This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.

استخدام الحيوانات يتبع الإجراءات المنصوص عليها في بروتوكول M / 11/181 التي وافق عليها فاندربيلت المؤسسات ورعاية الحيوان واستخدام اللجنة لقو. تم شراء CD1 أو CBA / BL6 الفئران من الباعة التجارية وعبروا في منشأة الحيوان فاندربيلت للحصول على الفئران حديثي الولادة. 1. إعداد الفئران، سهم حلول ومعدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالصليب الماوس: انشاء عبر الماوس وتسجيل مواعيد توصيل للمساعدة في تخطيط التجريبية. الفئران CD1 عادة ما تلد حول يوم 19 بعد التزاوج. استخدام CD1 أو CBA / BL6 يعبر الحصول على CD1 أو CBA / BL6 حديثي الولادة، على التوالي. Intercrosses بين الخطين الاستفادة من الإناث والذكور CD1 CBA / BL6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسهم كولاجيناز: تزن 200 ملغ كولاجيناز النوع الرابع برصيد عالية الدقة. نقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تذوب في 40 مل HBSS مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ (1.26 و 0.5 ملم على التوالي) لجعل 5 ملغ / مل محلول المخزون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح كولاجيناز لحل ل~ 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف. قسامة والحفاظ على حل المجمدة في -20 درجة مئوية والأوراق المالية، والتي تبقى نشطة لمدة سنة على الأقل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف لتعقيم عدة أزواج من ملاقط، مقصات، ونصائح P20 للتشريح وقطف جزيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسهم الجلوكوز 1 M: وزن 9 ز الجلوكوز في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، إضافة 50 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام إلى حل الجلوكوز. نضع في 4 درجات مئوية حتى استخدامها، ولكن ليس أكثر من 6 أشهر. </li></ol> 2. حلول العمل ملاحظة: يوم من العزلة جزيرة، وإعداد الكواشف التالية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنوع كولاجيناز حل رابعا العمل: ذوبان الجليد وتمييع الأسهم كولاجيناز على الجليد. الاستغناء 0.15 الأسهم مل في كل microfuge أنبوب مل 1.7. إضافة 1.35 مل HBSS مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+. عكس الأنبوب 5 مرات. ترك على الجليد لمدة 15 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور بسرعة عالية لمدة 3 دقائق في microcentrifuge. نقل طاف لأنبوب جديد. ترك على الجليد حتى الاستخدام. تجاهل أنبوب مع الحطام غير قابلة للذوبان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكامل RPMI 1640 وسائل الإعلام: إضافة 2.5 مل 1 M جلوكوز، 50 مل الحرارة المعطل FBS و 5 مل الأسهم 100X القلم بكتيريا إلى 500 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام. ترك على الجليد حتى الاستخدام. </li></ol> 3. عزل البنكرياس والهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء حديثي الولادة مع isoflurane، تليها قطع الرأس وفقا لبروتوكولات المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس مع بطنها مواجهة. رذاذ مع الايثانول 70٪ لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الجلد حتى البطن مع ملاقط وقطع الجلد والعضلات طبقات طوليا على طول خط الوسط مع زوج من مقص، من منطقة الأعضاء التناسلية إلى القفص الصدري. هذا يفتح تجويف البطن لفضح جميع الأعضاء الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جميع الأعضاء الداخلية إلى صحن 100 سم مع زوج من ملاقط. تحديد موقع البنكرياس، الذي يقع على بعد الجهاز المنتشرة مع جزء الظهرية أن يتمسك المعدة والطحال وجزء بطني أن يتمسك الاثني عشر (11). </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة HBSS في طبق لغمر الأجهزة. في الحل، وأنسجة البنكرياس لم يعد التمسك الاثني عشر والمعدة، أو الطحال. فمن التعرف عليها بسهولة تحت نطاق تشريح بسبب لونه الأبيض المعتاد. استخدام زوج من ملاقط لقشر أنسجة البنكرياس بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها، ونقلها إلى طبق جديد 60 ملم مع HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كل البنكرياس مع مقص الى قطع أصغر من 5 ملم عبر أي أبعاد. نقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. ما يصل الى خمسة بنكرياسات (الذين تقل أعمارهم عن P7) يمكن هضمها في أنبوب واحد. بالنسبة للفئران P8-P16، استخدام أنبوب واحد في البنكرياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 - حل العمل 1 مل كولاجيناز لكل أنبوب (0.2 مل لكل البنكرياس P1-P7 استخدام 0.5 مل لكل البنكرياس P8-P16). ترك الأنبوب في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 15 دقيقة. عكس الأنبوب مرتين كل دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ~ 5 دقائق، والاستفادة من أنبوب لمراقبة حالة هضم أنسجة البنكرياس. مواصلة عملية الهضم حتى أكثر من البنكرياسيبدو الأنسجة مجموعات الخلايا كما مجزأة، مع قطر &lt;2 مم. سوف تظهر المحللة غائم، والذي يرجع إلى وضعها الطبيعي انحلال ذاتي خلية عنيبية. </li></ol> 4. المحللة الغسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور المحللة في 500 x ج لمدة 10 ثانية في microcentrifuge. إزالة طبقة طاف مع pipetman P1،000. يجب أن تظهر طاف العكرة ولكن خالية من مجموعات الخلايا. لا تستخدم الطموح، والتي قد نضح بسرعة بعيدا شظايا الأنسجة في الجزء السفلي بسبب وجود بعض الحمض النووي لزجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام كاملة. الاستفادة من أنبوب بلطف إلى resuspend والمحللة مجزأة. عكس صعودا وهبوطا 10 مرات. كرر الخطوة 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.2 مرتين أخريين أو حتى يظهر طاف واضح. اعادة تعليق أجزاء البنكرياس غسلها في 1 مل كاملة RPMI 1640 وسائل الإعلام. </li></ol> 5. جزيرة العزلة ملاحظة: للحصول على أعداد صغيرة من بنكرياسات، ومن ناحية اختيار المباشرة على النحو التالي (5.1) يمكن استخدامها لISOL جزيرةأوجه. لأعداد كبيرة من بنكرياسات (&gt; 6)، ويفضل الطريقة الموضحة في 5.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشر ناحية قطف: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحللة من الخطوة 4.3 إلى صحن 60 ملم. إضافة 5 مل كاملة RPMI 1640 وسائل الإعلام. يجمع تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإضاءة الحقل مشرقة على المجهر. ضبط شدة الضوء إلى ~ 50٪ من الطاقة القصوى. تحت هذا الشرط، تظهر الجزر كما قليلا مجموعات الوردي، في حين أن خلايا عنيبية مجموعات على شكل غير النظامية، والظلام (الشكل 1A). ينصح التكبير من ~ 50X (الجمع بين قوة الهدف وعدسة المجهر) لتقديم أفضل وسيلة لجزر تصور وافتتاح طرف الماصة في وقت واحد لاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الجزر مع P20 ماصة مع تجنب التجمعات عنيبية. كسور الاستغناء الجزر التخصيب إلى طبق جديد 60 ملم مع RPMI وسائل الإعلام كاملة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية قطف اليد مرتين أكثر. ترك الجزر النقية في 60 الجديدطبق ملم مع 4 مل وسائل الاعلام RPMI كاملة (الشكل 1C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي التدرج: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنبوب الطرد المركزي 15 مل التي تم تحميلها مسبقا مع 2 مل polysucrose والصوديوم دياتريزوات في كثافة 1.077 غرام / مليلتر. ترك الأنبوب على الجليد حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق من الخطوة 4.3 على الجزء العلوي من polysucrose والصوديوم حل دياتريزوات مع ماصة باستور. لا تخل الطبقة السفلية. الأنسجة من ما يصل الى 10 المولود حديثا أو 2 P17 بنكرياسات يمكن تحميلها في كل أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الأنبوب في ~ 600 x ج في البديل الدوار لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. استخدام إعدادات قبالة الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، ونقل وسائل الإعلام وطبقات البيني (لاحظ أنه في ظل ظروف التشغيل المثالية، سوف يكون موجودا في الجزر في الطور البيني بين polysucrose والثقافة وسائل الإعلام بعد الطرد المركزي) إلى جديد 15 مل أنبوب. إضافة 10 مل سائل الإعلام، مزيج بلطف ولكن بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل جزء التخصيب جزيرةفي 300 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة وسائل الإعلام غسل. تكرار غسل واحد لمزيد من الوقت مع وسائل الاعلام RPMI كاملة. الكريات Resuspend في 4 مل وسائل الإعلام، والتي في معظمها يحتوي على الجزر والقنوات (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن ناحية اختيار الجزر على النحو المبين في القسم 5.1. </li></ol></li></ol> 6. فحوصات هيئة التأمين في الفشوت المعزولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجزر من الخطوة 5.1.4 في وسائل الإعلام RPMI كاملة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة لإزالة RPMI تحت المجهر تشريح. إضافة 3 مل من محلول KRB مع 2.8 ملي الجلوكوز إلى لوحة 3. دوامة 10 مرات لغسل الجزر. إزالة حلول KRB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية الغسيل مرة واحدة. احتضان الجزر مع 3 مل من محلول KRB عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 1 مل KRB في كل بئر من لوحة ال 12 أيضا. قبل تدفئة الأسهم KRB ولوحة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الجزر مرتين مع درجة حرارة ما قبل KRB كما في 6.2. عبرفر 10 الجزر إلى كل بئر من لوحات ما قبل تحسنت. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 45 دقيقة، وسحب 50 ميكرولتر من طاف. ويتضمن هذا الحل الأنسولين يفرز تحت الجلوكوز القاعدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 32 ميكرولتر 500 ملي الجلوكوز. دوامة لوحة 20 مرات لخلط الحل. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية. دوامة لوحة 5 مرات مرة واحدة كل 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 45 دقيقة، وسحب 50 ميكرولتر طاف. هذا هو الأنسولين يفرز تحت ارتفاع نسبة الجلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جميع الجزر إلى أنبوب 1.5 مل. تجميد في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تكرار عملية التجميد والذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل 70٪ من الإيثانول مع 20 ملم حمض الهيدروكلوريك. ترك بين عشية وضحاها. هذا هو الانسولين اليسار في الجزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ELISA التقليدية لفحص مستويات الانسولين، التي سبق وصفها 3. </li></ol>

<ol>
	<li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation.">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells.">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li><li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes:+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes.">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li><li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy.">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li><li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans.">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li><li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K++channels.">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li><li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells.">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li><li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3.">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li><li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans.">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li><li>Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. A., Sto&#382;er, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445 (2015).</li><li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).</li><li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas.">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li><li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass.">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests for the described work.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة على عزلة جزيرة من بنكرياسات التي هي صغيرة جدا لنضح التقليدية. ومن المتوقع أن تسفر عن الجزر جاهزة لجميع الدراسات القائمة على جزيرة مثل تنقية خلايا بيتا، تحليل التعبير الجيني، جزيرة نضوج خلايا بيتا، والانتشار، استجابات التوتر الخلية، وبقاء الخلية، والتمثيل الغذائي، وصيانة التأمين الحكومية الوظيفية وغيرها. وسيكون هذا، لعلمنا، أول بروتوكول البصري المفصل الذي يوجه الباحثين الجدد لأداء عزل خلايا البنكرياس من الفئران حديثي الولادة. من دون هذه مساعديه البصرية، ومن المتوقع التجربة والخطأ واسعة لمعظم الباحثين لتحقيق نجاح عزلة جزيرة من بنكرياسات صغير. العامل الأكثر أهمية لنجاح العزلة جزيرة هو درجة مناسبة من هضم البنكرياس على النحو المبين في الخطوات 3،6-3،8. بشكل عام، سواء كيل والإفراط في الهضم تقليل العائد جزيرة. الإفراط في هضم المزيد من التنازلات العمارة خلايا البنكرياس، الذي ماكوفاق لهم غير المؤهلة للالمقايسات الفنية. لتحقيق أفضل النتائج الهضم، فإن رد الفعل لابد من رصد مستمر لتصور عملية تفتيت الأنسجة. عد على مدة الهضم للحكم على فصل عنيبية جزيرة هي أقل طريقة يمكن الاعتماد عليها، لأن كل دفعة من كولاجيناز مختلفة وعمر / حجم البنكرياس بدءا عميقا يؤثر على عملية الهضم. في حالة نقص الهضم، مجموعات كبيرة الغدد الصماء خارجية الإفراز يمكن غسلها في HBSS وهضمها مرة أخرى مع كولاجيناز. عملية الهضم ومن ثم يمكن رصدها مباشرة تحت المجهر تشريح لتحديد الوقت لاستمرار عملية الهضم. ويمكن أيضا أن تستخدم pipetting لطيف لتفكك النسيج مساعد. في هذه الحالة، أن تستخدم معلومات سرية P1،000 ذوي الاحتياجات فتح على مصراعيه، مما يقلل من قوة القص التي يمكن أن تدمر الهيكل جزيرة. لا ينصح الإفراط في هضم الجزر بالنسبة لمعظم دراسات لاحقة، ولكن يمكن استخدامها لبعض المقايسات، مثل تحليل التعبير الجيني مع يتنبهضوابط لتر. بجانب الحذر أعلاه، مع إيلاء الاهتمام لعدة عوامل إجرائية يمكن زيادة تحسين العائد جزيرة النهائي والجودة. أولا، الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ ينبغي أن تدرج في جميع الحلول، لو تم استغلال مصادر غير التجارية. ضرورية للحفاظ على سلامة الجزيرة هذه الكاتيونات. ثانيا، حل كولاجيناز جديدة مع ارتفاع النشاط أمر ضروري. حل كولاجيناز مع نتائج النشاط منخفضة في وقتا أطول للتفكك الأنسجة. هذا يسبب انحلال ذاتي كبير الخلايا الإفرازية وتدمير خلايا البنكرياس. تحقيقا لهذه الغاية، وذلك باستخدام الأسهم كولاجيناز مع أكثر من ثلاث جولات من تجميد لاذابة غير مستحسن. ويوصى الثالث، وانخفاض سرعة الطرد المركزي أثناء غسل الأنسجة. وبحكم التجربة هو استخدام القوة AG (&lt;500 x ج) غير كافية لالمترسبة في مجموعات الخلايا في حين الحفاظ على حطام خلية في طاف في الخطوة 4.1 من البروتوكول. هذه السرعة ليس فقط تتجنب تدمير الجزر، ولكن تساعد أيضا إلى remoلقد حطام خلية لتمكين أسهل التصور جزيرة أثناء قطف اليد. وأخيرا، كولاجيناز لا يمكن المعطل بواسطة المصل 12. وهكذا، زواله عن طريق غسل أمر ضروري لضمان سلامة خلايا البنكرياس في دراسات لاحقة. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن بروتوكول المعروضة ينبغي أن يقتصر على بنكرياسات الماوس من P1 إلى P17. أنها لا تعمل بشكل جيد لبنكرياسات مضى عليها أكثر من P18. ويوصى نضح التقليدي لهذه الفئران الأكبر سنا عن عوائد أفضل والجزر صحة. وعلاوة على ذلك، والخلفية الوراثية والعمر من الفئران تؤثر تأثيرا عميقا في 13،14 العائد جزيرة. لذلك، وحتى الظروف المثلى تسفر عن عدد مختلف من الجزر في البنكرياس، وهو أمر طبيعي ومتوقع.

Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies. 
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Collagenase&#160; Type IV</td>
			<td style="width:253px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:128px;">C5138</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:169px;">1X HBSS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:253px;">Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>MT21020CV</td>
			<td style="width:219px;">If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:169px;">RPMI 1640 w/o glucose</td>
			<td style="width:253px;">Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td>
			<td>11879-020</td>
			<td style="width:219px;">Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Glucose</td>
			<td style="width:253px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>G-7021&#160;</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:169px;">polysucrose and sodium diatrizoate solution</td>
			<td style="width:253px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>Histopaque-10771</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:253px;">Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Stemi2000</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:253px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica M165</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>Centrifuge 5417C</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Centrfuge</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">15-ml centrfuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">50-ml centrfuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-658</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Precision balance</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>87003-294</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Pipetman P1000</td>
			<td style="width:253px;">Fisher Scientific,&#160; Waltham, MA</td>
			<td>F123602</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Pipetman P20</td>
			<td style="width:253px;">Fisher Scientific,&#160; Waltham, MA</td>
			<td>F123600</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">100X15 millimeter dish</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25384-088</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">60X15 millimeter dish</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25384-168</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:169px;">12-well plates</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>665-180</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:169px;">Scissor</td>
			<td style="width:253px;">Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td>
			<td>14080-11</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Tweezers</td>
			<td style="width:253px;">Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td>
			<td>5708-5</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:169px;">CD1 mice</td>
			<td style="width:253px;">Charles River Laboratories, Wilminton, MA&#160;</td>
			<td>CD-1</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:169px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:253px;">The Jackson laboratory, Farmington, CT&#160;</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">B6CBAF1/J</td>
			<td style="width:253px;">The Jackson laboratory, Farmington, CT&#160;</td>
			<td>B6CBAF1/J</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas

وراسخة وبروتوكولات جزيرة العزلة القائمة على نضح من بنكرياسات الثدييات الكبيرة. وتجرى هذه البروتوكولات بسهولة في العديد من المختبرات نظرا لحجم كبير من القناة البنكرياسية التي تسمح للحقن كولاجيناز جاهزة ونضح الأنسجة لاحق. في المقابل، جزيرة العزلة من بنكرياسات صغير، مثلها في ذلك مثل الفئران حديثي الولادة، يمثل تحديا لنضح هو غير قابل للتحقيق في بنكرياسات الصغيرة بسهولة. نحن هنا وصف الإجراء بسيط مفصل أن يسترد أعداد كبيرة من الجزر من الفئران الوليدة بمساعدة البصرية. تم هضمها تشريح حديثا بنكرياسات كله مع 0.5 ملغ / مل كولاجيناز الرابع الذائبة في هانكس &quot;محلول الملح المتوازن (HBSS) عند 37 درجة مئوية، في أنابيب microcentrifuge. تم استغلالها أنابيب بانتظام للمساعدة في تشتيت النسيج. عندما فرقت معظم الأنسجة في مجموعات صغيرة حوالي 1 ملم، وكانت تغسل لست] 3-4 مرات مع وسائل الإعلام والثقافة مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS). مجموعات خلايا البنكرياس،تخلو من الأنسجة عنيبية التعرف عليها، ومن ثم يمكن استردادها تحت تشريح المجسام. هذه الطريقة للشفاء 20-80 الصغيرة والجزر الكبيرة الحجم في البنكرياس من الماوس ولدوا حديثا. هذه الجزر هي مناسبة لفحوصات المصب أكثر يمكن تصورها، بما في ذلك إفراز الأنسولين، التعبير الجيني، والثقافة. وقدم مثالا على فحص إفراز الأنسولين للتحقق من صحة عملية العزل. الخلفية الوراثية ودرجة الهضم هي أكبر العوامل التي تحدد العائد. ويفضل تقدم طازجة حل كولاجيناز مع ارتفاع النشاط، كما أنها تساعد في عزلة الغدد الصماء الإفرازية. وجود الكاتيونات [الكالسيوم (الكالسيوم 2+) والمغنيسيوم (مغ 2+)] في كل الحلول ومصل بقري جنيني في غسل / ضرورية لمحصول جيد من الجزر مع السلامة المناسبة وسائل الاعلام اختيار. وهناك نطاق تشريح مع تباين جيد والتكبير يساعد أيضا.

تحت الظروف المثلى، يمكن أن الطريقة المعروضة تسفر 20-80 الجزر من البنكرياس كل فأر صغير. يعتمد هذا العدد على خلفية وراثية، وعمر الفئران، وحجم الجزر التي سيتم استردادها. بين يشيع استخدامها، CD1 خارج لدت وC57BL / 6J الفئران الأصيلة تنتج أقل الجزر مع حجم أصغر من الهجينة بين CD1 وC57BL / 6 أو B6CBAF1 التجارية / J الفئران تفعل. ومن ناحية المباشرة اختيار عموما قدم عدد أصغر من الجزر، من المحتمل بسبب استبعاد من الجزر الصغيرة التي يمكن أن يكون من الصعب التعرف عليها عند مزجه مع الأنسجة الإفرازية (الشكل 1A-C). الطرد المركزي التدرج يمكن أن تسفر عن المزيد من الجزر، بما في ذلك الجزر الصغيرة في مزيج (1D الشكل). تنتج الفئران الأكبر سنا أيضا أكثر وأكبر الجزر، كما هو متوقع من استمرار انتشار جزيرة بعد الولادة. ومن المثير للاهتمام، وعدد جزيرة تعافى لا ترتبط مباشرة مع حجم البنكرياس: الفئران CD1 وعادة ما يكون البنكرياس أكبر من بروغ F1إينس لمن CD1 وC57BL / 6J الفئران عبور. بعد تنتج عادة الفئران CD1 الجزر أقل من السلالات F1. إما insufficient- أو الإفراط في الهضم مع نتائج كولاجيناز في عزلة الجزيرة دون المستوى الأمثل. في الحالة الأولى، الجزر الكبيرة يمكن تصور بسهولة، ولكن بعض الجزر لا يمكن فصلها تماما من الأنسجة عنيبية (الشكل 2A). وهذا سوف يقلل العائد من الجزر الصغيرة، ولكن يتم إنتاج الجزر الكبيرة عادة. في الحالة الأخيرة، الأنسجة عنيبية يمكن فصلها تماما عن الجزر. بعد هذه التنازلات هيكل جزيرة، مما أدى إلى العديد من الجزر مع السطوح الخشنة (الشكل 2B). ويتوقع لمحات إفراز الأنسولين الجزر حديثي الولادة معزولة بسبب هذا الأسلوب. على سبيل المثال، عرض كل من P1 و P7 الجزر ارتفاع إفراز الأنسولين القاعدي (الشكل 3، مقارنة مستويات افراز الانسولين عند 2.8 ملي الجلوكوز بين هذا وذاكالجزر P24 ناضجة ن P1-P7 و)، وملامح هيئة التأمين نموذجية من خلايا بيتا جزيرة غير ناضجة 7 و 9. وهذا يشير إلى أن لدينا عملية عزل جزيرة تحافظ إلى حد كبير خصائص وظيفية من الجزر الولدان. ولذلك فإننا نتوقع أن هذه الجزر هي تناسب المحتمل لفي الدراسات المختبرية المستندة إلى أخرى، بما في ذلك التعبير الجيني، وتحليل التمثيل الغذائي، المقايسات بقاء، واستجابات التوتر. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55160/55160fig1.jpg" /> الشكل 1. مظهر من الجزر خلال عملية عزل. (A) بنكرياسات P1 بعد الهضم كولاجيناز. السهم يشير إلى جزيرة كبيرة نسبيا. وتشير السهام لاثنين من الجزر الصغيرة نسبيا. (ب) P1 الجزر بعد أول جولة ناحية قطف. (C) الجزر بعد 3 الثالثة جولة انتقاء. كسور (D) جزيرة بعد الطرد المركزي التدرج. السهم، وهي جزيرة كبيرة. رأس السهم، لجزيرة صغيرة. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55160/55160fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55160/55160fig2.jpg" /> الشكل 2. الفشوت بعد Insufficient- أو الهضم المفرط مع كولاجيناز. الجزر (A) باليد التقطت بعد تحت الهضم، لاحظ العلاقة بين بعض الجزر (مجموعات وردي، والسهام) وخلايا عنيبية (مجموعات المظلمة، السهام). (ب) الجزر بعد الإفراط في الهضم، لاحظ الجزر مع أسطح خشنة (السهام). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55160/55160fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55160/55160fig3.jpg" /> الشكل 3. التأمين الحكومية بالنتيجهالخبر من الفشوت المعزولة. البيانات المقدمة يعني ± SEM. وهي تمثل نسبة إفراز الأنسولين (كمية الأنسولين الإفراج عن المبلغ الكلي للأنسولين الواردة في الجزر ابتداء) ضمن إطار فحص 45 دقيقة مع تركيز الجلوكوز المشار إليه. الجزر من الفئران مجلس النواب، عن طريق قطف يد المباشر، واستخدمت لهذه المقايسات. لاحظ أن P1 و P7 الجزر اعتبرت غير ناضجة، في حين P24 الجزر هي ناضجة 7 و 9. يتم احتساب القيم P بين المجموعات باستخدام اختبار (ت). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55160/55160fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas at JoVE.com

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

نحن تصف بروتوكول هنا لعزل الجزر سليمة من الفئران حديثي الولادة. تم هضمها بنكرياسات جزئيا مع كولاجيناز، تليها الغسيل وقطف اليد. ويمكن الحصول على 80 مجموعات جزيرة في البنكرياس من الفئران الوليدة، والتي هي مناسبة لعدة دراسات خلايا البنكرياس - 20.

عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

effective-isolation-of-functional-islets-from-neonatal-mouse-pancreas

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  Vanderbilt University Medical School.  نحن تصف بروتوكول هنا لعزل الجزر سليمة من الفئران حديثي الولادة. تم هضمها بنكرياسات جزئيا مع كولاجيناز، تليها الغسيل وقطف اليد. ويمكن الحصول على 80 مجموعات جزيرة في البنكرياس من الفئران الوليدة، والتي هي مناسبة لعدة دراسات خلايا البنكرياس - ...

Video: Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

العزلة والحفظ بالتبريد من الأطفال حديثي الولادة الجرذ العضلية

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

عزل من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من عضلات الماوس الهيكل العظمي

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

القلب والأوعية الدموية التصوير باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالية التردد (MHZ 30/45) الجنينية الماوس

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

كفاءة توليد من البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ الخلفي المعي/البنكرياس "موروث" من هبسكس في "الثقافات الالتصاق"

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

العزلة والتمايز من المقاطع الاساسيه من الماوس الهيكل العظمي العضلات الشرح

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...