يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مناعة الرئة حول كيفية تقييم التعبير عن microRNAs التي من المتوقع تنظيم الجينات الالتهابية داخل الرئة. هذه التقنية تقدم طريقة بسيطة لتحديد مساهمات الهرمونات المتداولة في التعبير ميكرورنا الرئة. لتقييم مرحلة الدورة استروس، يدويا كبح جماح فأر أنثى عمرها ثمانية إلى تسعة أسابيع وإدخال غيض من ماصة بلاستيكية 10 ميكرولتر مليئة بالماء النقي جدا في المهبل.
تدفق بلطف أربع إلى خمس مرات لجمع عينة، وإيداع تدفق النهائي من السائل المهبلي على شريحة زجاجية. ثم مراقبة تدفق المهبل غير المطّط تحت مجهر خفيف في التكبير 20X. بالنسبة للأوزون والتعرض للهواء الذي تمت تصفيته، ضع أربعة فئران كحد أقصى في واحدة من حاويتين زجاجيتين فرديتين 1.2 لتر مع أغطية شبكية سلكية.
وضع حاوية زجاجية واحدة في غرفة الأوزون وواحدة في غرفة تعرض الهواء المصفاة. ثم ضبط تركيز الأوزون إلى جزأين في المليون، وإزالة الحاوية بعد ثلاث ساعات. بعد أربع ساعات من التعرض ، وتطهير سطح الجلد المكشوف من الفأر التجريبي الأول مع 70 ٪ الإيثانول وقطع القفص الصدري لفضح القلب والرئتين.
استخدام ملقط لغمر 1.5 ملليلتر RNase خالية من أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة في النيتروجين السائل، و المفاجئة تجميد الرئة المقطوعة في النيتروجين السائل. ثم استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ سحق الأنسجة ل mascerate الرئة كلها، وتقسيم الأنسجة المسحوقة بين اثنين من أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر. بعد حصاد وسحق الرئتين من جميع الحيوانات بنفس الطريقة، إضافة 500 ميكرولترات من thiocyanate guanidinium إلى كل عينة وتجانس تسلسل كل نسيج مع 18، 21، و 23s قياس الإبر.
بعد التجانس الأخير، إضافة 500 ميكرولترات من الإيثانول إلى كل عينة قبل دوامة لمدة 15 ثانية. تحميل المخاليط في أعمدة تدور الفردية في أنابيب جمع الفردية للطرد المركزي وتجاهل flowthroughs. لعلاج DNase 1، إضافة 400 ميكرولترات من العازلة غسل RNA إلى كل عمود للطرد المركزي آخر ومزيج خمسة ميكرولترات من DNase 1 و 75 ميكرولترات من الحمض النووي الهضم العازلة لكل عينة في أنابيب خالية من RNase.
أضف المزيج مباشرة إلى مصفوفات العمود لاحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعًا بمحلول غسيل مسبق من RNA سعة 400 ميكرولتر يغسل بالطرد المركزي. لrute الجيش الملكي النيبالي، إضافة 35 ميكرولترات من المياه الخالية من DNase RNase مباشرة إلى كل مصفوفة العمود للطرد المركزي النهائي، وقياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي ونقاء كل عينة على مقياس الطيفي. ثم تخزين الجيش الملكي النيبالي في ناقص 80 درجة مئوية.
لrnase retrotranscription صغيرة ، إضافة 200 نانوغرام من مجموع RNA في 10 ميكرولترات من محلول الغسيل المسبق إلى أنبوب واحد من عكس مزيج رد فعل النسخ لكل عينة. بعد خلط، لفترة وجيزة الطرد المركزي العينات ووضعها على الجليد حتى حضانة بهم. بعد ذلك، احتضان الأنابيب لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية، تليها حضانة لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة الثانية، تمييع CDNA مع 200 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase لكل 20 ميكرولتر رد فعل النسخ العكسي، وإضافة 10 ميكرولترات من كل عينة مزيج رد فعل إلى كل بئر من استجابة مضادة للماوس مسبقة و المناعة الذاتية ميكرورنا مجموعة PCR. يمكن تحديد مرحلة البرونس من خلال وجود خلايا ظهارية مستديرة الشكل وجيدة التكوين. عندما يكون الماوس في مرحلة estrus ، يتم ملاحظة مجموعات معبأة بكثافة من الخلايا الظهارية المشوشة ، وكورنيد ، و الحرشفية في اللطاخة.
خلال metestrus ، وينظر إلى الخلايا الظهارية الكورين و polymorphonuclear الكريات البيض. في الوَيَتَرَس، الكريات البيض عموماً أكثر انتشاراً. الحمض النووي الريبي المستخرج من أربع رئات الماوس، كما هو موضح، تظهر تركيزات الحمض النووي تتراوح بين 1198 و 2178 نانوغرام لكل ميكرولتر ومتوسط نسبة A260 إلى A280 بين 2.01 و 2.02، ومتوسط A260 إلى A230 نسبة بين 2.139 و 2.223.
في هذا الجدول، يتم عرض تسجيل التغيرات ذات شقين في التعبير ميكرورنا بين الأوزون والفئران المكشوفة الهواء المصفاة. بعد مرشح الهدف ميكرورنا وتحليل الأساسية ل 14 microRNAs، للحصول على نسبة سجل التعبير الكبير وقيم P، يمكن تعيين هذه البيانات من قبل مرشح الهدف ميكرورنا. كما يوفر التحليل الأساسي معلومات حول المسارات الكنسية والأمراض والوظيفة والمنظمين والشبكات.
وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام برنامج التحليل الوظيفي لإنتاج تحليل الشبكة التي تبين العلاقة بين microRNAs من الفائدة والجزيئات الأخرى. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم التحقق من دورة estrus يوميا لمدة ثلاث دورات متتالية على الأقل قبل إجراء تجربة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير الجيني التهاب الرئة عبر دورة estrus.
بعد ذلك، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الآخرين في مجال مناعة الرئة لاستكشاف آليات تنظيم هرمون الجنس باستخدام نماذج أخرى.
