El protocolo descrito aquí mide la efferocitosis de macrófagos pulmonares después de la exposición a un criterio de ozono contaminante del aire. Estos datos indican que la exposición al ozono disminuye la efferocitosis de macrófagos alveolares y, por lo tanto, podría ser un mecanismo para por qué los niveles elevados de ozono aumentan la incidencia de enfermedades pulmonares. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación in vivo de la efferocitosis de macrófagos alveolares sin ninguna manipulación ex vivo de los macrófagos que pueda alterar su fenotipo o función.
Esta técnica ha revelado un nuevo mecanismo por el cual el pulmón no puede repararse después de la exposición a la contaminación del aire. Además, esta técnica puede revelar nuevas vías a objetivos que alteran la efferocitosis en el pulmón. Este método se puede aplicar a cualquier modelo de lesión pulmonar o inflamación.
Sin embargo, el usuario tendrá que optimizar cuando sea mejor evaluar la efferocitosis después de una lesión pulmonar. Realizar la aspiración orofaríngea puede ser técnicamente difícil. Le aconsejo trabajar con su personal veterinario para asegurarse de que ha optimizado su técnica para realizar este procedimiento.
Comience por cultivar células T de Jurkat en medio de cultivo de células basales complementado de acuerdo con las direcciones del manuscrito a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono. Las células T de Jurkat son una línea celular de suspensión que se puede mantener a través del passaging en medios de cultivo precalentó cada tres días. Preparar las células apoptóticas mediante el crecimiento de ellos a 90%confluencia que toma de tres a cuatro días después de la transgredencia.
Células de cultivo en cinco matraces T75 para obtener un número suficiente de células para este protocolo. Una vez que las células estén listas, aspirar el contenido del matraz alrededor de 24 mililitros y transferirlos a un tubo cónico de 50 mililitros. Cuente las células usando la tinción De Punta Azul y un hemociclomecómetro.
Pele el líquido de las células por centrifugación a 271 veces g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Luego, resuspender las células en medios para obtener tres millones de células por mililitro. Aliquot las células en 100 por 20 milímetros de cultivo de tejido mediante la transferencia de cinco mililitros de células por plato.
Preparar aproximadamente nueve platos de cultura. Deje un plato a un lado como un control no expuesto y exponga los platos restantes a los rayos UV. Ajuste el reticulante UV al nivel de energía correcto pulsando el botón de energía e introduciendo 600 con el teclado numérico. Irradiar todos los platos con las células excepto el control asegurándose de retirar la cubierta superior de la placa de cultivo de tejido durante la exposición UV.
Luego, incuba todos los platos en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas. Después de la incubación, combinar todas las células irradiadas en un tubo cónico de 50 mililitros y peletizarlas por centrifugación a 271 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 24 mililitros de PBS estéril.
Centrifugar el tubo de nuevo y quitar el sobrenadante. Preparar las células para la dosificación de ratones resuspendándolas en PBS en la concentración adecuada. Una vez que el ratón esté correctamente anestesiado, colóquelo en una posición supina semi-recumbent.
Utilice una cuerda quirúrgica atada entre clavijas en una placa de lámina de acrílico inclinada para suspender el ratón por los incisivos maxilares. Utilice un par de fórceps sin astillas contundentes para agarrar y tirar ligeramente de la lengua del ratón e inculcar las células apoptóticas en la cavidad oral con una pipeta P200. La dosificación es exitosa cuando los ratones hacen un ruido crepitante de uno a dos segundos después de recibir la dosis.
Con un dedo enguantado, cubra suavemente la nariz del ratón hasta que se inhale mientras la lengua se retrae. Mantenga la nariz cubierta hasta que no haya líquido visible en la cavidad oral y el ratón haya tomado dos o más inhalaciones. Retire el ratón de la placa de inoculación y devuélvalo a la jaula para permitir que se recupere de la anestesia asegurándose de colocar el ratón sobre su espalda para evitar que los desechos bloqueen las narinas.
Después de que todos los ratones se hayan despertado de la anestesia, espere 90 minutos para permitir que los macrófagos alveolares engullir la afluencia de células apoptóticas. Para recoger el líquido de lavado, prepare el ratón eutanizado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Empuje lentamente el PBS en los pulmones, lo que les permite inflarse, luego tire del mismo volumen hacia fuera asegurándose de que el PBS no está saliendo de las fosas nasales.
Recoger el lavado agrupado de cada ratón en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar el lavado broncoalveolar o BAL a 610 veces g durante seis minutos a cuatro grados Centígrados, recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 mililitros, y congelarlo a menos 80 grados centígrados. El pellet representa las células del espacio broncoalveolar.
Añadir un mililitro de tampón de lysis de glóbulos rojos ACK al pellet para eliminar los glóbulos rojos residuales. Vórtice y lese durante un minuto sobre hielo, luego agregue cuatro mililitros de PBS para detener la reacción de la lysis. Centrifugar las células a 610 veces g durante seis minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante con un aspirador de vacío.
Luego, resuspender las células en un mililitro de PBS con 10%FBS y contar las células en un hemocitometro sin Trypan Blue. Centrifugar 120 microlitros de cada muestra en diapositivas a 12 g durante tres minutos utilizando una aceleración media y una citocentrífuga. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche.
Al día siguiente, manche los portaobjetos con hematoxilina y eosina para calcular el recuento de células efferocíticas y diferenciales. A continuación, vea las diapositivas bajo un ajuste de Brightfield en un microscopio biológico utilizando un objetivo 20X o 40X. Calcular el índice efferocítico basado en la proporción de macrófagos alveolares que fagocytosed células T apoptoticas Jurkat a macrófagos alveolar sin absorción de células apoptóticas asegurándose de contar al menos 200 células de cada diapositiva.
Este protocolo se utilizó para investigar el efecto de la exposición al ozono en la inflamación pulmonar. Los ratones expuestos al ozono mostraron un aumento de los macrófagos y neutrófilos en el espacio aéreo en comparación con el grupo de control de aire filtrado y tuvieron un aumento en la proteína BAL, un marcador de disfunción epitelial alveolar. Antes de la dosificación de los ratones, se confirmó la apoptosis en las células T de Jurkat con citometría de flujo.
El nivel de exposición UV de 60 mililitros y el tiempo de incubación de cuatro horas dieron como resultado resultados repetitivos de aproximadamente 75% células apoptóticas. Los macrófagos efferocitos fueron identificados como macrófagos que habían engullido una célula de Jurkat T en comparación con los macrófagos alveolares regulares. Hubo una disminución significativa en el índice efferocítico del grupo expuesto al ozono en comparación con los controles de aire filtrado que indica que la inflamación pulmonar inducida por el ozono se asocia con una disminución del aclaramiento de las células apoptóticas.
La atención al detalle y la escritura de las diferencias observadas es fundamental durante este procedimiento. También se recomienda cegar las muestras para su análisis y hacer que dos personas diferentes cuenten los macrófagos. Después del aislamiento, las células BAL se pueden utilizar para el análisis de ARNm, mancharse para marcadores adicionales por inmunofluorescencia, y/o ejecutarse en un citómetro de flujo para distinguir los cambios fenotípicos.
