Le protocole décrit ici mesure l’efférocytose de macrophage de poumon après exposition à un ozone polluant atmosphérique de critères. Ces données indiquent que l’exposition à l’ozone diminue l’efférocytose macrophage alvéolaire et pourrait donc être un mécanisme pour expliquer pourquoi des niveaux élevés d’ozone augmentent l’incidence des maladies pulmonaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une évaluation in vivo de l’efférocytose macrophage alvéolaire sans aucune manipulation ex vivo des macrophages qui peuvent modifier leur phénotype ou fonction.
Cette technique a révélé un nouveau mécanisme par lequel le poumon ne peut pas se réparer après l’exposition à la pollution atmosphérique. En outre, cette technique peut révéler de nouvelles voies vers des cibles qui modifient l’efférocytose dans le poumon. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel modèle de lésion pulmonaire ou d’inflammation.
Cependant, l’utilisateur devra optimiser quand il est préférable d’évaluer l’efférocytose après une lésion pulmonaire. L’exécution de l’aspiration oropharyngéale peut être techniquement difficile. Je vous conseille de travailler avec votre personnel vétérinaire pour vous assurer que vous avez optimisé votre technique pour effectuer cette procédure.
Commencez par la culture des cellules T de Jurkat dans le milieu de culture cellulaire basale complété selon les directions manuscrites à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Les cellules T de Jurkat sont une lignée cellulaire de suspension qui peut être maintenue en passant dans les médias de culture préchauffés tous les trois jours. Préparer les cellules apoptotiques en les cultivant à 90% de confluence, ce qui prend de trois à quatre jours après la passation.
Cultiver des cellules dans cinq flacons T75 pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour ce protocole. Une fois que les cellules sont prêtes, aspirez le contenu du flacon environ 24 millilitres et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres. Comptez les cellules à l’aide de taches Trypan Blue et d’un hémocytomètre.
Pelleter les cellules par centrifugation à 271 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Ensuite, resuspendez les cellules dans les médias pour obtenir trois millions de cellules par millilitre. Aliquot les cellules dans 100 par 20 millimètres plats de culture tissulaire en transférant cinq millilitres de cellules par plat.
Préparer environ neuf plats de culture. Mettre un plat de côté comme un contrôle non exposé et exposer le reste de la vaisselle aux UV. Réglez le crosslinker UV au niveau d’énergie correct en appuyant sur le bouton d’énergie et en entrant 600 avec la garniture de nombre. Irradier tous les plats avec les cellules, sauf pour le contrôle en s’assurant d’enlever la couverture supérieure du plat de culture tissulaire pendant l’exposition aux UV.
Ensuite, incubez tous les plats dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant quatre heures. Après l’incubation, mélanger toutes les cellules irradiées dans un tube conique de 50 millilitres et les pelleter par centrifugation à 271 fois g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en 24 millilitres de PBS stérile.
Centrifugez à nouveau le tube et retirez le supernatant. Préparez les cellules pour le dosage des souris en les réutilisant dans PBS à la concentration appropriée. Une fois que la souris est correctement anesthésiée, placez-la dans une position de supination semi-couchée.
Utilisez une ficelle chirurgicale attachée entre les chevilles sur une feuille acrylique inclinée pour suspendre la souris par les incisives maxillaires. Utilisez une paire de forceps émoussés non strissés pour saisir et tirer légèrement la langue de souris et inculquer les cellules apoptotiques dans la cavité buccale avec une pipette P200. Le dosage est réussi lorsque les souris font un bruit crépitant une à deux secondes après avoir reçu la dose.
À l’aide d’un doigt ganté, couvrir délicatement le nez de la souris jusqu’à ce qu’elle inhale pendant que la langue est rétractée. Gardez le nez couvert jusqu’à ce qu’aucun liquide ne soit visible dans la cavité buccale et que la souris ait pris deux inhalations ou plus. Retirez la souris de la planche d’inoculation et retournez-la dans la cage pour lui permettre de se remettre de l’anesthésie en s’assurant de placer la souris sur son dos pour empêcher les débris de bloquer les nares.
Après que toutes les souris se sont réveillées de l’anesthésie, attendez 90 minutes pour permettre aux macrophages alvéolaires d’engloutir l’afflux de cellules apoptotiques. Pour recueillir le fluide lavage, préparez la souris euthanasiée selon les instructions manuscrites. Poussez lentement PBS dans les poumons leur permettant de gonfler, puis tirez le même volume en arrière en s’assurant que le PBS ne sort pas des narines.
Recueillir le lavage mis en commun de chaque souris dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez le lavage bronchoalveolar ou BAL à 610 fois g pendant six minutes à quatre degrés Celsius, recueillez le supernatant dans un tube de 1,5 millilitre et congelez-le à moins 80 degrés Celsius. La pastille représente les cellules de l’espace bronchoalveolar.
Ajouter un millilitre de tampon de lyse de globule rouge ACK à la pastille pour enlever les globules rouges résiduels. Vortex et lyse pendant une minute sur la glace, puis ajouter quatre millilitres de PBS pour arrêter la réaction de lyse. Centrifuger les cellules à 610 fois g pendant six minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le supernatant avec un aspirateur.
Ensuite, resuspendez les cellules en un millilitre de PBS avec 10%FBS et comptez les cellules sur un hémocytomètre sans Trypan Blue. Centrifugeuse 120 microlitres de chaque échantillon sur des toboggans à 12 fois g pendant trois minutes à l’aide d’une accélération moyenne et d’une cytocentrifugeuse. Laissez sécher les glissières toute la nuit.
Le lendemain, tacher les diapositives avec de l’hématoxyline et de l’éosine afin de calculer à la fois le nombre de cellules efférocytiques et différentielle. Ensuite, visualisez les diapositives sous un réglage Brightfield sur un microscope biologique à l’aide d’un objectif 20X ou 40X. Calculez l’indice efférocytique basé sur le rapport des macrophages alvéolaires qui phagocytosed cellules Apoptotic T Jurkat aux macrophages alvéolaires sans absorption de cellules apoptotiques en s’assurant de compter au moins 200 cellules de chaque diapositive.
Ce protocole a été utilisé pour étudier l’effet de l’exposition à l’ozone sur l’inflammation pulmonaire. Les souris exposées à l’ozone présentaient une augmentation des macrophages et des neutrophiles dans l’espace aérien par rapport au groupe de contrôle de l’air filtré et avaient une augmentation de la protéine BAL, un marqueur du dysfonctionnement épithélial alvéolaire. Avant de doser les souris, l’apoptose dans les cellules T de Jurkat a été confirmée avec la cytométrie d’écoulement.
Le niveau d’exposition uv de 60 milli joule et le temps d’incubation de quatre heures ont eu comme conséquence des résultats répétitifs des cellules apoptotic d’approximativement 75%. Les macrophages efférocytiques ont été identifiés comme macrophages qui avaient englouti une cellule T de Jurkat comparé aux macrophages alvéolaires réguliers. Il y a eu une diminution significative de l’indice efférocytique du groupe exposé à l’ozone par rapport aux commandes d’air filtrées qui indique que l’inflammation pulmonaire induite par l’ozone est associée à une diminution du dégagement des cellules apoptotiques.
L’attention aux détails et l’écriture des différences observées sont essentielles au cours de cette procédure. Il est également recommandé d’aveugler les échantillons pour analyse et d’avoir deux personnes différentes compter les macrophages. Après isolement, les cellules BAL peuvent être utilisées pour l’analyse de l’ARNm, tachées de marqueurs supplémentaires par immunofluorescence, et/ou fonctionner sur un cytomètre d’écoulement pour distinguer les changements phénotypiques.
