G离心10分钟。倒出上清液并将剩余的细胞沉淀重悬于一至五毫升DPBS中。

在麻醉小鼠中静脉注射CHS效应细胞混合物之前，准备ALN和脾脏的1:1混合物，以达到200微升DBPS中7.0乘以10至第七个细胞的浓度。在零小时和挑战24小时后测量耳朵厚度。数据显示，与假致敏然后类似的挑战对照小鼠相比，对TNCB敏感并在四天后受到耳朵攻击的小鼠的耳朵肿胀显着增加。

试验组耳水肿增加导致耳重、MPO活性、耳提取物中干扰素γ浓度增加、组织学检查水肿性真皮改变、耳血管通透性 与对照动物相比，试验小鼠血清中TNP特异性IgG1抗体升高。与未接受过TNCB致敏的动物相比，从先前用TNCB致敏的供体那里接受CHS效应细胞的动物的耳朵肿胀显着增加。最关键的时刻是触发接触超敏反应。

半抗原溶液非常易挥发且对光敏感，因此必须迅速将其涂抹在动物的皮肤上。可以在分离的效应细胞上进行其他测试。例如，可以建立细胞培养物以评估在抗原存在下增殖的能力。