وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل كانساس INBRE، P20GM103418 إلى لي وزينوفييفا وR35GM124828 إلى زينوفييفا. نشكر مين هان لتقاسم بسخاء المضادة AIN-1 الأجسام المضادة. تم توفير بعض السلالات المستخدمة في سياق هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) ، بتمويل من مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440).

1. جمع عينة دودة
<ol><li>مرحلة مختلطة البذور أومتزامنة 13 الديدان على لوحات صلبة NGM في درجة الحرارة المطلوبة والسماح للديدان أن تنمو حتى المرحلة المرجوة. للحصول على نمو وصيانة C. elegans الأساسي، يرجى الاطلاع على Stiernagle وآخرون وPorta-de-la-Rivaوآخرون.</li>
	<li>جمع الديدان في أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل عن طريق غسل لوحات دودة مع العازلة M9.</li>
	<li>بيليه الديدان عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 دقيقة والتخلص من supernatant. ملاحظة: حجم بيليه الدودة لإعداد استخراج ما بين 100 ميكرولتر و 500 ميكرولتر. ويوصى بيليه 300 ميكرولتر من الديدان معبأة لتجارب المناعة المصب وعادة ما تسفر عن ~ 4.5 ملغ من البروتين الكلي، في حين أن بيليه 500 ميكرولتر سوف تسفر عن ~ 7.5 ملغ من البروتين الكلي.</li>
	<li>قم بإجراء عمليات غسل إضافية من 3 إلى 5 باستخدام المخزن المؤقت M9 (انظر الجدول 1)أو حتى لا يعود الناسخة الفائقة غائمة.</li>
	<li>إجراء غسل نهائي واحد مع DDH2O.</li>
	<li>نقل بيليه دودة فضفاضة إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل وتدور إلى أسفل في 400 × ز في RT لمدة 2 دقيقة. تجاهل ما تبقى من الناطقة للحصول على بيليه دودة معبأة والمضي قدما لاستخراج إعداد. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. الكريات دودة قد تكون فلاش المجمدة في النيتروجين السائل على الفور وتخزينها في -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل. يرجى ملاحظة أنه لا يمكن إذابة الكريات الدودة إلا مرة واحدة ولا يمكن إعادة تجميدها.</li>
</ol>2. استخراج إعداد بيليه دودة
ملاحظة: يجب إجراء إعداد المستخلص على الجليد أو عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
<ol><li>إذا تجمدت، إذابة دودة بيليه على الجليد. ملاحظة: إذا لم يتم الحصول على حجم الكريات دودة معبأة المطلوب من 300 ميكرولتر أثناء جمع العينة، يمكن الجمع بين الكريات أصغر متعددة حتى ما يكفي من المواد موجودة لمزيد من الاستخراج.</li>
	<li>إضافة حجم متساو من الجليد الباردة 2x تحلل العازلة (60 mM HEPES، درجة الحموضة = 7.4، 100 مللي متر كلوريد البوتاسيوم، 0.1٪ تريتون X، 4 M M كلوريد المغنيسيوم، 10٪ الجلسرين، 2 MDTT مع مثبط RNase، مثبط البروتيز، ومثبطات فوسفاتاز؛ انظر الجدول 1)ودوامة أو ماصة صعودا وهبوطا لخلط. تدور أنبوب (ق) إلى أسفل لجمع الخليط في الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
	<li>نقل الخليط إلى أنبوب 1.5 مل RNase خالية تحتوي على الخرز المعدني (انظر جدول المواد)ووضع العينة في المتجانس مطحنة حبة (انظر جدول المواد) في 4 درجة مئوية. تأكد من أن يتم تشديد قبعات أنبوب والعينات متوازنة داخل المتجانس.</li>
	<li>تجانس العينة بأعلى سرعة (ضبط 12) لمدة 4 دقائق.</li>
	<li>قم بإزالة العينة من الخرز ووضعها في أنبوب طرد صغير جديد سعة 1.5 مل. بدلا من ذلك، يمكن استخدام مغناطيس مزود بالمتجانس لإزالة الخرز من العينة.</li>
	<li>تدور أسفل استخراج في 19،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية لتوضيح استخراج البروتين.</li>
	<li>نقل supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل على الجليد، مع تجنب ترحيل الأبيض، عجل غائم أن يشكل على رأس العينة. العملاق هو الآن المقتطف الموضح. ملاحظة: حفظ 10 ميكرولتر من استخراج أوضح لتحديد تركيز البروتين الكلي.</li>
	<li>استخدام استخراج فورا للتجارب التالية أو فلاش تجميد استخراج في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية. ملاحظة: قد يكون البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين المستخلصات في درجة حرارة منخفضة للغاية (-80 درجة مئوية الفريزر أو النيتروجين السائل لمدة 6 أشهر تقريبا). يمكن إذابة المستخلصات المجمدة مرة واحدة ولا يمكن إعادة تجميدها.</li>
	<li>تحديد تركيز البروتين الكلي للاستخراج باستخدام مجموعة اختبار تركيز البروتين المتوافقة مع المنظفات (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</li>
</ol>3. التكفير المناعي
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات التهيئة المناعية لإعداد المستخلص على الجليد أو عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. فمن المستحسن استخدام 2 ملغ من البروتين الكلي لكل مناعة. ومع ذلك، تم إجراء رئاسات مناعية ناجحة مع 0.8-1 ملغ من البروتين الكلي. استخدم دائما مستخلصات البروتين الطازجة أو المذابة حديثا. ويرد البروتوكول التالي لأداء التوفير المناعي من 2 ملغ من البروتين الكلي، أو تجربة واحدة مناعة. يمكن زيادة كمية الخرز والأجسام المضادة أو تقليلها وفقا لذلك لعينات متعددة أو إذا تم استخدام كمية مختلفة من مستخلص البروتين.
<ol><li>ضع أو إذابة مستخلص البروتين على الجليد. يمكن تخفيف العينة إلى 10 ملغم /مل أو 5 ملغم/مل مع عازل تحلل 1x بارد الجليد (انظر الجدول 1).</li>
	<li>Resuspend الخرز المغناطيسي عن طريق عكس ونقل 150 ميكرولتر من تعليق الخرز 50٪ في أنبوب 1.5 مل. ممغنطة الخرز على الجليد ضد موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة أو حتى الحل واضح. تجاهل الناتنات الفائق.</li>
	<li>قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي واغسل الخرز في مخزن تحلل 1x باستخدام مجلدين (أي 300 ميكرولتر) من ملاط الخرز. كرر غسل 2x لما مجموعه ثلاثة يغسل.</li>
	<li>Resuspend الخرز في 150 ميكرولتر من الجليد الباردة تحلل العازلة.</li>
	<li>نقل 75 ميكرولتر من الطين حبة إلى 2 ملغ من استخراج البروتين واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف. حفظ تعليق حبة المتبقية على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق. ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتقليل ربط البروتين غير محددة إلى حبات أثناء خطوة المناعة.</li>
	<li>ضع الأنبوب مع عينة على الحامل المغناطيسي على الجليد لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتم ممغنط الخرز بالكامل وتكون العينة واضحة. نقل supernatant إلى أنبوب 1.5 مل جديدة; لا تزعج الخرز. هذا هو ليسات البروتين المخلى مسبقا. حفظ 10٪ من العينة لتحليل لطخة الغربية.</li>
	<li>إضافة 20 ميكروغرام من تقارب الأجسام المضادة المنقى إلى lysate precleared واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف. ملاحظة: كمية الأجسام المضادة المستخدمة في التكفير المناعي محددة للأجسام المضادة والبروتين ويجب تحديدها تجريبيا لضمان فعالية المناعة للبروتين المستهدف.</li>
	<li>أضف المتبقية 75 ميكرولتر من تعليق الخرز مغسولة مسبقا (الخطوة 3.5) إلى خليط الأجسام المضادة / ليسات واحتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية مع التحريض لطيف.</li>
	<li>ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي على الجليد لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتم ممغنط الخرز بالكامل وتكون العينة واضحة. حفظ supernatant لتحليل لطخة الغربية (اختياري).</li>
	<li>غسل الخرز التي تحتوي على 3x 3x المناعي في 450 ميكرولتر من عازلة غسل (30 mM HEPES، درجة الحموضة = 7.4، 100 mM كلوريد البوتاسيوم، 0.1٪ تريتون X، 2 MM كلوريد المغنيسيوم، 10٪ الجلسرين، 1 mM DTT؛ انظر الجدول 1) على الجليد. ملاحظة: يمكن إجراء عمليات غسيل إضافية إذا كانت ظروف الغسيل أكثر صرامة مفضلة.</li>
	<li>Resuspend بيليه حبة في 20 ميكرولتر من 2x SDS / BME البروتين هلام تحميل العازلة (انظر جدول المواد)وdnature عن طريق الغليان في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل تحميل على هلام SDS-PAGE. بدلا من ذلك، يمكن تخزين عينات مشوهة في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. ملاحظة: يمكن حفظ جزء من مناعة الخرز لعزل الحمض النووي الريبي المصب، إذا رغبت في ذلك.</li>
</ol>4. غرب كشف بقعة من عينات الملكية الفكرية
<ol><li>تحميل عينات IP على هلام SDS-PAGE (انظر جدول المواد). تجنب نقل الخرز عن طريق وضع أنابيب IP على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة قبل طموح العينة.</li>
	<li>تنفيذ النشاف الغربي15،16 والأجسام المضادةتلطيخ 16 مع التعديلات التالية : تمييع الأجسام المضادة ALG - 117 1:500 في 5 ٪ الحليب الجاف غير الدهني (NFDM) ؛ تمييع الأجسام المضادة HRPK-12 1:1,000 في 5٪ NFDM؛ وتمييع الأجسام المضادة AIN-118 1:10,000 في 5٪ NFDM. واستخدمت الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.</li>
	<li>الكشف عن النطاقات مع chemiluminescence القائم على HRP (انظر جدول المواد).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

C. elegans هو نموذج ممتاز لدراسة الأسئلة الأساسية في الخلية والجزيئية والبيولوجيا التنموية19. بالإضافة إلى قوتها كنظام نموذج وراثي ، فإن C. elegans قابلة للنهج الكيميائية الحيوية ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، التكفير المناعي للبروتين وفرط المناعة. إحدى العقبات المحتملة عند إجراء تجارب السهب المناعي هي نقص الأجسام المضادة الخاصة بالبروتينات ذات الاهتمام. إذا لم يتوفر أي جسم مضاد، يمكن توليد أجسام مضادة مخصصة متعددة النسيلة أو أحادية النسيلة. ومع ذلك ، سمحت الابتكارات الأخيرة في تكنولوجيا تحرير الجينوم للباحثين بإدخال الطفرات بسرعة أو وضع علامة على جينات C. elegans الذاتية20،21، مما يسهل الدراسات التي تكشف عن التفاعلات الوراثية والوظيفية والجسدية بين الجينات والبروتينات المشفرة. وعلى وجه التحديد، فإن وضع علامات بوساطة CRISPR/Cas9 لجينات سي إليغانس في الموضع الداخلي قد قلل من اعتماد تجارب التكسير المناعي على توافر الأجسام المضادة، مما جعل تجارب نقص المناعة المشتركة أكثر جدوى بكثير. C. يمكن وضع علامات على جينات elegans بمجموعة متنوعة من العلامات التي تتراوح بين علامات الفلورسنت مثل GFP أو mCherry إلى العلامات الصغيرة مثل FLAG و HA. الأجسام المضادة التي تعترف بهذه العلامات متاحة بسهولة تجاريا، مما يسهل دراسات التفاعلات البروتين البروتين عن طريق نهج السهونة المناعية.
ويمكن تنفيذ البروتوكول المقدم، المبين في الشكل 1،لعدد صغير من العينات أو توسيع نطاقه، مما يسمح بما يصل إلى 24 إعدادا للعينة في كل مرة. في حين أن التوصيفات الأولية للتفاعلات البروتين البروتين عن طريق المناعة وعادة ما تتم في خلفيات نوع البرية في ظل ظروف النمو العادية، ودراسات المتابعة تتطلب في كثير من الأحيان اختبار التفاعلات البروتين البروتين في مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية أو في ظل ظروف نمو مختلفة. القدرة على إعداد مقتطفات متعددة في وقت واحد يوفر الوقت، والأهم من ذلك، يضمن استخراج اتساق إعداد بين عينات مختلفة. هناك حاجة دائما إلى التحكم السلبي ، مع كون التحكم المثالي طفرة فارغة في الترميز الجيني للبروتين المناعي المثير للاهتمام (انظر الشكل 3 والشكل 4 على سبيل المثال).
يسمح هذا البروتوكول استخراج لإعداد استخراج البروتين السريع من عينات C. elegans وقابلة للمقارنة مع التجانس القائم على حبة الزركونيوم8. يمكن توسيع نطاق تجانس الخرز بشكل عام إلى عدة تحضيرات عينة متزامنة باستخدام مجموعة متنوعة من متجانسات مطحنة الخرز أو معدات مماثلة. بعض التجانس مطحنة حبة أكثر اقتصادا قد يقلل من عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد، ومع ذلك. بدلا من ذلك، بروتوكول استخراج المقدمة متوافق مع إعداد استخراج dounce القائم، والذي يمثل بديلا اقتصاديا. في حين لم يتم اختبار متجانسات مطحنة حبة مختلفة، ومعظمها من المرجح أن تكون متوافقة مع هذا البروتوكول استخراج البروتين، طالما يتم تحقيق تعطيل كامل للعينات C. elegans.
كما هو معروض، هذا البروتوكول إعداد استخراج متوافق مع تجارب المصب متعددة، بما في ذلك البروتين المناعي2 وmicroRNA سحب أسفل12 ويسمح لجمع المصب من كل من البروتين ومكونات الحمض النووي الريبي. كما أنه يستخرج بكفاءة كل من البروتينات النووية والسيتولازمية (الشكل 2، الشكل 3، والشكل 4). وبالمثل، يسمح بروتوكول التوفير المناعي المقدم بعزل الحمض النووي الريبي عن البروتين المرتبط بالمناعة. في حين تم تطوير بروتوكول التنامي في الأصل لتحديد تفاعل البروتين ALG-1 ، يمكن تكييف الطريقة لاختبار التفاعلات بين أي بروتينات ذات أهمية. في الواقع، عملت ظروف التهيئة المناعية المستخدمة بشكل جيد بنفس القدر ل ALG-1(الشكل 3)و HRPK-1(الشكل 4). هذا البروتوكول هو نقطة انطلاق ممتازة لتثبيط المناعة من البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه قد تكون هناك حاجة إلى بعض التغييرات في تكوين العازلة لبروتينات أخرى ذات أهمية. وقد تعتمد التغيرات على الخصائص الفيزيائية والكيميائية الحيوية للبروتين الذي يهم ويجب تنفيذها على أساس كل حالة على حدة.
بمجرد أن يتم إعادة سرعة البروتين المستهدف (هنا، ALG-1 أو HRPK-1) مناعة، يمكن استخدام النشاف الغربي لاختبار البروبروسيبات المناعية المشتركة لمتفاعلات بروتين محددة.
وبدلا من ذلك، يمكن أن تخضع البروسيبيتات المناعية المكروبة لتحليل الطيف الكتلي لتحديد جميع البروتينات المتفاعلة المفترضة. ويمكن بعد ذلك فحص التفاعلات المؤكدة بين التخصصات المناعية المشتركة في مجموعة متنوعة من الخلفيات أو الظروف الوراثية لتحديد التنظيم المحتمل للتفاعل المحدد. على سبيل المثال، لتحديد ما إذا كان HRPK-1 يلعب دورا في تجميع ALG-1/AIN-1 miRISC، تم تقييم ALG-1-AIN-1 coprecipitation في خلفية من النوع البري وفي غياب HRPK-1 (الشكل 3). تم العثور على hrpk-1 أن يكون الاستغناء عن ALG-1/AIN-1 التفاعل2 (الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 لتوليد طفرات حذف نقطة واحدة أو المجال في البروتينات ذات الاهتمام. إعادة اختبار قدرة المسوخ المولدة على الانسداد مع تفاعل البروتين يمكن أن تكشف عن المجالات أو المخلفات التي تتوسط التفاعل المادي. يمكن أن تسفر هذه الدراسات المستقبلية عن معلومات لا تقدر بثمن حول آلية وظيفة البروتين وتنظيمه. ويمكن لهذه النهج، إلى جانب قوة علم الوراثة C. elegans، أن توفر رؤى هامة في العمليات الجزيئية الأساسية التي تحكم نمو الحيوان والوظيفة الخلوية.

يمكن أن يكون تحديد التفاعلات الجزيئية الكلية لبروتين مهم أمرا أساسيا لمعرفة المزيد عن وظيفته. يمكن استخدام تجارب التهيئة المناعية والمناعة المشتركة لتحديد التفاعل الكامل للبروتين من خلال النهج البروتيومية واسعة النطاق1 أو لاختبار قدرة البروتين على وجه التحديد على الانسداد مع تفاعل مفترض. في C. elegans، تم استخدام كلتا الطريقتين بنجاح لمعرفة المزيد عن نشاط مجموعة متنوعة من البروتينات ، بما في ذلك تلك التي تعمل بشكل وثيق مع microRNAs لتنظيم التعبير الجيني2و3و4. تتمتع تجارب نقص المناعة المشترك بميزة اختبار التفاعلات بين البروتين والبروتين في بيئتها الخلوية الأصلية ، ولكن إعداد الاستخراج يمكن أن يكون صعبا ويستغرق وقتا طويلا. من الضروري إجراء تحليل فعال للعينة ، ولكن يجب توخي الحذر لتقليل اضطراب التفاعلات بين البروتين والبروتين. أساليب مثل douncing5، سونيكيشن6، Balchالتجانس 7، وzirconia الخرز التجانس8،9 وقد استخدمت لإعداد بنجاح مقتطفات البروتين الكلي C. elegans. هذه الأساليب، باستثناء تجانس حبة الزركونيا، لها قيود من حيث عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد. المقدمة هي طريقة بديلة التي يمكن توسيعها بسهولة للسماح لارتفاع الإنتاجية، وإعداد استخراج البروتين السريع من عينات C. elegans تليها التهيئة المناعية المشتركة. على وجه التحديد، يمكن أن تعد هذه الطريقة ما يصل إلى 24 عينة في وقت واحد، مما يقلل إلى حد كبير من الوقت اللازم لاستخراج التحضير. وعلى النقيض من ذلك، على سبيل المثال، يسمح douncing عادة بإعداد عينة واحدة فقط في كل مرة. يمكن استخدام طريقة استخراج هذه لإعداد مقتطفات من أي مرحلة تنموية من C. elegans.
وصف هو إجراء خطوة بخطوة لجمع عينات الحيوانات، وإعداد استخراج، والمناعة، وعرض البيانات النشاف الغربية لتأكيد سحب البروتين الناجح والكشف عن البروتين المشترك من المناعية ذات الاهتمام. ولإثبات فعالية البروتوكول، أجريت تجربتان مشتركتان في مجال المناعة بين 1) ميكرورنا أرغونات ALG-1 و AIN-1، وهو متجانس GW182؛ و20000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 و 2) ALG-1 و HRPK-1، وهو التفاعل ALG-1 التي تم تحديدها حديثا2. ALG-1 و AIN-1 هي البروتينات الأساسية التي تشكل مجمع إسكات الناجمة عن الحمض النووي الريبي الدقيق (miRISC) والتفاعل بين هذين البروتينينراسخة 10,11. كان بروتوكول إعداد المستخلصات فعالا في تجربة التهيئة المشتركة للمناعة ALG-1-AIN-1. كما أكد هذا البروتوكول بنجاح التفاعل بين ALG-1 والمتفاعل الذي تم تحديده حديثا، HRPK-12.
باختصار، تصف المخطوطة بروتوكول إعداد استخراج C. elegans الذي يمكن توسيع نطاقه لمعالجة 24 عينة في وقت واحد إلى جانب بروتوكول التأهب المناعي المشترك الذي يمكن استخدامه لتحديد التفاعلات الجديدة أو المؤكدة المفترضة بين البروتينات. بروتوكول إعداد استخراج متوافق مع عدد من التجارب المصب، بما في ذلك البروتين المناعي2 وmicroRNA الانسحابات12. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف بروتوكول التهيئة المناعية لاختبار التفاعلات بين أي اثنين أو أكثر من البروتينات الذاتية المنشأ، الموسومة داخليا، أو المفروشة أكثر من قيمتها C. elegans في مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>GFP antibody (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 wild type</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Assay Kit I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

وكثيرا ما تستخدم أساليب الإفراط في المناعة لدراسة التفاعلات بين البروتين والبروتين. تأكيد التفاعلات البروتين البروتين المفترض أو تحديد جديدة يمكن أن توفر معلومات لا تقدر بثمن حول وظيفة البروتين من الفائدة. تتطلب بعض الطرق التقليدية لاستخراج التحضير في كثير من الأحيان تقنيات كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. هنا، يوصف بروتوكول إعداد استخراج معدلة باستخدام متجانس مطحنة حبة والخرز المعدني كبديل سريع لأساليب إعداد البروتين التقليدية. تتوافق طريقة إعداد المستخلص هذه مع دراسات التأهب المشترك في المصب. على سبيل المثال، تم استخدام هذه الطريقة بنجاح في المشاركة في المناعة C. elegans ميكرورنا أرغونات ALG-1 واثنين من المتفاعلين المعروفين ALG-1: AIN-1، و HRPK-1. يتضمن هذا البروتوكول وصفا لجمع عينات الحيوانات، وإعداد الاستخراج، وتوضيح الاستخراج، و وبروتين مناعة. يمكن تكييف البروتوكول الموصوف لاختبار التفاعلات بين أي اثنين أو أكثر من البروتينات الذاتية المنشأ أو الموسومة داخليا أو المفروشة بشكل مفرط C. elegans في مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية.

تم استخدام هذا البروتوكول (مخطط في الشكل 1)بنجاح للحصول على مقتطفات البروتين الكلي C. elegans (الشكل 2) لprecipitation المصب من عدةبروتينات 2 (الشكل 3 والشكل 4). وكان بروتوكول التجانس مطحنة حبة عرضت قابلة للمقارنة في استخراج البروتين الكلي لأساليب أساسها dounce (الشكل 2) واستخراجها بكفاءة النووية (COL-19::GFP(NLS) (الشكل 2) والبروتينات السيتوبلازمية (الشكل 3 والشكل 4). تم استخراج عينات متعددة من مختلف الأحجام في وقت واحد(الشكل 2). بروتينات الأرغونات تتفاعل مع أعضاء عائلة البروتين GW182، وتشكيل miRISCs التي تربط إلى RNAs رسول الهدف وقمع تعبيرهم10. ويبين الشكل 3 نجاح التوفير المناعي المشترك لمكونات الميكريسك الأساسية ALG-1 و AIN-1، بما يتفق مع التقارير السابقة11و17. وفي الآونة الأخيرة، بذلت جهود لتحديد تفاعلات بروتينية إضافية من أرغوناتALG-1 3 من أجل معرفة المزيد عن كيفية تنظيم التكوين الحيوي والنشاط من قبل العوامل المساعدة. تم تحديد البروتين الرابط للجيش الملكي النيبالي HRPK-1 في ال 1 ALG-1 مناعة3. وقد تأكد هذا التفاعل مؤخرا في تجربة تبادل HRPK-1المناعية 2. نجحت بروتوكولات استخراج والمناعة المعروضة في استعادة ALG-1 في البروتيبات المناعية المشتركة HRPK-1(الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التفاعل ALG-1-AIN-1 في مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية وHRPK-1 تبين أن تكون غير ضرورية ل ALG-1/AIN-1 miRISCالتجمع 2 (الشكل 3). وتقدم أرقام تكميلية لإظهار الغشاء الكامل بحث (الشكل التكميلي 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> الشكل 1: تخطيط سير العمل ل C. elegans استخراج إعداد والمناعة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> الشكل 2: مقارنة لطخة غربية ل GFP المترجمة النووية، COL-19::GFP(NLS)، ومستويات في عينات منسدلة ومتجانسة من 250 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من الكريات دودة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> الشكل 3: GW182 homolog AIN-1 الكوليسترول المناعي المشترك مع ALG-1. النشاف الغربي لبروتينات ALG-1 و AIN-1 في الكوليسترول المناعي ALG-1. ولم تتأثر نسبة المناعة المشتركة ALG-1/AIN-1 بغياب الهربك-1. الإدخال = 10٪ من الملكية الفكرية. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> الشكل 4: الكوليسترول المناعي المشترك من ALG-1 مع HRPK-1. يظهر النشاف الغربي ل HRPK-1 و ALG-1 في الكوليسترول المناعي HRPK-1. الإدخال = 10٪ من الملكية الفكرية. * يشير إلى سلسلة الأجسام المضادة الثقيلة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">المخزن المؤقت M9 (1 لتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 جم</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na 2HPO4
</td>
			<td>6 جم</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناكل</td>
			<td>5 جم</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م مغسو4
</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>حتى 1 لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x تحلل العازلة (5 مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (رقم الحموضة 7.4)</td>
			<td>200 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 م كلكل</td>
			<td>250 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>10٪ تريتونإكس</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م م م2
</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>100٪ الجلسرين</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>حتى 5 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>إضافة جديدة:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 متر دي.ت.ت</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>مثبط بروتياز خالية من EDTA</td>
			<td>1 قرص</td>
		</tr>
<tr>
<td>كوكتيل مثبط فوسفاتاز 2</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>كوكتيل مثبط فوسفاتاز 3</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x تحلل المخزن المؤقت</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">تمييع 2x تحلل العازلة مع حجم متساو من ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x غسل العازلة 10 مل)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (رقم الحموضة 7.4)</td>
			<td>300 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 م كلكل</td>
			<td>500 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>10٪ تريتونإكس</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 م م م2
</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>100٪ الجلسرين</td>
			<td>1 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>حتى 10 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 متر دي.ت.ت</td>
			<td>20 ميكرولتر (أضف طازجا)</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: وصفات
الشكل التكميلي 1- الزيادة في النسبة إلى 100 في المائة من ال تظهر الأغشية الغربية الكاملة المستخدمة لتوليد الأرقام 2-4. (أ) فحص غشاء الشكل 2. لاحظ أنه تم قطع الغشاء للسماح بالتحقيق المتزامن ل GFP و Tubulin ، مما يقلل من حجم البقعة الإجمالي. (ب) فحص غشاء الشكل 3. (ج) فحص الغشاء لل الشكل 3. * يدل على الأجسام المضادة سلسلة ثقيلة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

يصف هذا الأسلوب بروتوكولا لإعداد استخراج البروتين عالي الإنتاجية من عينات Elegans Caenorhabditis وما تلاها من نقص المناعة.

إعداد استخراج البروتين و إعادة التأهيل المناعي المشترك من الإيغانات Caenorhabditis

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.8K Views.  Kansas State University. يصف هذا الأسلوب بروتوكولا لإعداد استخراج البروتين عالي الإنتاجية من عينات Elegans Caenorhabditis وما تلاها من نقص المناعة.

Video: Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام إليجانات Caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Cancer Research

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Biochemistry

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Biology

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

الجمع بين النوكليوتيدات والاستخراج البروتين في ايليجانس كاينورهابديتيس

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

<meta charset="utf8"></head><body>القياس الكمي لتراكم البروتين غير القابل للذوبان في Caenorhabditis elegans أثناء الشيخوخة مع سير عمل اكتساب جديد مستقل عن البيانات

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

القياس الكمي لتراكم البروتين غير القابل للذوبان في Caenorhabditis elegans أثناء الشيخوخة مع سير عمل اكتساب جديد مستقل عن البيانات

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

استخراج على نطاق صغير من Caenorhabditis elegans الحمض النووي الجينومي

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

إعداد استخراج البروتين و إعادة التأهيل المناعي المشترك من الإيغانات Caenorhabditis

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام إليجانات Caenorhabditis

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

الجمع بين النوكليوتيدات والاستخراج البروتين في ايليجانس كاينورهابديتيس

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

القياس الكمي لتراكم البروتين غير القابل للذوبان في Caenorhabditis elegans أثناء الشيخوخة مع سير عمل اكتساب جديد مستقل عن البيانات

القياس الكمي لتراكم البروتين غير القابل للذوبان في Caenorhabditis elegans أثناء الشيخوخة مع سير عمل اكتساب جديد مستقل عن البيانات

استخراج على نطاق صغير من Caenorhabditis elegans الحمض النووي الجينومي