إن التثبيت البيولوجي للهياكل النانوية للحمض النووي ضروري للتطبيقات المستقبلية في الجسم الحي، مثل تسليم الأدوية المستهدفة. ومع ذلك، يحصل على تحلل الحمض النووي في الجسم من قبل مختلف الإنزيمات. هنا نقدم تقنية طلاء تحمي الهياكل النانوية للحمض النووي من التدهور الأنزيمي.
المزايا الرئيسية هي أن لدينا طلاء تضم المركبات غير السامة التي تستخدم بالفعل في الكائنات الحية، وأن وظيفية السطح لا يزال ممكنا. وهذا الوظيفي مهم في إدراج أجهزة الاستشعار الجزيئية من أجل التعرف على الأهداف ومفاتيح إطلاق شحنات المخدرات. الطلاء البوليبات يزيد بشكل كبير من امتصاص الخلوية من الهياكل اوريغامي الحمض النووي مغلفة، لذلك هذه الطريقة يمكن أن تفتح الباب لتطبيقات اوريغامي الحمض النووي في التشخيص والعلاجات.
ويتطلب الامتصاص الخلوي أيضاً تطبيقات تسليم الجينات المحتملة لتقنية النانو للحمض النووي. أنا أعتبر أن الأسلوب هو واضح جدا ويمكن أن يتقن بسهولة. للبدء، وقياس تركيز اوريغامي الحمض النووي النقي.
استخدام اثنين microliters من السل العازلة كما فارغة لمعايرة مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ثم قياس تركيز اوريغامي الحمض النووي في 260 نانومتر. ثم حساب كميات الفوسفات في محلول اوريغامي الحمض النووي المنقى، وذلك باستخدام الصيغة الثانية، كما هو موضح في المخطوطة.
إعداد 15 ميكرولترات من هيكل اوريغامي الحمض النووي عن طريق تضمين نانومول واحد من الفوسفات، وذلك باستخدام السل العازلة لتخفيف. إضافة 13.2 ميكرولترات إلى السل إلى 1.8 ميكرولترات من الشيتوزان. وإضافة 15 ميكرولترات من حل الشيتوزان إلى 15 ميكرولترات من اوريغامي الحمض النووي لتطوير الحمض النووي اوريغامي ميزبليكس مع نسبة N / P من ثمانية.
استمر في تحضير البلييكس المختلفة بنسب N/P، باستخدام الحسابات كما هو موضح في المخطوطة. إعداد 80 ملليمترا من أنبوب ل2٪ agarose هلام. إضافة 352 ميكرولترات من 2.5 كلوريد المغنيسيوم المولر ومن ثم قبل وصمة عار مع 10 ميكرولترات من وصمة عار هلام الحمض النووي.
صب حل هلام في مربع هلام الجافة. أدخل مشط جل كهربائي واتّخذه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه تكملة المخزن المؤقت تشغيل مع كلوريد المغنيسيوم 11 ميليمولار.
مزيج 10 إلى 20 ميكرولترات من كل عينة مع 20٪ من 6X تحميل العازلة. تحميل العينات في آبار هلام agarose، بما في ذلك اوريغامي الحمض النووي عارية كتحكم. تشغيل الجل في 70 فولت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ونصف إلى ثلاث ساعات.
ثم استخدام ماسح الأشعة فوق البنفسجية لتصور هلام. لأداء فحص حماية DNase I ، أضف أربعة ميكرولترات من كل بوليبليكس مقارنة بنسب N /P مختلفة ، 1.5 ميكرولترات من 10X DNase I العازلة ، 8 ميكرولترات من السل ، و 1.5 ميكرولترات من DNase I إلى أنبوب PCR 2 ملليلتر منفصل. ثم احتضان نفسه في 37 درجة مئوية في ثيرموساير لمدة 24 ساعة.
هضم DNase I، إضافة اثنين من microliters من 20 ملليغرام لكل ملليلتر البروتينات K واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في ثيرموساير. ثم، لكشف الهياكل النانوية الحمض النووي الأساسية إضافة 3.6 ميكرولترات من 50 ملليغرام لكل ملليلتر 40 كيلودالتون dextran كبريتات. ثم استخدام هذه العينات و اوريغامي الحمض النووي الطازجة كتحكم في تنفيذ agarose هلام الكهرباء كما هو موضح سابقا.
اُخراج النطاق المقابل لعينات محمّلة من الجل. لاستخراج اوريغامي الحمض النووي، استخدم عمود استخراج تجميد الضغط واتبع تعليمات الشركة المصنعة والاستمرار في التصوير المجهري للمجهر الإلكتروني انتقال البقعة السالبة كما هو موضح في المخطوطة. مزيج 6.5 ميكرولترات من تنقية 36 نانومولار HRP-NR مع 6.5 ميكرولترات من البوليات من تركيزات مختلفة.
لإعداد بوليبليكس عند نسب N/P من واحد، اثنين، أربعة، 10، و 20، إعداد مجموعة فارغة عن طريق خلط 6.5 ميكرولترات من الماء المقطر مع 6.5 ميكرولترات من تركيزات مختلفة من مختلف المقابلة لنسب N/P من واحد، اثنين، أربعة، 10، و 20. ثم إضافة 12.5 ميكرولترات من كل من هذه الحلول المعدة إلى بئر منفصلة من 96 بئر لوحة. ثم إضافة 72.5 microliters من العازلة HEPES إلى كل بئر ومزيج.
إضافة 10 ميكرولترات من 15 ملليمتر ABTS ثم 5 ميكرولترات من بيروكسيد الهيدروجين 12 ملليمولار إلى كل بئر ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. وأخيراً، استخدم قارئ لوحة متعددة المستويات لقياس الامتصاص عند 421 نانومتر على مدار أربع ساعات. بعد تحليل polyplexes باستخدام تحليل الهلام، كان هناك تحول في البنية النانوية العارية نحو الكاثود، وربما يرجع ذلك إلى موازنة الشحنة السلبية لمجموعات الفوسفات عند الربط إلى تعدد، وزيادة حجم المجمع.
عندما تم إضافة كمية إضافية من البوليانيونس، مثل كبريتات ديكستران، تم عكس تشكيل البوليبليكس. أظهرت كبريتات ديكستران من الوزن الجزيئي العالي أن تكون أكثر كفاءة مقارنة مع انخفاض الوزن الجزيئي. بعد تحليل polyplexes باستخدام المجهر الإلكترون انتقال البقع السلبية، وأظهرت micrographs عارية الحمض النووي اوريغامي النانوية، polyplexes البولي ثلاثية خطية بعد قطع، polyplexes الشيتوسان، صور اوريغامي الحمض النووي عارية ومحمية تتعرض لنضوب المغنيسيوم، وتدهور enzymatic، وهضم المصل.
في وجود DNase الأول، بعد ساعتين، تم هضمها تماما النانوية عارية، في حين أن polyplexes البوليثيلينمين الخطي من الشيتوان المغلفة اوريغامي الحمض النووي بقيت سليمة في وجود 10 وحدات لكل ملليلتر DNase I.Linear polyplexes حماية ال DNA nanostructures أكثر كفاءة مقارنة مع الشيتوسان. عندما يتم زيادة نسبة N / ف من بوليبليكس، كان هضم الحمض النووي أقل. بعد طلاء الانزيم، أو بعد اوريغامي الحمض النووي أكثر وظيفية، مع بوليبلييكس ثلاثية خطية والشيتوسان في نسب N/P البديلة، لوحظ أي تدخل ملحوظ مع النشاط الأنزيمي.
من ناحية أخرى, تغيرت الحركية من إنزيم HRP بشكل كبير بعد ربط للوريغامي DNA. من المهم أن تبدأ مع تنقية جيدا، DNA اوريغامي الهياكل. هناك وجود حبلا إسطبل التي يمكن أن تربط أيضا إلى تعدد.
من الصعب فصلها عن بوليبليكس الحمض النووي اوريغامي. كما تستخدم جزيئات الطلاء لدينا في تطبيقات العلاج الجيني. وهذا يعني أن الهياكل النانوية للحمض النووي يمكن استخدامها في المستقبل لتغيير جينوم الكائنات الحية.
لـ agarose جل تلطيخ, عادة ما تستخدم الجزيئات التي تتوسط الحمض النووي ويحتمل أن تكون مطفرة. يرجى اتباع تعليمات السلامة من المختبر الخاص بك عند تلطيخ الحمض النووي.
