Pseudomonas aeruginosa هو مرض الأمراض BSL-2 مستوى. تذكر أن تتبع جميع الممارسات السلامة مستوى BSL-2 عند التعامل مع هذا الكائن الحي. هنا سوف نظهر عزل الخلية الأولية، في فيتروب phagocytosis، وتحليل مسار البلعومي، وفي الفيتوسيتوس الجسم الحي وتقييم إزالة البكتيريا في الفئران.
يتطلب نجاح التسليم داخل المناطق التي ينتفض فيها العمل على إتقانها. تأكد من أن يتم تحميل الرذاذ المجهري بشكل صحيح ، والإبرة بين طيات صوتيتين ، ويتم التحكم في سرعة المكبس بشكل صحيح. تبدأ من خلال تأمين الماوس في موقف سوبين مع أطرافه المنتشرة على لوحة تشريح مغطاة المناشف الورقية وربط سلسلة تحت الأسنان الأمامية لسحب الرأس بحيث يتم وضع القصبة الهوائية على التوالي ومستوى.
تطهير الماوس مع 70٪ الإيثانول واستخدام ملقط العادية لسحب ما يصل الجلد في خط وسط الجسم. استخدم مقص جراحيًا لقطع الجلد من البطن إلى أعلى الحلق. استخدم الطرف الحاد للمقص الجراحي القياسي لتشريح عضلة الحلق والأنسجة الضامة بعناية.
افتح جدار البطن أسفل القفص الصدري. قطع الحجاب الحاجز، وقطع بعيدا الجزء السفلي من القفص الصدري لفضح جزئيا الرئتين. استخدام مقص الربيع لفضح القصبة الهوائية واستخدام ملقط لفهم حلقة الغضروف.
استخدم المقص الصغير لعمل شق 1.5 ملليمتر تقريبًا على الوجه البطني للرغام الهوائية. سلسلة بعناية طول قصير من الخيط خياطة تحت القصبة الهوائية وإدراج قنية قياس 18 في القصبة الهوائية. عندما يكون القنية في مكانها ، قم بغسل الرئة برفق ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من PBS الطازجة لكل غسل ، وسحب السائل بلطف في الحقنة قبل إعادة ضخها مرة أخرى في الرئة ثلاث مرات متتالية.
بعد كل lava، نقل السائل القصبي التي تم جمعها bronchoalveolar أو BALF إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي من مجموع السوائل المقطوعة. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد للطرد المركزي الثاني و resuspend الضامة السنخية غسلها في اثنين من milliliters من النسور المعدلة Dulbecco المتوسطة أو DMEM تكملها 10٪ غير تنشيط الحرارة مصل البقر الجنين. ثم نقل الضامة السنيلية الأولية إلى طبق بيتري من قاع الزجاج لاستزراعهم لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حاضنة الخلايا.
بعد 48 ساعة، وغسل الثقافة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني قبل تغذية الثقافة مع ملليلتر اثنين من المتوسطة الطازجة. بعد ذلك، أضف 50 كربوكسيلاتيتيمتر قطرهما 50 ميكرومتراً لاتكس FITC-متقارنة في الخلية إلى الثقافة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حاضنة الخلية. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة على نطاق واسع خمس مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل لإزالة الخرز خارج الخلية وصورة عشوائية 100 الخلايا لحساب الخلايا التي تحتوي على الخرز داخل الخلايا.
لمجرّد فحص opsonization، احتضان مرتين 10 إلى الخروف الثامن خلايا الدم الحمراء أو SRBCs مع 50 ميكرولترات من الزبيب المضادة لـ SRBC المناعية M أو IgM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان SRBCs opsonized مع 50 ميكرولترات من مصل الإنسان C5 ناقص لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية لإصلاح C3b وC3b مثبطات تكمل شظايا على SRBCs المغلفة IgM. المقبل، الطامحين وسائل الإعلام وإضافة 100 ميكرولترات من واحد مرات 10 إلى SRBCs opsonized سبعة لكل ملليلتر من المتوسطة إلى كل بئر من لوحة 96-well التي تحتوي على 10 مرات واحدة إلى الضامة مورين بين عشية وضحاها الرابع مثقف في البئر.
احتضان الاستزراع المشترك للماوس SRBC لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية ثم قم بإزالة SRBCs غير المنضمة عن طريق الغسيل مع 100 ميكرولترات من تحلل كلوريد الأمونيوم العازلة للبوتاسيوم لمدة دقيقة واحدة. بعد إزالة SRBCs غير منضم، شطف مع 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام. Lyse الخلايا المتبقية مع 0.1 ٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم وعلاج lysates مع 50 ميكرولترات من 2 ، 7 ديامينوفلورين تكملها 3 ٪ بيروكسيد الهيدروجين وستة اليوريا المولى.
ثم قياس امتصاص تشكيل الهيموغلوبين الأزرق الفلورين المحفز على مقياس الطيفي في 620 نانومتر. استخدم منحنى قياسي في 620 نانومتر امتصاص القيم مع عدد معروف من SRBCs لتحديد عدد SRBCs opsonized التي يتم phagocytized. لتقييم نمط التعرف على مستقبلات البلعوم بوساطة، غسل لمدة يومين الماوس مثقف الضامة السنوية الأولية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وعلاج الخلايا مع 500 ميكرولترات من المتوسطة الطازجة التي تحتوي على 100 اليكسا فلور-488 مترافق Zymosan-A-الجسيمات الحيوية.
بعد ساعة واحدة في 37 درجة مئوية، وإلقاء القبض على البلعوم مع 500 ميكرولترات من الجليد البارد PBS وغسل الخلايا على نطاق واسع خمس مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ شبه شكلي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واغسل الخلايا خمس مرات أخرى كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، قم بتغطية الخلايا بـ 500 ميكرولترات من برنامج PBS الطازج للتصوير في ظل تباين التداخل وقناة الفلورسنت عند 488 نانومتر لتحديد عدد الضامة السنخية التي تحتوي على Zymosan-A-bioparticle.
ل في تقييم الضامة الضامة في الجسم الحر، تأكيد المستوى المناسب من التخدير من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم في الماوس تخدير ووضع الماوس على لوحة مسطحة مع سلك من البلاستيك تحت القاطع العلوي. ضع الفأرة في منصة شبه مُبَتَكّنة في موضع 45 درجة مع السطح البطني الذي يواجه الصعود واستخدم ملقطًا منحنية لسحب اللسان وقمعه. ثم إدراج رذاذ مجهري بين طيات الصوتية لإدارة داخلtracheally 50 ميكرولترات من خمس مرات 10 إلى وحدات تشكيل مستعمرة ست من P.aeruginosa GFP في الرئتين من الحيوان تخدير.
للتأكد من أن الإبرة المجهرية في القصبة الهوائية، قم بتحريك الحقنة برفق ولاحظ الطيات الصوتية على جانبي الإبرة. ساعة واحدة بعد العدوى، وجمع السائل lavage كما أظهرت للتو وبليه الضامة السنخية عن طريق الطرد المركزي. Resuspend مرة واحدة 10 إلى الخلايا الثالثة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد لcytocentrifuge على شريحة زجاجية.
ثم تلطخ تفاضليا الشرائح السيتوسبون لالبالام السنخية، العدلات، والخلايا الليمفاوية، وفقا للبروتوكولات الهستوكيميائية القياسية. اختر عشوائيًا 100 من الضامة السنخية لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي بعمت البكتيريا. في أول تجربة في إزالة البكتيريا الحية، حقن داخل الرحم جرعة تحت تهليل من حوالي 2.5 إلى خمس مرات 10 وحدات تشكيل مستعمرة الخامسة لكل ملليلتر من P.aeruginosa إلى نوع البرية مفجّرة والفئران المتحولة وقياس وزن الجسم من كل كل يوم لمدة ستة أيام.
في التجربة الثانية، حقن مجموعة جديدة من النوع البري والفئران المتحولة مع قاتلة ثلاث مرات 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة سبع لكل جرعة ملليلتر من P.aeruginosa وتسجيل الوفيات في غضون يومين من الحقن، وجمع أنسجة الرئة بأكملها في وقت الوفاة أو بعد يومين من الحقن لتحديد كمية من عبء الرئة البكتيرية في ذروة العدوى. بعد حصاد الرئتين، وقطع عينات الرئة إلى قطع صغيرة على الجليد والتجانس شظايا الرئة باستخدام ضبط إعداد المهيجات الكهربائية. ثم لوحة 100 ميكروليتر من التجانس على لوحات عزل Pseudomonas agar في 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية.
المجهر Fluorescence يكشف أن الماوس الأولية alveolar الضامة البلعم البلعومي من الخرز اللاتكس FITC يحدث بعد ساعة واحدة من الحضانة، مع الضامة 100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 على العكس من ذلك ، فرط التعبير عن TRIM72 ، وهو بروتين مع وظيفة غير معروفة في خلايا الضامة مورين ، والنتائج في انخفاض أكثر من خمسة أضعاف في البلعمة التكميلية. اليكسا فلور-488 مترافق Zymosan-A الجسيمات، ومع ذلك، يتم تناولها في كمية متساوية من قبل الضامة السنخية الأولية معزولة عن أي نوع البرية أو الفئران خروج المغلوب.
التلطيخ التفاضلي من BALF حصادها من نوع البرية والحيوانات خروج المغلوب يكشف عن عدد مماثل من الضامة ولكن قدرة أعلى البلعومات ل الضامة التي يتم حصادها من الفئران خروج المغلوب. وعلاوة على ذلك، فئران خروج المغلوب TRIM72 إظهار انتعاش أسرع من أوزان الجسم، والحفاظ على بقائها على قيد الحياة، ويحمل عبئا أقل من البكتيرية تفعل الحيوانات من النوع البرية بعد إدارة P.aeruginosa داخل المناطق. باستخدام هذه التقنية، يمكن تحليل العمليات البلعومية الأخرى المهمة للالتهاب الرئوي مثل بَتَمَعَل العدلات والمساهمة النسبية للبلعيات الأخرى في إزالة البكتيريا.
في تركيبة مع مثبطات الدوائية، والنقل التكيفي، والحيوانات المعدلة وراثيا، يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين على استكشاف المكون الجزيئي لنوع معين من البلعومات للبلعات ذات الاهتمام.
