Скорость синтеза белка возмущена во время болезни и старения. Восстановление флуоресценции после фотоблейлинга, или FRAP, позволяет измерять скорость синтеза белка in vivo. Мы используем прозрачных червей C.elegans, которые выражают GFP, в качестве модели для мониторинга синтеза нового белка после фотоотливания.
Мы предоставляем практические рекомендации для измерения восстановления флуоресценции с помощью трансгенных червей, которые выражают GFP под различными промоутерами, либо широко выражены или в конкретных клетках или тканях. Кроме того, этот метод предлагает мониторинг скорости синтеза белка в режиме реального времени. Используйте рассечение стереомикроскопа для оценки стадий развития и роста диких и мутантных трансгенных нематод.
Выберите 10 L4 личинок дикого типа и мутант трансгенных животных, несущих желаемого флуоресцентного репортера на нематод роста медиа пластин, посеянных с E.coli. Инкубировать и выращивать нематод при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию. Четыре дня спустя, пластина содержит смешанную популяцию трансгенных червей.
Выберите и перенесите 15 личинок L4 каждой деформации на свежесеянные пластины OP50 NGM. Выполните анализ FRAP и следите за скоростью синтеза белка в первый день взрослой жизни. На следующий день подготовьтесь и используйте циклохэксимидсодержащие NGM пластины в качестве положительного контроля.
Убейте бактерии, подвергая семенами NGM пластин в течение 15 минут с ультрафиолетовым светом. Добавить циклохексимид на верхней части бактериальных семян пластин слишком 500 микрограмм на мл конечной концентрации в объеме агара. Дайте тарелкам высохнуть.
Передача трансгенных нематод, выражающих GFP на транспортном средстве и циклохексимидсодержащих пластин. Инкубировать животных в течение двух часов при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию. Выберите и перенесите однодневных взрослых трансгенных животных на отдельные ngM пластины, посеянные с 20 микролитров OP50 падение в центре.
Снимите крышку и поместите каждую пластину под объектив 20H объективного эпифлуоресцентного микроскопа. Сосредоточьтесь и захватит эталонное изображение перед фотоотчетом. Photobleach каждый образец в течение 10 минут.
Захват изображения после фотоотчета. Храните животных в отдельных пластинах NGM, и пусть они восстанавливаются. Изображение и записывать восстановление каждого флуоресцентного репортера каждый час, по крайней мере шесть часов в эпифлюоресцентный стереомикроскоп.
Подготовка 2%agarose колодки, и добавить 10 микролитров падение M9 буфера в центре агарозы площадку. Перенесите пять трансгенных нематод, выражаюющих пан-нейронную цитоплазмическую GFP, в каплю буфера M9. Используйте ресницы для распространения жидкости.
Звери отображают уменьшенные движения в течение двух минут из-за поглощения M9 в агар. Измените положение нематод с помощью выбора ресниц. Поместите образец на объектив 40H объективного эпифлуоресцентного микроскопа без использования крышки скольжения.
Сосредоточьтесь и захватит эталонное изображение. Photobleach целевой области интереса в течение 90 секунд. Захват изображения после фотоотчета.
Добавьте 10 микролитров капли буфера M9 на фотоотлитных нематод. Пусть животные, чтобы восстановить в течение пяти минут. Используйте ресницы забрать или пипетки для передачи нематод на отдельные пластины NGM посеяны с 20 микролитров OP50 падение в центре.
Захват изображения каждого образца каждый час под эпифлюоресцентным стереомикроскопом. Дикие и фе-2 мутантных червей, выражаюющих цитоплазмические GFP на протяжении всей их соматических тканей с помощью fe-2 промоутер были сравнены раньше, сразу после фотоотверга, и пять часов после восстановления. Дикие животные полностью выздоровели, в то время как мутанты fe-2 имели способность к восстановлению мини.
Таким образом, черви дикого типа инициируют нормальный синтез белка после фотоблейбинга, в то время как черви, не имеющие фактора инициирования перевода мРНК fe-2, не в состоянии сделать это, указывая, что скорость восстановления флуоресцентных иллюстрирует скорость синтеза белка in vivo. Циклохексимид, специфический ингибитор перевода мРНК, может быть использован в качестве положительного контроля для ингибирования перевода белка. Действительно, циклохексимид-обработанные трансгенные животные, выражаюющие цитоплазмический GFP под промоутером, не восстанавливают свою флуоресценцию при фотоблехинге.
органы обработки мРНК влияют на скорость перевода белка. Дикий тип и edc-3 мутант нематод, выражаюющих GFP пан-нейронально были рассмотрены на их способность к восстановлению на целевых photobleaching в области головы. Флуоресцентное восстановление гораздо медленнее у эдк-3-дефицитных животных по сравнению с дикими червями.
Модуляция синтеза белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Во время старения, глобальный, а также специфический синтез белка возмущен. Баланс перевода белка непосредственно контролирует старение и старение.
В частности, основные компоненты механизма перевода, а также взаимодействующие компоненты P-тела ускоряют процесс старения. Возмущение инициации перевода замедляет старение. Таким образом, измерение глобальных скоростей синтеза белка FRAP является прямым считыванием процесса старения.
