يقيس البروتوكول الموصوف هنا ترسب الدم الضامة الرئوية بعد التعرض لأوزون ملوث الهواء. وتشير هذه البيانات إلى أن التعرض للأوزون يقلل من التنافر الضام السنخي، وبالتالي يمكن أن يكون آلية للسبب في ارتفاع مستويات الأوزون تزيد من حدوث أمراض الرئة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح في تقييم في الجسم الحي من الجزيئات الضامة الظهارة دون أي التلاعب الجسم الحي السابق من الضامة التي قد تغير نمط الظاهري أو وظيفتها.
وقد كشفت هذه التقنية عن آلية جديدة لا يمكن من خلالها للرئة إصلاح نفسها بعد التعرض لتلوث الهواء. بالإضافة إلى ذلك، قد تكشف هذه التقنية عن مسارات جديدة للأهداف التي تغير من فرط الوفيات في الرئة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نموذج من إصابات الرئة أو الالتهاب.
ومع ذلك، فإن المستخدم بحاجة إلى تحسين عندما يكون من الأفضل لتقييم تليف الدم في الرئة بعد الإصابة. يمكن أن يكون أداء الطموح البلعوم تحديا من الناحية الفنية. أنصح العمل مع موظفي الطب البيطري الخاص بك للتأكد من أن لديك الأمثل الأسلوب الخاص بك لأداء هذا الإجراء.
تبدأ بزرع خلايا Jurkat T في ثقافة الخلية القاعدية المتوسطة تكمل وفقا لاتجاهات المخطوطة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. خلايا Jurkat T هي خط خلية تعليق يمكن الحفاظ عليه من خلال التمرير إلى وسائل الإعلام الإحتماء قبل الإحترار كل ثلاثة أيام. إعداد الخلايا المبرمجة من خلال النمو لهم إلى 90٪ التقاء الذي يستغرق ثلاثة إلى أربعة أيام بعد passaging.
تنمو الخلايا في خمس قارورة T75 للحصول على عدد كاف من الخلايا لهذا البروتوكول. مرة واحدة الخلايا جاهزة، واستنشاق محتويات قارورة حوالي 24 ملليلتر ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. عد الخلايا باستخدام تلطّخات Trypan Blue ومقياس للهيموسيتات.
بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 271 مرات ز لمدة خمس دقائق وتجاهل supernatant. ثم، resuspend الخلايا في وسائل الإعلام للحصول على ثلاثة ملايين خلية لكل ملليلتر. Aliquot الخلايا إلى 100 من 20 ملليمتر أطباق زراعة الأنسجة عن طريق نقل خمسة ملليلتر من الخلايا في الطبق الواحد.
إعداد ما يقرب من تسعة أطباق الثقافة. ضعي طبق واحد جانباً كتحكم غير مكشوف وتعرّض الأطباق المتبقية للأشعة فوق البنفسجية. تعيين crosslinker الأشعة فوق البنفسجية إلى مستوى الطاقة الصحيح عن طريق الضغط على زر الطاقة وإدخال 600 مع لوحة الأرقام. تشع جميع الأطباق مع الخلايا باستثناء السيطرة على التأكد من إزالة الغطاء العلوي للطبق ثقافة الأنسجة أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
ثم، احتضان جميع الأطباق في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة، والجمع بين جميع الخلايا المشعة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر و بيليه لهم من قبل الطرد المركزي في 271 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل السوبر و resuspend الخلايا في 24 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة.
الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى وإزالة فائقة. إعداد الخلايا لجراة الفئران عن طريق إعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني في التركيز المناسب. بمجرد تخدير الماوس بشكل صحيح، وضعه في وضعية سوبين شبه مفكك.
استخدام سلسلة الجراحية تعادل بين أوتاد على لوحة ورقة الاكريليك مائلة لتعليق الماوس من قبل فواصل maxillary. استخدام زوج من ملقط غير متطاولة حادة للاستيلاء على طفيفة وسحب لسان الماوس وغرس الخلايا المبرمج في تجويف الفم مع ماصة P200. الجرعات الناجحة عندما الفئران جعل الضوضاء طقطقة ثانية أو ثانيتين بعد تلقي الجرعة.
بإصبع قفاز، غطي أنف الفأر بلطف حتى يستنشقه أثناء سحب اللسان. حافظ على تغطية الأنف حتى لا يظهر أي سائل في تجويف الفم وقد أخذ الفأر اثنين أو أكثر من الاستنشاق. إزالة الماوس من لوحة التطعيم وإعادته إلى القفص للسماح لها بالتعافي من التخدير مع التأكد من وضع الماوس على ظهره لمنع الحطام من منع nares.
بعد أن استيقظ كل من الفئران من التخدير، والانتظار 90 دقيقة للسماح الضامة السنخية لابتلاع تدفق الخلايا المبرمج. لجمع سائل المراحيض، قم بإعداد الفأرة القتل الرحيم وفقًا لاتجاهات المخطوطة. دفع ببطء برنامج تلفزيوني في الرئتين مما يسمح لهم تضخيم، ثم سحب نفس الحجم مرة أخرى من التأكد من برنامج تلفزيوني لا يخرج من الخياشيم.
جمع مراحيض تجمعها من كل ماوس في أنبوب 15 ملليلتر. الطرد المركزي لامرج القصبات أو BAL في 610 مرات ز لمدة ست دقائق في أربع درجات مئوية، وجمع عظمى في أنبوب 1.5 ملليلتر، وتجميده في ناقص 80 درجة مئوية. الكريه يمثل الخلايا من الفضاء القصبي.
إضافة ملليلتر واحد من ACK الدم الحمراء خلية تحلل العازلة إلى بيليه لإزالة خلايا الدم الحمراء المتبقية. دوامة وlyse لمدة دقيقة واحدة على الجليد، ثم إضافة أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لوقف رد فعل تحلل. الطرد المركزي الخلايا في 610 مرات ز لمدة ست دقائق في أربع درجات مئوية وpirmate فائق مع طارد فراغ.
ثم، resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني مع 10٪ FBS وعد الخلايا على مقياس الهيموسيت بدون الأزرق Trypan. أجهزة الطرد المركزي 120 ميكرولترات كل عينة على الشرائح في 12 مرة ز لمدة ثلاث دقائق باستخدام تسارع المتوسطة وrifuge مركزة. اترك الشرائح لتجف طوال الليل.
في اليوم التالي، وصمة عار الشرائح مع الهماتكسلين ويوسين من أجل حساب كل من عدد الخلايا التفاضلية والخلايا التفاضلية. ثم، عرض الشرائح تحت إعداد برايتفيلد على المجهر البيولوجي باستخدام هدف 20X أو 40X. حساب مؤشر الحساسية على أساس نسبة الضامة السنخية التي بزغات البلعم الخلايا التائية jurkat إلى الضامة السنخية دون امتصاص الخلايا المبرمج مع التأكد من حساب ما لا يقل عن 200 خلية من كل شريحة.
وقد استخدم هذا البروتوكول للتحقيق في تأثير التعرض للأوزون على الالتهاب الرئوي. أظهرت الفئران المكشوفة للأوزون زيادة في الضامة والعدلات في المجال الجوي مقارنة بمجموعة التحكم في الهواء المصفاة وكانت لديها زيادة في بروتين BAL ، وهي علامة على الخلل الظهاري السنخي. قبل القذف الفئران، تم تأكيد المبرمج في الخلايا التى جونكات مع تدفق الخلايا.
و 60 ملليمتر الجول التعرض للأشعة فوق البنفسجية مستوى و أربع ساعات حضانة الوقت أدى إلى نتائج متكررة من الخلايا المبرمجة 75٪ تقريبا. تم تحديد الضامة اليفوسية على أنها الضامة التي اجتاحت خلية جوركات تي مقارنة بالعمام السنخية العادية. كان هناك انخفاض كبير في مؤشر الأوزون المعرضة للأوزون مقارنة بضوابط الهواء المصفاة مما يشير إلى أن الالتهاب الرئوي الناجم عن الأوزون يرتبط بانخفاض إزالة الخلايا المبرمج.
الاهتمام بالتفاصيل وكتابة أي اختلافات ملحوظة أمر بالغ الأهمية خلال هذا الإجراء. ومن المستحسن أيضا أن تعمي العينات للتحليل ويكون شخصين مختلفين العد الضامة. بعد العزل، يمكن استخدام خلايا BAL لتحليل مرنا، الملطخة لعلامات إضافية عن طريق المناعة، و / أو تشغيلها على جهاز قياس تدفق للتمييز بين التغيرات الظاهرية.
