المعاهد الوطنية للصحة (NIH R15 NS067536-01A1 لDC)، والرابطة الوطنية التهاب الأعضاء الأنثوية (الجائزة لDC)، وماك ألستر كلية دعمت هذا العمل. تلقى CB زمالة من برنامج بيكمان علماء ماك ألستر كلية، بتمويل من مؤسسة أرنولد ومابيل بيكمان. معتمدة BTF وTM التي كتبها JDRF 2-2011-662. نشكر الدكتور جيسون شنكل والدكتور جوليانا لويس للحصول على المشورة التقنية، وجميع الأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر Chatterjea لما قدموه من مساعدة والدعم.

ملاحظة: الفئران الأسبوع 8-12 أنثى القديمة ND4 بستر السويسرية، ويضم تقليديا مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء، واستخدمت لهذه الدراسات تمت الموافقة على بروتوكول تجريبي المستخدمة (B13S1) من خلال IACUC ماك ألستر الكلية. 1. توعية وتحدي مع Oxazolone <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة التخدير عن طريق إضافة 3 مل الأيزوفلورين إلى المناشف الماصة وضعت تحت شبكة في الجزء السفلي من 4 L بغطاء جرة الزجاج. لإناث الفئران ND4 المستخدمة هنا، والوقت في الغرفة هو 30-60 ثانية حتى يتم تخدير موضوع بشكل كاف. تحسين إدارة مخدر للسلالة الماوس المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلاقة يعود كل فأر تخدير والجناح باستخدام الانتهازي وبر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل 2٪ من 4 ethoxymethylene-2-فينيل-2-oxazolin-5-واحد (الثور) إلى إيثانول المطلق، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على طبق من الدورية في حاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير لفترة وجيزةالفئران باستخدام التخدير الأيزوفلورين كما هو موضح في 1.1.1 وتطبيق 100 ميكرولتر من 2٪ الثور إلى حلق مرة أخرى في العديد من التطبيقات المسلسل حول 20 ميكرولتر لكل منهما. انتظر 5-10 ثانية بين التطبيقات التسلسلية للحل لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرص على تجنب إراقة 2٪ الحل الثور في مناطق أخرى من الخلف، وانتظر الحل لتجف بين التطبيقات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أيام 5-7 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل 1٪ من (الثور) في الايثانول المطلق، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على طبق من الدورية في حاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف ولكن لشل حركة بحزم الماوس على القفا من قاعدة العنق والذيل مع البطن مواجهة والرقبة يميل قليلا إلى الأسفل (على غرار على عقد لحقن داخل الصفاق) وتطبيق 100 ميكرولتر من 1٪ الثور إلى الجناح حلق في العديد من التطبيقات التسلسلية وأخذ الوقت لتجفيف الجلد بعد ذلك كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالسيطرة على الفئران، وتطبيق 100 ميكرولتر من المركبات الإيثانول المطلقة لفلان حلقك. </li></ol></li></ol> 2. الجناح الجلد الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون استنشاق، واستئصال بعناية المنطقة المرغوبة من الجلد الجناح (~ 25 ملم × 25 ملم من الجلد) مع 10 سم مقص جراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نظيفة، شفرة جراحية حادة، كشط بعيدا الدهون الزائدة والنسيج الضام من الجلد الجناح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 3 قطع من الجلد الجناح من 3 الفئران إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل RT HBSS [مع الفينول الأحمر، بدون الكالسيوم أو المغنسيوم، 5 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، 10 ملي 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- حمض piperazineethanesulfonic (HEPES)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)]. </li></ol> 3. قبل الهضم الأنسجة الغسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان أنبوب يحتوي على أجزاء الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بقوة لمدة 10 ثانية في نهاية فترة الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة محتويات الأنبوب خلال 70 ميكرونمصفاة للتخلص من المنطقة العازلة غسل وجمع الأنسجة. يمكن إعادة استخدامها مصفاة واحدة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله ضمن مجموعة المعالجة البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من الملقط، ونقل الجلد الجناح من مصفاة الى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد تحتوي على 10 مل من جديد، ووسائل الإعلام RT HBSS (التي تحتوي على EDTA، HEPES، وFBS كما هو موضح أعلاه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع 12،5 سم مقص تشريح الجراحية مغمورة في أنبوب، تخطر على كل قطعة من الجلد الجناح حتى أن متوسط ​​قطعة من النسيج حوالي 2.2 مم × 2.2 مم في المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان أنبوب يحتوي على أجزاء الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بقوة لمدة 10 ثانية على نهاية الحضانة </li></ol> 4. كولاجيناز الهضم من الجلد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة محتويات أنبوب من خلال مصفاة 70 ميكرون، وجمع ونقل القطع الجلد الجناح إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد تحتوي على 10 مل الصحائفش، RT HBSS وسائل الإعلام تستكمل مع 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان أنبوب يحتوي على الهضم المتوسطة وشظايا الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محتويات دوامة أنبوب بقوة لمدة 10 ثانية على نهاية الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية محتويات أنبوب من خلال مصفاة 70 ميكرومتر إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد؛ الحفاظ على التدفق من خلال تحتوي على الأنسجة هضمها والتخلص من مصفاة والجناح الحطام الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل من خلال تدفق في 50 مل من HBSS وسائل الإعلام، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 غرام، وصب طاف. </li></ol> 5. كثافة الطرد المركزي التدرج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة المصلية، إضافة 3 مل RT 67٪ كثافة التدرج وسائل الإعلام الطرد المركزي في الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 5 مل RT 44٪ كثافة وسائل الإعلام الطرد المركزي التدرج في HBSS مع الفينول الأحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شخص مهذبطبقة لاي 5 مل من 44٪ كثافة التدرج وسائل الإعلام الطرد المركزي التي تحتوي على الخلايا على أعلى من 67٪ من عينة سائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي باستخدام ماصة المصلية. تأكد من تعيين pipettor إلى أبطأ سرعة، ووضع ماصة على طول جدار أنبوب مخروطي الشكل. يجب الحرص على عدم اهتزاز، وتعطيل، أو عكس التدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين تسارع إلى أدنى الإعداد، فك الارتباط على الفرامل، وأجهزة الطرد المركزي التدرج في 931 x ج لمدة 20 دقيقة في RT التأكد من أن أجهزة الطرد المركزي غير متوازن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية التدرج من أجهزة الطرد المركزي، ونقل بلطف على مقاعد البدلاء مختبر عقد أنبوب تستقيم. باستخدام 5 مل نقل البلاستيك ماصة، وإزالة طبقة الخلايا في واجهة من 44٪ و 67٪ التدرج الكثافة الطرد المركزي وسائل الإعلام ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. إذا واجهة غير مرئية، ببساطة إزالة حوالي 2 مل من السائل في 67٪ -44٪ الحدود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنبوب مخروطي يحتوي على خلايا من الأسواق العالمية ضغطهاrface مع 2٪ FBS في 1X PBS المثلج، والخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج، وصب طاف. ملاحظة: هذه هي المرة الأولى التي تقوم فيها الخلايا يمكن أن تبرد / أبقى الباردة منذ الخطوات الهضم هي 37 درجة مئوية، والخطوات وسائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي هي في RT. الخلايا يمكن معلق في 1: 1 التريبان تخفيف الأزرق والتهم ومعلومات حيوية يمكن الحصول عليها في هذه المرحلة. </li></ol> 6. الحجب وتلطيخ لتحليل تدفق Cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة FcγRII / مستقبلات الثالث على خلايا لمنع تلطيخ الجسم المضاد غير محددة. لوصف التجارب هنا، وجعل يمزج سيد الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني مع 2٪ FBS تحتوي على 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة ضد اللامقترن CD16 / 32 (2.4G2) لربط وكتلة FcγRII / III مستقبلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا سدت مع يمزج رئيسية مناسبة من الأجسام المضادة ضد CD3ɛ (145-2C11)، CD4 (RM4-5)، CD8α (53 حتي 6،7)، CD11b (M1 / 70)، CD11c و(N418)، CD44 (IM7)، CD45 ( 30-F11)، CD45R(RA3-6B2)، CD62L (MEL-14)، ولي-6G / لي-6C (GR-1) (RB6-8C5)، وكذلك رائعة البنفسج 510 الحية / وصمة عار الميتة لتحديد الخلايا الميتة. استخدام جميع الأجسام المضادة إما في التخفيف الموصى بها من قبل الشركات المصنعة أو الأمثل من قبل الباحثين في السابق. لوصف التجارب هنا، استخدم كل الأجسام المضادة في التخفيف 1: 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا و resuspend في 50 ميكرولتر 1X PBS عازلة تلطيخ مع 2٪ FBS. الحفاظ على الجليد حتى يمكن الحصول على البيانات مضان على تدفق عداد الكريات. ملاحظة: من المهم أن يكون المعلمات تعويض ما قبل الأمثل مع الأنسجة اللمفاوية ومستضد سطح الخلية المشتركة (مثل CD4 أو CD8) قبل الحصول على البيانات مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لزيادة عدد الخلايا لتدفق المصب تحليل الخلوي، والحصول على البيانات من عينة كاملة من الخلايا الملون. </li></ol> 7. تحليل التدفق الخلوي البيانات باستخدام الطرق القياسية لإنجاز الخطوات المذكورة أدناه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأولى، بوابة على المنطقة اللمفاويات مبعثر إلى الأمام(منطقة) من خلال الجانب مبعثر (منطقة) المؤامرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، حدد الخلايا واحدة باستخدام مبعثر إلى الأمام (العرض) من خلال الجانب مبعثر (العرض)، لتجنب تحليل الحلل. هذا ويمكن أيضا أن يتحقق مع ارتفاع مبعثر إلى الأمام إلى جنب ارتفاع مبعثر المؤامرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، البوابة على النسب (CD11b، CD11c و، وCD45R / B220) -negative وCD3 إيجابية الأحداث، على أن تستبعد الضامة، والخلايا الخلايا الجذعية، وB، على التوالي، ويحلل تحصر إلى الخلية حجرة T، إذا كان الهدف هو، كما هو الحال هنا، لتقييم اختراق خلايا T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، بوابة على الخلايا الحية التي تستبعد / وصمة عار الميتة الحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا، بوابة على السكان خلية من الفائدة (انظر القسم ممثل النتائج). </li></ol>

<ol>
	<li>Hay, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Skin+Disease+in+2010:+An+Analysis+of+the+Prevalence+and+Impact+of+Skin+Conditions.">The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).</li><li>Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+immune+events+in+the+murine+contact+hypersensitivity+model:+toward+the+understanding+of+allergic+contact+dermatitis.">Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis.</a> J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).</li><li>Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+psoriasis.">Mouse models of psoriasis.</a> J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Innate+Immunity.">Mouse Models of Innate Immunity.</a> Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+CD69+Interference+with+Sphingosine-1-Phosphate+Receptor+Function+Regulates+Peripheral+T+Cell+Retention.">Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention.</a> J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).</li><li>Schaerli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+skin-selective+homing+mechanism+for+human+immune+surveillance+T+cells.">A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells.</a> J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).</li><li>Zaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+skin-resident+memory+T+cells+within+an+epidermal+niche.">Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).</li><li>Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+vitiligo+with+focused+epidermal+depigmentation+requires+IFN-&#915;+for+autoreactive+CD8++T+cell+accumulation+in+the+skin.">A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-&#915; for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin.</a> J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).</li><li>Nagao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+epidermal+Langerhans+cells+and+langerin-expressing+dermal+dendritic+cells+are+unrelated+and+exhibit+distinct+functions.">Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+neural+tissue.">Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li><li>Hershko, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+Cell+Interleukin-2+Production+Contributes+to+Suppression+of+Chronic+Allergic+Dermatitis.">Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis.</a> Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).</li><li>Tabatabaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells:+The+effect+of+trypsin.">Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin.</a> Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Gu, D., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+analyses+during+skin+carcinogenesis.">Cell population analyses during skin carcinogenesis.</a> J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).</li><li>Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Murine+Lymph+Node+Stromal+Cells.">Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells.</a> J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).</li><li>Martinov, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+hypersensitivity+to+oxazolone+provokes+vulvar+mechanical+hyperalgesia+in+mice.">Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice.</a> PloS one. 8 (10), e78673 (2013).</li><li>Katsares, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Accurate+Method+for+the+Stem+Cell+Viability+Evaluation:+The+Case+of+the+Thawed+Umbilical+Cord+Blood.">A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood.</a> Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).</li><li>Thomas, M. L., Lefran&#231;ois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+leucocyte-common+antigen+family.">Differential expression of the leucocyte-common antigen family.</a> Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).</li><li>Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ly6G-specific+monoclonal+antibody+to+deplete+neutrophils+in+mice.">Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice.</a> J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية أو غيرها في الكشف عنها.

تميز التغيرات في الكريات البيضاء والجلد المقيمين في نماذج القوارض من الأمراض الجلدية مثل الاكزيما أو الصدفية المهم لفهم الاتصالات الآلية بين تدفق الخلايا الالتهابية وعلم الأمراض. نحن هنا وصف تقنية اقتصادية لعزل الكريات البيض من أنسجة الجلد مع المعدات الأساسية الموجودة في معظم مختبرات الأبحاث الطبية الحيوية. هذه التقنية السريعة نسبيا يتجنب استخدام آلات تفارق الأنسجة مكلفة وأنابيب مخصصة والكواشف، مما يساعد على الحفاظ على الموارد وتقليل الأيدي في الوقت المحدد على مقاعد البدلاء المختبر. الأنزيمية لطيف هضم وفصل التدرج متقطع إزالة معظم الخلايا الظهارية والحطام، وخلايا معزولة يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب بما في ذلك تحليل تدفق cytometric، فرز الخلايا، ونقل، زراعة الخلايا وفحوصات التحفيز المختبر. الأنزيمية هضم مع كولاجيناز D له أي تأثير على T سطح الخلية سلامة علامة، وبريزرفيس بقاء الخلية. هذا البروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لمعالجة البشرة من مناطق أخرى من الجناح. الخطوات الأكثر أهمية في هذا الإجراء هي 1) إزالة تماما أي الدهنية والأنسجة الضامة في حين حصد الجلد، 2) التعامل مع والأنسجة المعالجة السريعة لتحقيق أقصى قدر من التسلل العائد الخلية مع تقليل موت الخلايا، 3) طبقات بلطف التدرج، و4) بعناية استخراج واجهة من التدرج. قبل البدء في تجربة على نطاق واسع أنه من المهم أن ممارسة التدرج الكثافة الطرد المركزي طبقات وسائل الاعلام وإزالة واجهة. يمكن للمرء أن ممارسة خلايا الحصاد من التدرج الكثافة متقطعة عن طريق سحق والطحال الفئران بأكمله من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني 1X العازلة تلطيخ وأداء التدرج الكثافة كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5. فمن الأسهل كثيرا أن نرى واستخراج واجهة بين 44٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي ووسائل الإعلام 67٪ التدرج الكثافة الطرد المركزي تستخدم ليرة سوريةlenocytes، بسبب وجود عدد كبير من الخلايا المناعية الحالية. عند العمل مع التدرجات كثافة، وينبغي تجنب فقاعات في حين pipetting ل، وينبغي التقليل من اضطرابات التدرج. أنبوب مخروطي يحتوي على التدرج ينبغي التعامل بلطف وعقد عموديا في جميع الأوقات. يجب التدرج الكثافة حلول الوسائط الطرد المركزي أن يكون دائما في RT، pipettors المصلية لتعيين أبطأ سرعة الإفراج الممكنة، وأجهزة الطرد المركزي الحفاظ على RT، لتعيين منخفضة تسارع مع الفرامل فض الاشتباك، وبعناية متوازنة قبل الغزل. عند العمل مع المستحضرات الجلدية التي تحقق أعداد صغيرة من الكريات البيض التسلل، والخلايا ليست دائما واضحة في واجهة التدرج. وبالتالي، فمن المهم لجعل 44٪ كثافة وسائل الإعلام الطرد المركزي التدرج مع HBSS تحتوي على الفينول الأحمر بحيث اجهة يمكن تصور بسهولة حتى عندما طبقة من الخلايا لا يمكن تمييزها. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن يكون لطيف ولكن سريعا عند استخراج والغسيلومعالجة أنسجة الجلد لتجنب موت الخلايا قبل أن يتم وضعها على الجلد في وسائل الإعلام HBSS. إذا بقاء الخلية أو نقاء منخفضة، وأقصر (~ 20 دقيقة) مرات الهضم، وتركيزات أقل قليلا من كولاجيناز D (~ 0.5 ملغ / مل)، أو تنميق النسيج أكثر دقة قد تكون مفيدة. بسبب الإفراط في الهضم وتدهور الأنسجة قد تساهم في موت الخلايا، سوف يحتاج الباحثون إلى تحسين الحد الأدنى من الوقت الهضم الذي يوفر كبير بما فيه الكفاية عينة خلية حجم 17. ومن المرجح أن تتطلب العملية عدة جولات من التحسين في أيدي المحققين الفردية لتوحيد هذه التقنية. قد تختلف كولاجيناز D مستوى النشاط أيضا بين التصنيع الكثير وتعديلات لآخر الهضم سوف يتعين القيام بها لكل الكثير من الإنزيم المستخدم. خلال التحسين، من المهم أن الايقاف الخلية إشارة وصمة عار (مثل الطحال) تنقيته مع وبدون الأنزيمية الهضم خطوة مع العيش / وصمة عار الميتة يمكن الاعتماد عليها وكذلك الخلايا المناعية لينعلامات EAGE (مثل CD45، CD3ɛ، CD11b، CD11c و، وما إلى ذلك) للتأكد من أن يتم الاحتفاظ السكان الخلية وعلامات سطح الفائدة من خلال عملية الهضم الأنسجة. إذا كان ذلك ممكنا، فإنه من المفيد لأداء أمثل على تدفق عداد الكريات التي يمكن قياس قدما وعرض الجانب مبعثر أو الارتفاع، وكذلك منطقة، لاستبعاد المجاميع الخلية. وأخيرا، ينبغي دراسة الايقاف الخلية تحت مجهر الضوء المرئي لتقييم الجدوى والتشكل الخلوي العام. الخلايا يمكن عدها يدويا باستخدام 0.4٪ التريبان الأزرق صبغ الإقصاء تحت المجهر الخفيفة أو على قياس التدفق الخلوي باستخدام الخرز العد. للدراسات التي تتطلب تقدير أكثر صرامة من أنواع معينة من الخلايا في الأنسجة استئصاله، يمكن للباحثين تزن أو قياس حجم الشظايا الأنسجة قبل وبعد عملية الهضم، واستخدام مدى الهضم لتقدير أكثر دقة أعداد مجموعات فرعية الخلايا الموجودة في الأنسجة الوجود تحليل. واحد الحد من هذاالبروتوكول هو أنها مصممة خصيصا لتنقية الخلايا المناعية. إذا كان أحد يهتم في العزلة، وتنقية، وتحليل السكان الخلوي آخر (على سبيل المثال خلايا الجلد الظهارية)، وكثافة التدرج انشاء والأنزيمية هضم على حد سواء حاجة المرجح أن يتم تعديل البروتوكول والأمثل لأفضل عزل خلايا الفائدة. ومع ذلك، هذا البروتوكول يسمح لعزل وتنقية كل من مجموعات فرعية الخلايا اللمفاوية والدم النخاعي وبالتالي يمكن تكييفها لمعظم التطبيقات المناعية. قيود آخر هو أن هذا البروتوكول لا يمكن استخدامها للتمييز بين سكان الخلية بالتسلل إلى الأدمة مقابل البشرة من الجلد. لتحقيق هذا المستوى من التمايز، أن هذا البروتوكول يتعين زيادة تكييفها مع خطوات إضافية لفصل إنزيمي الأدمة والبشرة قبل أو بدلا من الخطوات المذكورة هنا. هنا، يتم تجميع عينات من ~ 3 الفئران لتسهيل متعددة المعلمة تحليل تدفق cytometric مما يجعل من الصعبالكشف عن التباين بين مكررات البيولوجية. ومع ذلك، اعتمادا على تطبيق المصب في الاختيار، وهذا البروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لانتاج واستخدام عينات من المواد واحدة. وأخيرا، قدم بروتوكول هنا للصغار، قد تحتاج ND4 إناث الفئران إلى تعديل للفئران من مختلف الأعمار والجنس أو سلالات وفقا لاحتياجات الباحثين. باختصار، هذا المزيج من الأنزيمية لطيف الهضم ويتيح الفصل التدرج متقطع طريقة بسيطة وفعالة واقتصادية لتنقية الخلايا المناعية من آفات الجلد التهابات في الفئران. ويمكن استخدامها وتكييفها على نطاق واسع عبر مجموعة متنوعة من نماذج القوارض من أمراض الجلد كأداة ملائمة لتقييم تسلل المناعة، وعزل النقي، والسكان قابلة للحياة الكريات البيض لتطبيقات المصب.

تم العثور على الأمراض الجلدية التي تتراوح بين التهاب الجلد التماسي، والأكزيما، الصدفية، التهاب النسيج الخلوي، والالتهابات الفطرية وخراجات لسرطانات الجلد غير القتامي لتكون من بين 50 الأمراض الأكثر انتشارا في جميع أنحاء العالم، ورابع السبب الرئيسي العالمي للأمراض غير المميتة في عام 2010 1. وفقا لذلك، والتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء أمراض الجلد المختلفة هي منطقة الضرورية ونشطة للبحث. وكانت نماذج القوارض مفيدة بشكل ملحوظ في فهم الأمراض الجلدية الالتهابية مثل التهاب الجلد التأتبي 2، 3 الصدفية، أو عدوى المكورات العنقودية الذهبية (4). يمكن البروتوكولات غير مكلفة وفعالة وبسيطة لعملية الهضم الأنزيمي من أنسجة الجلد الماوس توفر الاستعدادات من الخلايا التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب من أجل فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الجلد. هنا، يتم وصف طريقة بسيطة واقتصادية لالأنزيمية ملخص من الجلد الماوسالأنسجة وعزل الجلد الكريات البيض التسلل التي يمكن استخدامها لزراعة الخلايا، في الجسم الحي نقل بالتبني، وتدفق تحليل cytometric والفرز أو دراسات التعبير الجيني. الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد تعليق خلية واحدة من الكريات البيض-التسلل الجلد مع بقاء الخلية عالية مع تقليل التكاليف المرتبطة عادة مع مجموعات كاشف العرف وdissociators الميكانيكية. أنسجة الجلد طرق تفكك القائمة 5-7 قد يؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية وسلامة سطح علامة، أو تتطلب مجموعات انزيم العرف ومكلفة آلات تفكك النسيج 11/08. في حين أن هضم أذن الفأر أنسجة الجلد منتشر بشكل معقول 12-13، وهضم أنسجة الجلد الكيراتينية للغاية (على سبيل المثال من الجهة) يمكن أن يؤدي إلى الاستعدادات الخلية الملوثة مع كميات كبيرة من الحطام غير الخلوية. في دراسة حديثة، يهضم زيد وزملاؤه الماوس الجناح البشرة لمدة 90 دقيقة في 2.5 ملغ / مل dispase، FOLLOتزوجا قبل 45 دقيقة في 3 ملغ / مل كولاجيناز 7. في دراسة أخرى، استخدم هؤلاء الباحثون حضانات متعددة مع الهضم مجتمعة من 2.5 ساعة، بما في ذلك استخدام التربسين / EDTA، كولاجيناز الثالث، وdispase 5. لا ينصح استخدام التربسين لالأنزيمية الهضم الجلد، كما أظهرت المعاملة مع التربسين من مختلف الصانعين لتؤثر بشكل ملموس على سلامة بروتينات سطح الخلية في خلايا الثدييات 14-15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون dispase آثار كبيرة على قدرات التكاثري خلايا CD4 وCD8α T وتؤثر على وفرة سطح لا يقل عن 20 الجزيئات، بما في ذلك T مشترك علامات تنشيط الخلايا مثل CD62L 16. بروتوكولات أخرى تستخدم RPMI 1640 في المتوسط ​​6 الهضم. ومع ذلك، فإن وجود من المغنيسيوم والكالسيوم 2+ 2+ في RPMI يمكن أن يسبب الخلايا واسعة التجميع 17. وينبغي أن يهدف بروتوكول مثالية للتفكك الأنسجة لبقاء الخلية عالية، وانخفاضمستويات تجميع الخلية، والحد الأدنى من الضرر إلى الخلية البروتينات السطحية. وقد تم إنجاز جودة عالية التحضيرات خلية العقدة الليمفاوية انسجة مع البروتوكولات التي تستخدم حضانات انزيم أقصر، الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ سائل الإعلام الحرة، وتجنب التربسين وdispase 18. ومع ذلك، لم تثبت البروتوكولات من هذا النوع لتفكك الجلد الماوس كله. هنا، يتم وصف بروتوكول لفصل وعزل، وإثراء الكريات البيضاء-التسلل الجلد من تحدى حساسية الماوس الجناح الجلد. لفترة وجيزة، وحضنت قبل رفعه الجلد في محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) مع 10٪ مصل بقري جنيني لمدة 1 ساعة لتليين الأنسجة لعملية الهضم وإزالة أي جلد أو الدهنية الميتة الأنسجة الزائدة. وأعقب ذلك 30 دقيقة خطوة الأنزيمية الهضم مع 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D. كولاجيناز D ديه الحد الأدنى من الآثار على كثافة علامات سطح الخلية، وليس له تأثير على T تكاثر الخلايا في المختبر 16،18، مما يجعلهامناسبة جدا للتطبيقات التي تنطوي على توصيف البروتينات السطحية. بعد الهضم الأنزيمي، وكان يستخدم متقطع التدرج الكثافة الطرد المركزي لإزالة الخلايا الظهارية والحطام من تعليق وحيد الخلية وإثراء لالخلايا المكونة للدم. الأهم من ذلك، هذا الإجراء يتجنب الخلايا المغناطيسية الكواشف الفصل القائم على عمود مكلفة وآلات تفكك النسيج 11/8، ويمكن أن يؤديها مع المعدات والمواد الموجودة في مختبر البحوث الطبية الحيوية الأساسية. هنا تم استخدام هذا البروتوكول لعزل الكريات البيض من الجلد الجناح تحدى ثلاث مرات مع oxazolone ناشبة (الثور) في المتحسسة سابقا الفئران ND4 السويسري (مقتبس من 19). وقد تم تحليل الخلايا باستخدام متعددة حدودي التدفق الخلوي. هذه التقنية أسفرت تعليق خلية مع الحد الأدنى من الحطام و&gt; 95٪ قابلية الخلايا الليمفاوية المعزولة التي تم تحليلها من قبل التدفق متعدد حدودي الخلوي لقياس تسلل الخلايا الليمفاوية T والعدلات في كورونا المتضررينفي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1213">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">55021C</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">EDTA disodium salt solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">E7889</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td>
			<td style="width:179px;">MidSci</td>
			<td style="width:181px;">S01520HI</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">Percoll, pH 8.5-9.5 (25&#176;C)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P1644</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">Trimmer Combo Kit</td>
			<td style="width:179px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:181px;">CL9990-1201&#160;</td>
			<td style="width:396px;">Use the larger trimmer for shaving the flank and back.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">E0753-10G</td>
			<td style="width:396px;">Dissolve in 100% EtOH at 50&#176;C for 15 minutes on a rotating plate.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">70-0161</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:457px;">anti-CD3e-BV650 (145-2C11)</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">564378</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">47-0042-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD8a-BV785 (53-6.7)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">100749</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0112-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0114-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD44-BV711 (IM7)</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">563971</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD45-FITC (30-F11)</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">35-0451-U025</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0452-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">104431</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">108407</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">Ghost Dye-BV510</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">13-0870-T100</td>
			<td style="width:396px;">Viability dye for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">LSR Fortessa</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td style="width:396px;">Cell analyzer (18 parameters)</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:457px;">Collagenase D from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:179px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:181px;">11088858001</td>
			<td style="width:396px;">Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.&#160; Store immediately at -20&#176;C for up to six months.</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:457px;">ND4 Swiss female mice</td>
			<td style="width:179px;">Harlan</td>
			<td style="width:181px;">0-32</td>
			<td style="width:396px;">8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College&#39;s IACUC guidelines.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

تعامل كولاجيناز D splenocytes تظهر مستويات مماثلة من CD4 و CD8 α على خلايا T بالمقارنة مع الضوابط المعالجة الإعلامية أولا، تم تقييم أي آثار محتملة من كولاجيناز D على وتيرة والسطحية وفرة من النسب وتفعيل علامات على T فرعية الخلية باستخدام الأنسجة اللمفاوية الثانوية كمجموعة تحكم. تم الحصول على تعليق من splenocytes من الفئران ND4 وغسلها لمدة 1 ساعة مع HBSS وسائل الإعلام. المقبل، نصف الخلايا تتعرض إلى 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D (كما هو موضح في القسم 4 أعلاه). ومعلق الخلايا المتبقية في السيطرة HBSS المتوسطة. بعد ذلك، تم تجهيز كل من الكسور خلية طحالية باستخدام الكثافة الطرد المركزي التدرج كما هو موضح في القسم 5 أعلاه. ثم تم ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة ضد سطح CD4 وCD8α، وتحليلها على تدفق عداد الكريات. واحدة، ويعيش، CD45 +، غير-T النسب - (B220 - CD11b -CD11c و-)، وبوابات CD3ɛ + الخلايا لتحليلها، لاستبعاد الخلايا B، الضامة، والخلايا الجذعية. تم الكشف عن CD4 وCD8α البروتينات بالتساوي على سطح splenocytes التي تعرضت لكولاجيناز D الهضم وتلك لم تتعرض لانزيم مع ما يقرب من 60٪ CD4 + CD8α - خلايا و 30٪ CD4 - CD8α + خلايا الكشف مع أي علاج ( الشكل 1A). ولذلك، لم كولاجيناز D ملخص لا تؤثر على وتيرة النسبي للCD4 وCD8α. كانت شدة سطح CD4 وCD8α المتوسط ​​الهندسي وحدات مضان (gMFI) على هذه المجموعات الفرعية للمقارنة بين العلاجين أيضا. وكانت القيم gMFI لCD4 2271 لالمعالجة انزيم وsplenocytes 2243 للسيطرة على التوالي، وكانت القيم gMFI لCD8α 536 لالمعالجة الإنزيم و 520 لsplenocytes السيطرة. كان العلاج الأنزيمية أيضا أي تأثير على كثافة سطح تنشيط الخلايا T علامات CD44 أو CD62L على خلايا CD4 + T (الشكل 1B). وكانت هندسية متوسط ​​قيم الكثافة مضان لCD44 669 لالمعالجة الإنزيم و 654 لsplenocytes السيطرة؛ وكانت القيم gMFI لCD62L 1523 لالمعالجة انزيم و1517 لsplenocytes السيطرة. كما كولاجيناز D الهضم يحافظ على سلامة البروتينات على سطح خلايا معزولة، وبروتوكول الموصوفة هنا يمكن استخدامها مع الثقة لتدفق المصب تحليل الخلوي. انزيم الهضم وتنقية التدرج من الجلد الجناح خلايا النتائج في جدوى الخلوية عالية تم تقييم العائد الخلية والجدوى في المئة من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها أعلاه باستخدام التريبان الأزرق صبغ استبعاد 20. هذا البروتوكول الفصل الهضم والتدرج أسفرت عن 250 الخلايا المناعية قابلة للحياة في ملم 2 من الأنسجة الجناح في الفئران الثور طعن، وحوالي 4 خلايا مناعية قادرة على البقاء في ملم 2 من الأنسجة في الفئران تحدى السيارة<html> التي تم المتحسسة سابقا مع الثور (الجدول 1). انزيم الهضم وتنقية التدرج من الجلد الجناح خلايا النتائج في انتعاش اقتصادي قوي من الخلايا المناعية بعد ذلك، تم تحديد مدى تسلل المناعي في الجلد عن طريق تحليل وفرة من البروتينات السطحية CD45 على الخلايا المعزولة من الجهة الثور طعن والسيطرة على الفئران لتقييم الانتعاش من الخلايا المناعية تسلل الجلد باستخدام الأساليب المذكورة هنا. CD45 هو النسب علامة عموم المكونة للدم 21. 95٪ من منخفض إلى الأمام والجانب مبعثر، خلايا مفردة (النابضة لا يظهر) في الفئران الثور طعن وكانت 71٪ من هذه الخلايا في الضوابط تحدى السيارة CD45 + الخلايا الحية (الشكل 2). تم الكشف عن A ~ زيادة 67 أضعاف في التسلل CD45 + المناعة الخلايا في الجلد الجناح التالية 3 التحديات الثور اليومية باستخدام الإجراء الموضح في هذه الوثيقة (الجدول 1). الصورة = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;1&quot;&gt; ثلاثة تحديات الجناح الثور يؤدي إلى تسلل واضح للخلايا T والعدلات أسلوبنا أثمرت السكان خلية من الجلد الجهة التي يمكن استخدامها للكشف عن مجموعة متنوعة من النخاعي ومجموعات فرعية الخلايا اللمفاوية مثل GR-1 + العدلات 22، خلايا CD4 T والخلايا CD8α T. لاحظنا ~ 6 أضعاف، ~ 7 أضعاف، و~ زيادة 73 أضعاف في العدلات، وخلايا CD4 T، وخلايا T CD8α، على التوالي، بعد 3 التحديات الثور اليومية (الجدول 1). حسبنا هذه الزيادات عن طريق ضرب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة التي تم الحصول عليها (تحسب باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد) من قبل في المئة من جزء الخلايا المناعية تعطى للخروج من البوابة خلايا قابلة للحياة خلال تحليل تدفق cytometric. نحن ثم يقسم العدد الإجمالي للخلايا المناعية قابلة للحياة، GR-1 +، CD4 +، أو CD8α + الخلايا في الفئران الثور المعاملة على أيدي الأرقام المقابلة للفئران السيطرة على السيارة، مما يتيح لناأضعاف الزيادة في مجموعات فرعية لمفاوية. وشكلت GR-1 + العدلات عن 42٪ من واحد، CD45 الحية + B220 - CD11b - CD11c و- الخلايا في الفئران الثور المعاملة و 10٪ من هذه الفئة من السكان في الفئران ETOH المعاملة (الشكل 2B). في الفئران الثور المعاملة، ~ 52٪ من بوابات الخلايا CD3 + T كانت CD8α + و~ 34٪ كانت CD4 +، بينما في الضوابط مركبة، ~ 9٪ من خلايا T كانت CD8α + وكانت 57٪ CD4 + (الشكل 2C) . لذلك، مع تقنية وصفها هنا، يمكن معالجتها حساسية وغير حساسية الجلد الجناح لانتاج تعليق خلية واحدة مناسبة لعالية الدقة تدفق cytometric توصيف تسلل مجموعات فرعية الخلايا المناعية. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> خلايا فرعية من الجلد الماوس الجناح </td><td> ثور / ثور (3) </td><td> ثور / ETOH (3) </td><td> أضعاف التوسع (الثور / Ethanol) </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> في مم 2 الأنسجة </td></tr><tr><td> إجمالي عدد الخلايا </td><td> 262.7 </td><td> 5.3 </td><td> 49.3 </td></tr><tr><td> CD45 + الخلايا المناعية </td><td> 250.7 </td><td> 3.8 </td><td> 66.7 </td></tr><tr><td> CD4 + CD8 - الخلايا </td><td> 6.5 </td><td> 0.9 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> CD4 - CD8 + الخلايا </td><td> 10.6 </td><td> 0.1 </td><td> 72.9 </td></tr><tr><td> العدلات </td><td> 8.6 </td><td> 15 </td><td> 5.6 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. غلة خلية من حساسية الجلد الجناح في الفئران الإناث ND4. احصي الخلايا قادرة على البقاء معزولة عن الجلد الجناح باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد، وتطبيع خلية / ملم 2 الأنسجة استنادا إلى منطقة من الجلد معزولة وعدد من الفئران المجمعة في تيسمقاضاة الإعداد. حسبنا مجموع العائد الخلايا المناعية على أساس الكشف عن CD45 المكونة للدم مستضد على سطح الخلية، واللمفاويات عوائد فرعية على أساس علامات سطح نسب محددة. نحن بعد ذلك بقسمة عدد الخلايا في الفئران الثور المعاملة على أيدي الأرقام بالنسبة للفئران السيطرة على السيارة، وهذا يعطينا أضعاف الزيادة في مجموعات فرعية لمفاوية. تمثل البيانات الواردة البيانات المجمعة 2-3 الفئران في العلاج، وهي تمثيلية من تجربتين مستقلة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig1.jpg" /> الشكل 1. انزيم الهضم والتدرج تنقية splenocytes الحفاظ على مجموعات فرعية لمفاوية وعلامات تنشيط الخلايا. غسلها Splenocytes لمدة 1 ساعة مع HBSS وسائل الإعلام، حضنت مع أي كولاجيناز D أو وسائل الإعلام HBSS وحده، وتنقيته باستخدام التدرج الكثافة لإزالة الحطام وخلايا الدم الحمراء. وقد تم تحديد الخلايا T كما يعيش، CD45 +، النسب (B220، CD11b، CD11c و) &lt;سوب&gt; -، وCD3ɛ +. لم تواتر CD4 والخلايا T CD8α لن يتغير بعد الهضم الأنزيمي (A). لم كثافة سطح CD44 وCD62L على خلايا CD4 + T لن تتغير بعد الهضم الأنزيمي (B). البيانات الواردة تمثل تجميع البيانات 2-3 الفئران في العلاج من تجربة واحدة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53638/53638fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig2.jpg" /> الشكل 2. انزيم الهضم وتنقية التدرج من خلايا الجلد تكشف تسلل المناعة واضح في السيطرة مقابل تحدى حساسية الماوس الجناح الجلد. ثلاثة تحديات الجناح الثور تنتج الزيادة ~ 67 أضعاف في الخلايا المناعية تسلل الجلد في المتحسسة سابقا الفئران ND4 السويسري ( A). الأقليم ثلاثة تحديات الثور أيضاoked زيادة ~ 6 أضعاف في GR-1 + العدلات (B)، و ~ و ~ 73- زيادة بنسبة 7 أضعاف الخلايا CD8α + وCD4 + T على التوالي (C). هي بوابات CD45 + الخلايا المناعية الحية من خلايا مبعثر واحدة، منخفضة إلى الأمام والجانب. العدلات وخلايا T بوابات من B220 - CD11b - CD11c و- الخلايا وحيدة حية. أجريت التهم باستخدام 1: 1 التريبان تخفيف الأزرق بعد الانفصال كثافة التدرج. البيانات الواردة يمثل تجميع البيانات 2-3 الفئران في كل مجموعة العلاج، وتكون تمثيلية من تجربتين مستقلة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53638/53638fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation at JoVE.com

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K Views.  Macalester College. This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols. 

Video: Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

عزل وتوصيف الخلايا الجذعية والضامة من الأمعاء ماوس

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; زراعة الخلايا

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

إعداد وحيدة الخلية تعليق لتحليل Cytofluorimetric من المناطق الجلد ماوس مختلفة

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...