Le taux de synthèse des protéines est perturbé pendant la maladie et le vieillissement. La récupération de fluorescence après photobleaching, ou FRAP, permet la mesure du taux de synthèse de protéine in vivo. Nous utilisons des vers C.elegans transparents, qui expriment gfp, comme un modèle pour surveiller la synthèse de protéines nouvelles après photobleaching.
Nous fournissons des lignes directrices pratiques pour mesurer la récupération de la fluorescence en utilisant des vers transgéniques, qui expriment GFP sous différents promoteurs, soit largement exprimés ou dans des cellules ou des tissus spécifiques. En outre, cette méthode offre une surveillance de la vitesse de synthèse des protéines en temps réel. Utilisez un stéréomicroscope disséquant pour évaluer les stades de développement et la croissance des nématodes transgéniques de type sauvage et mutant.
Choisissez 10 larves L4 d’animaux transgéniques sauvages et mutants transportant le reporter fluorescent désiré sur des plaques de croissance des nématodes ensemencées avec E.coli. Incuber et cultiver les nématodes à la température standard de 20 degrés Celsius. Quatre jours plus tard, la plaque contient une population mixte de vers transgéniques.
Sélectionnez et transférez 15 larves L4 de chaque souche sur des plaques OP50 NGM fraîchement ensemencées. Effectuez l’analyse FRAP et surveillez le taux de synthèse des protéines le premier jour de l’âge adulte. Le lendemain, préparez et utilisez des plaques NGM contenant du cycloheximide comme contrôle positif.
Tuer les bactéries en exposant les plaques NGM ensemencées pendant 15 minutes avec la lumière UV. Ajouter le cycloheximide sur le dessus des plaques bactériennes ensemencées trop 500 microgrammes par mL de concentration finale dans le volume de l’agar. Laisser sécher les assiettes.
Transférer les nématodes transgéniques exprimant le GFP sur les plaques contenant des véhicules et des cycloheximides. Incuber les animaux pendant deux heures à la température normale de 20 degrés Celsius. Cueillez et transférez des animaux transgéniques adultes d’une journée dans des plaques NGM individuelles ensemencées avec une baisse op50 de 20 microlitres au centre.
Retirez le couvercle et placez chaque plaque sous une lentille objective de 20 H d’un microscope épifluorescent. Concentrez-vous et capturez une image de référence avant de la photobleaching. Photobleach chaque échantillon pendant 10 minutes.
Capturez une image après le photobleaching. Gardez les animaux dans des plaques NGM individuelles et laissez-les récupérer. Image et enregistrer la récupération de chaque journaliste fluorescent toutes les une heure pendant au moins six heures à un stéréomicroscope épifluorescent.
Préparer 2% coussinets agarose, et ajouter 10 microlitres goutte de tampon M9 au centre de la garniture agarose. Transférer cinq nématodes transgéniques exprimant le GFP cytoplasmique pan-neuronal dans une goutte de tampon M9. Utilisez un cil pour répandre le liquide.
Les animaux affichent des mouvements réduits en moins de deux minutes en raison de l’absorption de M9 dans l’agar. Modifiez la position du nématode à l’aide d’un pic de cils. Placez l’échantillon à la lentille objective de 40 H d’un microscope épifluorescent sans utiliser de glissement de couvercle.
Concentrez-vous et capturez une image de référence. Photobleach une zone d’intérêt ciblée pendant 90 secondes. Capturez une image après le photobleaching.
Ajoutez une goutte de 10 microlitres de tampon M9 sur les nématodes photobleached. Laissez les animaux récupérer pendant cinq minutes. Utilisez le pic de cils ou une pipette pour transférer les nématodes à des plaques NGM individuelles ensemencées avec 20 microlitres OP50 goutte dans le centre.
Capturez une image de chaque échantillon toutes les une heures sous un stéréomicroscope épifluorescent. Les vers mutants de type sauvage et fe-2 exprimant le GFP cytoplasmique dans tous leurs tissus somatiques en utilisant le promoteur fe-2 ont été comparés avant, immédiatement après photobleaching, et cinq heures après rétablissement. Animaux de type sauvage entièrement récupérés tandis que les mutants fe-2 avaient la capacité de récupération minis.
Ainsi, les vers de type sauvage initient la synthèse normale des protéines après photobleaching, tandis que les vers dépourvus de facteur d’initiation à l’ARNm fe-2 sont incapables de le faire, ce qui indique que le taux de récupération fluorescente illustre le taux de synthèse des protéines in vivo. Cycloheximide, un inhibiteur spécifique de la traduction de l’ARNm peut être utilisé comme un contrôle positif pour l’inhibition de la traduction des protéines. En effet, les animaux transgéniques traités au cycloheximide exprimant le GFP cytoplasmique sous le promoteur ne récupèrent pas leur fluorescence lors du photobleaching.
les organismes de traitement de l’ARNm influent sur le taux de traduction des protéines. Des nématodes mutants de type sauvage et edc-3 exprimant gfp pan-neuronally ont été examinés pour leur capacité de rétablissement sur le photobleaching ciblé à la région de tête. La récupération fluorescente est beaucoup plus lente chez les animaux déficients en edc-3 que chez les vers de type sauvage.
La modulation de synthèse des protéines est essentielle pour l’homéostasie de l’organisme. Pendant le vieillissement, la synthèse globale et spécifique des protéines est perturbée. L’équilibre de traduction des protéines contrôle directement la sénescence et le vieillissement.
Plus précisément, les composants de base des machines de traduction ainsi que les composants d’interaction P-body accélèrent le processus de vieillissement. La perturbation de l’initiation à la traduction ralentit le vieillissement. Par conséquent, la mesure des taux mondiaux de synthèse des protéines par FRAP est une lecture directe du processus de vieillissement.
