ونشكر الدكتور جيسيكا حبشي لقراءة خطيرة من المخطوطة. ونشكر الدكتور Xianyong شنغ من مركز التصوير، كلية علوم الحياة، جامعة العاصمة للمعلمين (بيجين، الصين)، للقيام بترجمة الإنزيم DR5-التجارة والنقل . هذا العمل كان يدعمها المنح من "مؤسسة العلوم حكومة بلدية بكين" (CIT &#38; TCD20150102) ومن "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (31600248).

ملاحظة: هذا البروتوكول له ثلاثة أجزاء: 1) مراقبة تشكيل نمط في أجنة نبات البرية من نوع استخدام الفحص المجهري DIC؛ 2) تميز الجنين نمط تشكيل عن طريق مراقبة التعبير البروتين علامة باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري؛ و 3) تحديد دور جين معين في امبريوجينيسيس (باستخدام المسخ naa10 على سبيل مثال).
1-أبل المقاصة
<ol>
	<li>إعداد المواد النباتية ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا مثال على كيفية زراعة النباتات صحية؛ طرق أخرى لزراعة النباتات صحية تعمل أيضا.<ol>
		<li>إضافة بذور 100 إلى أنبوب 1.5 مل ومن ثم أضف 1 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 1.5% (ميكس 15 مل كلور 10% مع 85 مل من الماء) لتعقيم بذور دقيقة 5 عكس الأنبوبة عدة مرات لضمان جيدا مختلطة لتعقيم بذور السطحية تماما بالبذور والحل.</li>
		<li>قوة البذور إلى الجزء السفلي من الأنبوب بالطرد المركزي لمدة 30 ثانية في س 1,200 ز، إزالة المادة طافية، وتغسل البذور بالماء المعقم أربع مرات على مقاعد البدلاء لإزالة تحت كلوريت الصوديوم المتبقية.</li>
		<li>إضافة 4.4 غ من خليط الملح القاعدي Murashige وسكوغ (مللي ثانية) و 10 غم من السكروز إلى 1 لتر الماء عالي النقاوة. يقلب الخليط لإذابة الأملاح والسكروز. ضبط الحل للأس الهيدروجيني 5.8 مع 1 م كوه، إضافة الجيل الثالث 3g عامل مجمد، مثل فيتاجيل، إلى حل مرض التصلب العصبي المتعدد-السكروز، وتعقيم الحل في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لجعل متوسط MS.</li>
		<li>صب 30 مل الوسط مرض التصلب العصبي المتعدد في صحن 12-سم ثقافة لإنشاء لوحات متوسطة مرض التصلب العصبي المتعدد.</li>
		<li>وضع بذور معقمة على لوحة مرض التصلب العصبي المتعدد. نقل اللوحة إلى دائرة نمو وإبقاء اللوحة تحت ظروف طويلة أيام (22 درجة مئوية ح 16 في الضوء و 18 درجة مئوية ح 8 في الظلام) بعد بذور التقسيم الطبقي (3 أيام في 4 درجات مئوية في الظلام).</li>
		<li>بعد 8 أيام نمو، نقل النباتات للتربة (التربة الغنية بالمغذيات ميكس والفيرميكوليت بنسبة 1:1) في علبة وتغطي العلبة مع غطاء أبيض وشفاف لمدة 5 أيام لتجنب فقدان الماء، ويترك ثغرة لتجنب عمليات التزجيج النباتات.</li>
		<li>تتخذ الغطاء قبالة الدرج وزراعة النباتات في حجرة حجرة تحت ظروف أيام طويلة (انظر 1.1.5). تبديل الضوء الساعة 06:00 ص وإيقاف الساعة 10:00 م. بعد حوالي 20 يوما نمو في قاعة حجرة، سوف يكون مزهر النباتات وإنتاج سيليكويس.</li>
		<li>مارك يطارد براعم الزهور مع مؤشر ترابط في الموضع للبذور في نورات الساعة 08:00 م (لا تستخدم الأولى لبراعم الزهور الثالث؛ سيليكويس المتولدة من هذه البراعم الزهرة عادة وضع بذور إحباط عدد قليل، وهذا قد يغير نسبة طبيعية للبويضات غير طبيعي). تحديد بداية التلقيح ovule كما عند فتح برعم ملحوظ زهرة الساعة 08:00 ص في صباح اليوم التالي.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>إعداد الحل هوير
	<ol>
		<li>إضافة 24 ز من كلورال هيدرات لأنبوب 50 مل ولف الأنبوب تماما مع رقائق الألومنيوم (حلول كلورال هيدرات ليست مستقرة تحت الضوء).</li>
		<li>المقبل، بإضافة 9 مل من الماء عالي النقاوة و 3 مل من الجلسرين إلى الحل أعلاه ويهز أنبوب لإذابة هيدرات كلورال. لجعل الحل هوير، اسمحوا الأنبوب الوقوف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي فقاعات.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>فصل ovule وإزالة الألغام
	<ol>
		<li>إرفاق قطعة من شريط لاصق الوجهين بشريحة زجاجية مجهر. ضع خردلة نمت للعدد المطلوب من أيام بعد التلقيح (حزب العمل الديمقراطي) على الشريحة مع بسيودوسيبتوم عمودي على السطح؛ هذا سيجعل من السهل تقسيم carpels (الأرقام 1A و 1B).</li>
		<li>تقسيم كاربيلس على كلا الجانبين من بسيودوسيبتوم بإبرة محقن وإرفاق carpels تشريح اثنين إلى الشريحة حيث تكون البويضات في خردلة مرئية تحت ستيريوسكوبي (الأرقام 1 ود 1).</li>
		<li>الاستغناء عن 70 ميليلتر من محلول هوير لعلى الشريحة الزجاجية، ومن ثم ترطيب غيض من زوج من ملاقط مقلوب غرامة مع الحل هوير بالغمس. تستخدم في ستيريوسكوبي، نقل البويضات إلى الحل هوير على الشريحة مع ملاقط لتنظيف الأجنة. تطبيق ساترة على الشريحة برفق لتجنب توليد أي فقاعات.</li>
		<li>وضع الشريحة الانتهاء في مربع في غرفة مظلمة ح 2-12 (أكثر نضجاً ovule، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من الوقت) في درجة حرارة الغرفة. ويمكن ملاحظة الأجنة في المرحلة 2/4-الخلية (1-2 مديرية إدارة السجون) مجهريا بعد ح 2، في حين يمكن ملاحظة الأجنة بين أوكتانت والمراحل المبكرة كروي (3 سماد) بعد ح 4. ويمكن ملاحظة أكثر نضجاً الأجنة (4-8 سماد) بعد 12 ساعة.</li>
		<li>فحص البويضات تم مسحها باستخدام الدالة DIC مجهر. حدد الأجنة ضمن حقل طاقة منخفضة (10 X) ثم قم بتغيير إلى حقل عالية الطاقة (النفط غمر عدسة 100 X) لمراقبة نمط الخلوية في الأجنة المتقدمة النمو.</li>
		<li>فحص الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2-توصيف الجنين الزخرفة وهوية الخلية عن طريق مراقبة تعبير البروتين علامة
<ol>
	<li>تحضير المواد النباتية
	<ol>
		<li>استنساخ المروج والترميز تسلسل علامة عنصر استجابة الجينات أو الهرمونات والصمامات ثم أنه مع بروتين فلوري (مثل التجارة والنقل)؛ بعد ذلك، إدراج في البناء ناقلات ثنائية (مثل pCambia1300). هنا، عنصر الاستجابة اكسين DR5 يقدم ك مثال10.</li>
		<li>إدخال بلازميد DR5-التجارة والنقل الناتجة عن النباتات البرية من نوع من توميفاسينس المتبعة-بوساطة تحويل11. تحديد النباتات T1 باستخدام MS لوحات متوسطة الحجم التي تحتوي على هيجروميسين (50 ملغم/مل الخمور الأم، المخفف 1:1، 000). النباتات المعدلة وراثيا سوف يحمل جذور طويلة وتولد اثنين روزيت يترك بعد 8 أيام نمو في ظل الشروط الموضحة في 1.1.5.</li>
		<li>نقل النباتات المعدلة وراثيا إلى التربة وزراعتها كما هو مبين في 1.1.6 و 1.1.7.</li>
		<li>جمع بذور T2 من خطوط T1 مستقلة. بذر البذور في لوحات MS-هيجروميسين وتحديد النباتات تحمل نسخة واحدة من الإدراج DR5-التجارة والنقل (نسبة نباتات مقاومة للنباتات الحساسة سيكون تقريبا 3:1)، ونقلها إلى التربة.</li>
		<li>زراعة النباتات T2 كما هو مبين في 1.1.6 و 1.1.7.</li>
		<li>جمع بذور T3 من النباتات T2. بذر البذور في لوحات MS-هيجروميسين وتحديد النباتات المعدلة وراثيا متماثل (جميع النباتات من سطر واحد سوف يحمل المقاومة هيجروميسين)، ونقلها إلى التربة.</li>
		<li>وضع علامة على براعم الزهور من النباتات T3 متماثل كما هو مبين في 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>بروتينات فلورية خضراء إشارة المراقبة
	<ol>
		<li>خلط 3 مل الجلسرين مع 47 مل من الماء عالي النقاوة لإنشاء حل والغليسيرول 6%.</li>
		<li>إرفاق قطعة من شريط لاصق الوجهين إلى شريحة الميكروسكوب زجاجية وإصلاح خردلة النحو المبين في 1.3.1.</li>
		<li>تقسيم كاربيلس على كلا الجانبين من بسيودوسيبتوم بإبرة محقن وإرفاق carpels تشريح اثنين للشريحة تحت ستيريوسكوبي كما هو مبين في 1.3.2.</li>
		<li>الاستغناء عن 30 ميليلتر من الجلسرين 6% على شريحة زجاجية ووضع كل من البويضات من carpels تشريح في الحل باستخدام الملقط مقلوب غرامة. ضع ساترة على الشريحة بلطف.</li>
		<li>كما يمكن منع البذور معطف والسويداء في كل ovule مراقبة إشارات التجارة والنقل في الجنين، استخراج الجنين من أبل. انقر فوق الشريحة بسرعة و بلطف قذف الجنين من ovule (أكثر نضجاً ovule، ينبغي أن تطبق قوة أقل على الشريحة).</li>
		<li>تفحص الشريحة للأسفار التجارة والنقل باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. البحث عن الأجنة المعزولة تحت حقل طاقة منخفضة (10 X) وتسجيل مواقعها، ثم قم بتغيير إلى حقل عالية الطاقة (النفط غمر عدسة 100 X) لمراقبة التعبير DR5-التجارة والنقل في الأجنة بإعداد مصدر الضوء الإثارة إلى 488 نانومتر للكشف عن إشارة التجارة والنقل.</li>
		<li>الكشف عن تعبير بروتينات فلورية خضراء في الأجنة لتحديد خط T3 مناسبة لمزيد من التحليل.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. وصف تشكيل نمط الجنين في المسخ الجنين الفتاكة عن طريق إزالة Ovule وعلامة البروتين المراقبة: Naa10 كمثال
<ol>
	<li>الزخرفة الجنين في نباتات متحولة naa10
	<ol>
		<li>إعداد المواد النباتية وكما هو مبين في 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>تحديد naa10+ − النباتات ببكر استخدام الجينات محددة كبسولة تفجير5، ومارك ثم براعم الزهور ل ناه10+ − النباتات كما هو مبين في 1.1.8.</li>
		<li>تؤدي إزالة ovule والفحص المجهري ل ناه10+ − الأجنة كما هو مبين في 1.2 و 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>تحليل البروتين علامة باستخدام أجنة naa10
	<ol>
		<li>الحصول على خطوط المعدلة وراثيا DR5-بروتينات فلورية خضراء مناسبة باستخدام الإجراء المبين في 2.1-2.2.</li>
		<li>عبور خط DR5-التجارة والنقل المعدلة وراثيا متماثل مع ناه10+ − المصنع للحصول على ناه10+ − النباتات متماثل لعلامة fluorescence بروتينات فلورية خضراء في الجيل F2 (المعرفة بواسطة PCR الخاصة بالجينات) لوصف naa10+ −5 ونلاحظ إشارة بروتينات فلورية خضراء تحت مجهر باستخدام خط DR5-بروتينات فلورية خضراء متماثل.</li>
		<li>وضع علامة على براعم الزهور ل ناه10+ − النباتات التي يتم متماثل التجارة والنقل DR5 كما هو مبين في 2.1.7.</li>
		<li>البحث عن إشارة بروتينات فلورية خضراء في الأجنة naa10 التي متماثل التجارة والنقل DR5 كما هو مبين في 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li><li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+flowering+plants:+setting+up+the+basic+body+pattern.">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li><li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model.">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li><li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+plant:+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis.">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li><li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+monopteros+gene+in+organising+the+basal+body+region+of+the+Arabidopsis+embryo.">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis.">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation.">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li><li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aux/IAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements.">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li><li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis.">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li><li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8.">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li><li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein.">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

إزالة ovule طريقة مفيدة للكشف عن انقسام الخلية وتقييم مورفولوجيا أثناء امبريوجينيسيس في نبات؛ باستخدام هذا الأسلوب، يمكن ملاحظة الأجنة مباشرة تحت المجهر DIC5،12. أن الخطوة الحاسمة لإزالة ovule خطوة 1.3.4. الوقت اللازم لإزالة أبل في الخطوة 1.3.4 متغير. يمكن ملاحظة الأجنة في المرحلة 2/4-خلية وضوح بعد ح 2 في الحل هوير، بينما تبدو واضحة بعد 12 ساعة. وهكذا، أكثر نضجاً ovule، يعد الوقت اللازم للتخليص.
في خطوة 2.2.5، عزل جنين من أبل، مقدار القوة المطبقة على الشريحة الحرجة. يمكن أن تسحق الأجنة إذا تم تطبيق الكثير من القوة؛ ومع ذلك، لا مقذوف جنين من أبل إذا كان يتم استخدام قوة صغيرة جداً. في تجربتنا، ovule أكثر نضجاً، مطلوب قوة أقل. يمكن أن تكون معزولة المرحلة الطوربيد والأجنة الناضجة مباشرة بواسطة تقشير فتح ovule استخدام إبرة محقن. كما قد دمرت بعض خلايا تعليق في الجنين معزولة أثناء عملية العزل، قد يكون إشارة الأسفار من تعليق المفقودة أو غير كاملة. قيد آخر لهذا الأسلوب أن الأجنة قبل المرحلة 4-الخلية التي كانت صعبة للعثور على من الأجنة مقذوف كما أنها صغيرة جداً ومحمية بشظية ovule.
مرحلة النمو والتشكل للجنين يمكن أن تتأثر بتحول بعض الجينات؛ يمكن إثبات هذه الآثار بالفحص المجهري بعد إزالة أبل. هذا النهج سوف تساعد في فهم هذه الآلية الجزيئية التي embryogenesis التوسط جينات محددة5. يمكن مراقبة نمط التعبيرالتجارة والنقل الانصهار الجينات الوظيفية غير معروف-أثناء امبريوجينيسيس بتوفير ارتباط بين الزخرفة الجنين والتعبير عن ذلك الجين، وتيسير تحديد الجينات الجديدة التي مطلوبة من أجل امبريوجينيسيس في نبات13. وهكذا، ينص البروتوكول على الموصوفة هنا وسيلة أساسية لوصف امبريوجينيسيس في نبات.

امبريوجينيسيس هو الحدث أقرب في أعلى النبات التنمية. أشكال جنين ناضجة من الزيجوت عن طريق انقسام الخلايا وتمايزها تحت رقابة صارمة على الوراثية1،2. أجنة نبات نموذجا مفيداً لدراسة مراقبة morphogenesis لأنه يتبع تسلسل انقسامات الخلية أثناء امبريوجينيسيس نمط المتوقع3،4. ومع ذلك، جنين نبات يحتوي على واحد إلى عدة خلايا صغير جداً مراعاتها وتحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسبب الطفرة لبعض الجينات الجنين الفتك5، مما يشير إلى الدور الرئيسي لتلك الجينات في امبريوجينيسيس. وصف تشكيل نمط في طفرات الجنين الفتاكة يوفر أساسا لفهم الآلية الجزيئية بموجبه تنظيم الجينات الأساسية تنمية الجنين.
يتم وصف طريقة مفصلة هنا لوصف تشكيل نمط الجنين في المصنع النموذجي نبات بالملاحظة المجهرية المباشرة. الأسلوب الذي ينطوي على إزالة ovule تليها المراقبة المجهرية للجنين. ويرد أيضا وصف المسخ الجنين الفتاكة.
يمكن تحديد مورفولوجية الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة مباشرة عن طريق الفحص المجهري باستخدام البويضات التي أزيلت مع هوير لحل6،7. هذه البويضات يحمل إنكسار عالية؛ وهكذا، ovule هذا مسح الأسلوب مفيد خاصة للعينات التي يجب مراعاتها قبل التدخل التفاضلية التباين (DIC) الفحص المجهري.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الجينات التي يتم التعبير عنها في خلية معينة أو عدد محدود من الخلايا أثناء embryogenesis كعلامات لتحديد الخلايا في جنين. ولذلك، يمكن المشروح مواصفات هوية الخلية أثناء امبريوجينيسيس عن طريق رصد التعبير عن البروتينات بروتينات فلورية خضراء معلم علامة باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. على العكس من ذلك، مراقبة نمط التعبيرالتجارة والنقل الانصهار الجينات الوظيفية غير معروف-أثناء embryogenesis يمكن توفير ارتباط بين الجنين الزخرفة والتعبير عن ذلك الجين، وتيسير تحديد الجينات الجديدة التي مطلوبة من أجل امبريوجينيسيس في نبات.
يمكن أيضا استخدام الأسلوب الموصوفة هنا تميز النمط الظاهري المسخ الجنين الفتاكة، وتحديد أثر الجينات المتضررة على امبريوجينيسيس على المستوى الخلوي. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع مقارنة بين نمط التعبير للجينات ماركر خلال امبريوجينيسيس بين النباتات البرية من نوع ومتحولة، الطريقة يمكن أن تسفر عن أدلة حول الآليات الجزيئية ومسارات الإشارات المشتركة في امبريوجينيسيس8،9. في الواقع، تم تطبيق الأسلوب للنباتات naa10 ، ووجد أن الشعبة غير طبيعي من النخامية في المسخ قد تنجم عن تغيير في توزيع اكسين خلال embryogenesis5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Chloral Hydrate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15307</td>
			<td style="width:293px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phytagel</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Hygromycin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber&#160;</td>
			<td>Percival</td>
			<td style="width:119px;">CU36L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss Image M2</td>
			<td>camera: AxioCam 506 color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss LSM 5</td>
			<td>filters: BP 495-555 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Axio Zoom V16</td>
			<td>camera: AxioCam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient-rich&#160;soil</td>
			<td colspan="2">KLASMANN, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">10% sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KOH</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture dish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vermiculite</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass slide</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syringe needle</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fine-tipped tweezers</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">super clean bench</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis

نظراً لطبيعة شديدة يمكن التنبؤ بها لتنميتها، استخدمت أجنة نبات كنموذج للدراسات morphogenesis في النباتات. ولكن الأجنة النباتية المرحلة المبكرة الصغيرة وتحتوي على بعض الخلايا، مما يجعل من الصعب مراقبة وتحليل. يتم وصف أسلوب هنا لوصف تشكيل نمط في الأجنة النباتية تحت مجهر باستخدام نموذج الكائن الحي نبات. بعد إزالة البويضات الطازجة الحل هوير باستخدام، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الأجنة وعدد الخلايا في، ومرحلة إنمائية يمكن أن تحددها التدخل التفاضلية تباين مجهرية باستخدام 100 × النفط غمر عدسة. وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد التعبير عن البروتينات علامة محددة معلم مع أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) لإضافة تعليق توضيحي مواصفات هوية الخلية أثناء الزخرفة الجنين بالليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة تشكيل نمط في الأجنة النباتية البرية من نوع المستويات الخلوية والجزيئية، وتلخص الدور جينات محددة في الزخرفة الجنين بمقارنة تشكيل نمط في الأجنة من النباتات البرية من نوع وطفرات الجنين الفتاكة. ولذلك، يمكن استخدام الأسلوب تميز embryogenesis في نبات.

يمكن استخدام الطريقة الموضحة في هذه الورقة لمراقبة embryogenesis مباشرة تحت مجهر، وإضافة تعليق توضيحي لمواصفات هوية الخلية أثناء embryogenesis مع علامات محددة، وتلخص دور الجينات خاصة أثناء امبريوجينيسيس.
وتظهر نتائج تمثيلية من التحليل للجنين الزخرفة (من مرحلة الزيجوت ممدود إلى مرحلة ناضجة عصا المشي) في البرية من نوع نبات في الشكل 2. بعد إزالة أبل، ويمكن تمييز الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة بمدينة دبي للإنترنت مجهرية (الشكل 2). تم تسجيل نمط التعبير DR5-التجارة والنقل خلال embryogenesis تحت [كنفوكل] ليزر المسح المجهري (الشكل 3) تحديد توزيع اكسين في الجنين ودراسة الدور المحتمل اكسين أثناء امبريوجينيسيس في نبات.
يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتوصيف أدوار جينات محددة أثناء امبريوجينيسيس. هنا، تم بحث دور Naa10 أثناء امبريوجينيسيس في نبات كمثال. وقد لوحظ شعبة غير طبيعي النخامية (شعبة بميل والعمودي من النخامية في Naa10 بالمقارنة مع شعبة غير المتناظر عرضية من النخامية في النباتات البرية من نوع، الرقم 4). توزيع اكسين في مرحلة كروي تقريبا موحدة في معظم Naa10 الأجنة والإبقاء عليه إشارة أوسع نطاقا في النخامية، مقارنة بالأجنة نوع البرية (الشكل 5). تشير هذه النتائج إلى أن Naa10 مطلوب امبريوجينيسيس، وأن ذلك قد يكون متورطا في امبريوجينيسيس عن طريق اكسين إشارات الطريق في نبات.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig1.jpg"> 
الشكل 1: رسم تخطيطي لتشريح نبات خردلة. تم لصق (A) خردلة يعلق على الشريحة الزجاجية بقطعة من الشريط اللاصق على الوجهين. (ب) الصورة الموسع في مربع في ألف. السطرين وهمي تمثل الموقع الذي تريد تقسيمه. (ج) صورة خردلة انقسام في المربع دال (د) صورة خردلة انقسام الموسع. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig2.jpg"> 
الشكل 2: دراسة امبريوجينيسيس في البرية من نوع (Col-0) نبات بالفحص المجهري DIC. اقحه الونجاتيد (A). (ب) المرحلة 1-خلية الجنين في 1 حزب العمل الديمقراطي. (ج) المرحلة 2/4 خلايا الجنين في 2 مديرية إدارة السجون. (د) مرحلة جنين أوكتانت في 3 مديرية إدارة السجون. (ﻫ) ديرماتوجين مرحلة الجنين في 3 مديرية إدارة السجون. (و) جنين كروي مرحلة الأولى في 4 مديرية إدارة السجون. (ز) الجنين كروي المرحلة المتأخرة في 5 مديرية إدارة السجون. (ح) قلب الجنين مرحلة في 6 مديرية إدارة السجون. (أنا) جنينا مرحلة طوربيد في 7 مديرية إدارة السجون. (ي) عصا المشي مرحلة جنين في 8 مديرية إدارة السجون. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig3.jpg"> 
الشكل 3: نمط التعبير DR5 في أجنة نبات البرية من نوع (Col-0). ( - د) إشارات التجارة والنقل. (أ-د) الصور المدمجة مع الصور الميدانية مشرق. وأعرب DR5 في القطب الجذري للمرحلة البرية من نوع كروي ( و ألف، 4 مديرية إدارة السجون) وقلب الأجنة المرحلة (ب و ب، 6 مديرية إدارة السجون). وأعرب DR5 أيضا في نصائح كوتيليدون الجنينية (ج ج، 7 مديرية إدارة السجون) والمفرج ناضجة البرية من نوع الأجنة (د د، 8 حزب العمل الديمقراطي). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig4.jpg"> 
الشكل 4: وصف دور Naa10 أثناء امبريوجينيسيس في نبات. التقسيم العادي النخامية في نبات البرية من نوع (A). يتم وضع علامة تقسيم غير طبيعي النخامية في نباتات متحولة Naa10 مع خط أبيض في (ب) (شعبة بميل النخامية) و (ج) (تقسيم عمودي النخامية). تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55969/55969fig5.jpg"> 
الشكل 5: DR5 "التعبير نمط كروي المرحلة" البرية من نوع (Col-0) نبات والأجنة Naa10 . ( و ب) إشارات التجارة والنقل. (أ و ب) الصور المدمجة مع الصور الميدانية مشرق. وأعرب DR5 في القطب الجذر جنين كروي المرحلة البرية من نوع(و ألف) . وأعرب تقريبا موحد في جنينا Naa10 مرحلة كروي DR5 والإبقاء على إشارة أوسع نطاقا في النخامية بالمقارنة مع نوع البرية (ب و ب). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55969/55969fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis at JoVE.com

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لمراقبة امبريوجينيسيس في نبات عن طريق إزالة ovule متبوعاً بالتفتيش على تشكيل نمط الجنين تحت مجهر.

أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

a-method-for-characterizing-embryogenesis-in-arabidopsis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

11.0K Views.  Capital Normal University. ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لمراقبة امبريوجينيسيس في نبات عن طريق إزالة ovule متبوعاً بالتفتيش على تشكيل نمط الجنين تحت مجهر.

Video: A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

طريقة دراسة حلقي فيوجن باستخدام ثابت الجهاز الثقافة

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection لTransgenesis والجينوم التحرير في Threespine أبو شوكة

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

التصور "ناصف العين العليا" خلال Embryogenesis ريريو دانيو

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...