يتم إزعاج معدل تخليق البروتين أثناء المرض والشيخوخة. الفلوريسنس الانتعاش بعد photobleaching، أو FRAP، يسمح بقياس معدل تخليق البروتين في الجسم الحي. نستخدم ديدان C.elegans الشفافة ، التي تعبر عن GFP ، كنموذج لمراقبة تخليق البروتين الجديد بعد الاحتراق الضوئي.
نحن نقدم إرشادات عملية لقياس استعادة الفلورانس باستخدام الديدان المعدلة وراثيا، والتي تعبر عن GFP تحت المروجين مختلفة، سواء أعرب على نطاق واسع أو في خلايا أو أنسجة محددة. أيضا، هذه الطريقة تقدم البروتين توليف سرعة الرصد في الوقت الحقيقي. استخدام تشريح stereomicroscope لتقييم مراحل النمو ونمو الديدان الخيطية المتحولة وراثيا من نوع البرية ومتحولة.
اختيار 10 يرقات L4 من الحيوانات المعدلة وراثيا من النوع البري ومتحولة تحمل مراسل الفلورسنت المطلوب على لوحات وسائط نمو الديدان الخيطية بذر مع الإشريكية القولونية. احتضان وتنمو النيماتودا في درجة الحرارة القياسية من 20 درجة مئوية. بعد أربعة أيام، تحتوي الصفيحة على مجموعة مختلطة من الديدان المعدلة وراثياً.
اختيار ونقل 15 يرقات L4 من كل سلالة على لوحات OP50 NGM المصنفة حديثا. أداء مقايسة FRAP، ورصد معدل تخليق البروتين في اليوم الأول من مرحلة البلوغ. في اليوم التالي، إعداد واستخدام لوحات NGM التي تحتوي على السيكلوهيكسميد كتحكم إيجابي.
قتل البكتيريا عن طريق تعريض لوحات NGM المصنفة لمدة 15 دقيقة مع الأشعة فوق البنفسجية. إضافة cycloheximide على الجزء العلوي من لوحات بذر بكتيرية جدا 500 ميكروغرام لكل تركيز نهائي مل في حجم أجار. السماح لتجف الأطباق.
نقل النيماتويدات المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP على المركبات واللوحات المحتوية على السيكلوهيكسميد. احتضان الحيوانات لمدة ساعتين في درجة الحرارة القياسية من 20 درجة مئوية. اختيار ونقل الحيوانات المعدلة وراثيا الكبار ليوم واحد إلى لوحات NGM الفردية بذر مع 20 ميكروليترس OP50 قطرة في المركز.
إزالة الغطاء ووضع كل لوحة تحت عدسة الهدف 20H من المجهر epifluorescent. التركيز والتقاط صورة مرجعية قبل photobleaching. Photobleach كل عينة لمدة 10 دقائق.
التقاط صورة بعد photobleaching. إبقاء الحيوانات في لوحات NGM الفردية، والسماح لهم لاسترداد. صورة وتسجيل الانتعاش من كل مراسل الفلورسنت كل ساعة واحدة لمدة ست ساعات على الأقل في مجسم epifluorescent.
إعداد منصات agarose 2٪، وإضافة 10 ميكروليتر قطرة من M9 العازلة في وسط لوحة agarose. نقل خمسة الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن عموم الخلايا العصبية سيتوبلازميك GFP في قطرة من M9 العازلة. استخدم رمشًا لنشر السائل.
الحيوانات عرض انخفاض الحركات في غضون دقيقتين بسبب امتصاص M9 في أجار. تغيير موقف النيماتودا باستخدام اختيار رمش. ضع العينة في العدسة الهدف 40H من مجهر epifluorescent دون استخدام زلة الغطاء.
التركيز والتقاط صورة مرجعية. Photobleach منطقة مستهدفة من الاهتمام لمدة 90 ثانية. التقاط صورة بعد photobleaching.
إضافة 10 microliters قطرة من M9 العازلة على الديدان الخيطية photobleached. دع الحيوانات تتعافى لمدة خمس دقائق استخدام قطف الرموش أو ماصة لنقل الديدان الخيطية إلى لوحات NGM الفردية بذر مع 20 ميكرولترات OP50 قطرة في المركز.
التقط صورة لكل عينة كل ساعة تحت منظار مُيكروكروسكوب مُجسِّم. تمت مقارنة الديدان المتحولة من النوع البري والفي 2 التي تعبر عن GFP السيتوبلازمية في جميع أنحاء أنسجة الجسمية باستخدام مروج fe-2 من قبل ، مباشرة بعد الفوتوبلاف ، وخمس ساعات بعد التعافي. الحيوانات من النوع البري تعافى تماما في حين أن المسوخ fe-2 كان قدرة الانتعاش minis.
وبالتالي فإن الديدان البرية من النوع تبدأ تخليق البروتين الطبيعي بعد الاحتراق الضوئي، في حين أن الديدان التي تفتقر إلى عامل بدء الترجمة من الحمض النووي الريبي (MRNA) غير قادرة على القيام بذلك، مما يشير إلى أن معدل استعادة الفلورسنت يوضح معدل تخليق البروتين في الجسم الحي. يمكن استخدام Cycloheximide ، وهو مثبط محدد لترجمة مرنا كمتحكم إيجابي في تثبيط ترجمة البروتين. في الواقع ، لا تسترد الحيوانات المعدلة وراثيا المعالجة بالسيكلهيكسميد التي تعبر عن GFP السيتوبلازمي تحت المروّج الفلورسي عند التحسس الضوئي.
تؤثر هيئات معالجة مرنا على معدل ترجمة البروتين. تم فحص الديدان الخيطية المتحولة من النوع البري وedc-3 التي تعبر عن GFP عموم الخلايا العصبية لقدرتها على التعافي عند التحسس الضوئي المستهدف في المنطقة الرأسية. انتعاش الفلورسنت أبطأ بكثير في الحيوانات edc-3 ناقصة بالمقارنة مع الديدان من النوع البري.
البروتين التوليف التشكيل ضروري للجسم المثلي الكائنات الحية. أثناء الشيخوخة، العالمية وكذلك توليف البروتين محددة هو مضطرب. يتحكم رصيد ترجمة البروتين مباشرة في الشيخوخة والشيخوخة.
وعلى وجه التحديد، فإن المكونات الأساسية لآلية الترجمة وكذلك مكونات التفاعل بين الجسم وP تعجل عملية الشيخوخة. يُبطّل التورّل في بدء الترجمة الشيخوخة. وبالتالي، قياس معدلات تخليق البروتين العالمية من قبل FRAP هو قراءات مباشرة لعملية الشيخوخة.
