Une méthode de laboratoire objective présentée ici peut aider à étudier la réaction d’hypersensibilité de contact chez la souris, qui imite la dermatite de contact allergique chez l’homme. La réaction d’hypersensibilité de contact peut être mesurée non seulement par œdème de l’oreille, mais aussi par divers tests de laboratoire qui permettent d’étudier les mécanismes cellulaires impliqués dans cette réaction. Le modèle d’hypersensibilité plus en contact peut tester divers facteurs environnementaux et de nouvelles substances pour montrer si les facteurs testés modulent les réponses immunitaires dépendantes des lymphocytes T, ce qui peut être utilisé pour mettre en œuvre de nouvelles thérapies.
Commencez par raser la peau de la souris avec une lame de rasoir et étiquetez la patte. Six heures avant l’induction de l’hypersensibilité de contact, ou SHC, appliquez du savon gris avec de l’eau et rasez une zone de deux centimètres carrés sur la poitrine et l’abdomen de la souris. Le même jour, sensibilisez les souris en appliquant 150 microlitres de 5% fraîchement préparés sur l’endroit préalablement rasé.
Dans la souris de contrôle, appliquez uniquement le véhicule. Séchez l’endroit haptène pendant 30 secondes avant de remettre l’animal dans la cage. Le quatrième jour, mesurer l’épaisseur de l’oreille d’une souris anesthésiée à l’aide d’un micromètre à zéro heure par un observateur ignorant les groupes expérimentaux.
Ensuite, appliquez 10 microlitres de 04% fraîchement préparé des deux côtés des oreilles dans les groupes de test et de contrôle et laissez-le sécher pendant 30 secondes. Le cinquième jour, 24 heures après l’application précédente de 0,4 %, répétez la mesure de l’épaisseur de l’oreille pour la mesure sur 24 heures. 24 heures après la mesure de l’épaisseur de l’oreille, lorsque la souris est encore en anesthésie profonde, coupez les oreilles aussi près que possible du crâne à l’aide de ciseaux.
Du côté distal des oreilles, faites un poinçon de six millimètres de diamètre à l’aide d’un poinçon de biopsie. Mesurer le poids de chaque biopsie de l’oreille sur la balance analytique et l’exprimer en milligrammes. Pour le test de myéloperoxydase, ou MPO, mettez les biopsies auriculaires dans un tube microcentrifuge de deux millilitres avec des billes en acier inoxydable et ajoutez 500 microlitres du tampon préparé.
Homogénéiser les biopsies pendant 10 minutes dans un homogénéisateur, puis refroidir l’échantillon pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius avant de l’homogénéiser à nouveau pendant 10 minutes. Retirez les billes une fois les biopsies homogénéisées. Congeler les homogénats à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Décongeler et vortex les échantillons, et répéter la procédure d’homogénéisation et de congélation trois fois. Une fois cela fait, centrifuger l’homogénat à 3 000 g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Récoltez le surnageant avec une pipette pour mesurer l’activité MPO et exprimez-le en unités par milligramme de protéine.
Pour effectuer un test de perméabilité vasculaire, sensibilisez les souris au jour zéro et, le quatrième jour, défiez directement en appliquant de l’haptène sur les oreilles en utilisant la procédure mentionnée précédemment. 23 heures plus tard, injectez par voie intraveineuse 8,3 microlitres par gramme de poids corporel de colorant bleu Evans à 1% dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS, à la souris anesthésiée. Après une heure, anesthésiez à nouveau la souris pour recueillir les biopsies de l’oreille, comme décrit précédemment.
Pour extraire le colorant du tissu, incuber les biopsies dans les tubes contenant un millilitre de formamide à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de 5% de dioxyde de carbone pendant 18 heures. Après avoir recueilli des biopsies de l’oreille, lorsque la souris est encore sous anesthésie profonde, retirez le globe oculaire avec une pince à épiler. Exercez une légère pression sur la souris et recueillez le sang du sinus rétro-orbitaire dans le tube pour la collecte du sérum.
Inversez le tube six fois et attendez 30 minutes que le sang coagule. Ensuite, centrifuger le tube à 1 300 à 2 000 G pendant 10 minutes à température ambiante. Sensibiliser les souris donneuses avec le TNCB hapten le jour zéro en utilisant la procédure mentionnée précédemment Le quatrième jour, après avoir désinfecté la peau, isoler les ganglions lymphatiques axillaires et inguinaux, ou ALN, de la souris anesthésiée à l’aide d’une pince, puis isoler la rate.
Écrasez le tissu entre les extrémités givrées de deux lames de microscope et passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire d’une taille de pores de 70 micromètres. Ensuite, lavez les cellules avec du DPBS supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal et centrifugez-les à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule restante dans un à cinq millilitres de DPBS.
Préparer un mélange 1:1 d’ALN et de rate pour atteindre une concentration allant jusqu’à 7,0 fois 10 à la septième cellule dans 200 microlitres de SPPD avant d’injecter par voie intraveineuse le mélange de cellules effectrices du SHC dans une souris anesthésiée. Mesurez l’épaisseur de l’oreille à zéro heure et après 24 heures de défi. Les données ont montré que les souris sensibilisées au TNCB et défiées dans les oreilles quatre jours plus tard ont développé un gonflement de l’oreille significativement accru, par rapport aux souris témoins sensibilisées de manière simulée puis aux défis similaires.
L’augmentation de l’œdème de l’oreille dans le groupe test a entraîné une augmentation du poids de l’oreille, de l’activité MPO, de la concentration d’interféron gamma dans les extraits d’oreille, des modifications du derme œdémateux dans l’examen histologique et de la perméabilité vasculaire de l’oreille. Les animaux qui ont reçu les cellules effectrices du SHC provenant de donneurs précédemment sensibilisés au TNCB ont montré une augmentation significative de l’enflure de l’oreille, comparativement aux animaux qui n’ont pas reçu les cellules. Le moment le plus critique est de déclencher une hypersensibilité de contact.
La solution Hapten est très volatile et sensible à la lumière, elle doit donc être appliquée rapidement sur la peau des animaux. Des tests supplémentaires peuvent être effectués sur les cellules effectrices isolées. Par exemple, des cultures cellulaires peuvent être établies pour évaluer la capacité de prolifération en présence d’antigènes.
