This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

<ol>
	<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes.">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li><li>Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pathology+and+the+pathogenesis+of+type+1+and+type+2+diabetes+mellitus+revisited.">Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited.</a> Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).</li><li>Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+travails+in+islet+transplantation.">Current advances and travails in islet transplantation.</a> Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).</li><li>Nath, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+pancreas+transplants+for+patients+with+type+2+diabetes+mellitus.">Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus.</a> Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).</li><li>Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissue+sources+for+new+beta+cells.">Adult tissue sources for new beta cells.</a> Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+to+insulin+secreting+cells:+two+steps+forward+and+now+a+time+to+pause.">Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).</li><li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation.">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li><li>Meier, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).</li><li>Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glucose+on+beta+cells+in+pancreatic+monolayer+cultures.">Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures.</a> Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).</li><li>Brelje, T. C., Sorenson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+prolactin+versus+growth+hormone+on+islet+B-cell+proliferation+in+vitro:+implications+for+pregnancy.">Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy.</a> Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF+signalling+controls+age-dependent+proliferation+in+pancreatic+beta-cells.">PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells.</a> Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+and+mammalian+target+of+rapamycin+pathways+contribute+to+DNA+synthesis,+cell+cycle+progression,+and+proliferation+in+human+islets.">Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets.</a> Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).</li><li>Metukuri, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChREBP+mediates+glucose-stimulated+pancreatic+beta-cell+proliferation.">ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation.</a> Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemical+screen+reveals+that+harmine-mediated+inhibition+of+DYRK1A+increases+human+pancreatic+beta+cell+replication.">A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication.</a> Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+replication+and+beta+cell+function+in+adenovirally-transduced+isolated+rodent+islets.">Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Walpita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+islet+cell+culture+system+for+high-throughput+screening.">A human islet cell culture system for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).</li><li>Miyazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+pancreatic+beta+cell+line+that+retains+glucose-inducible+insulin+secretion:+special+reference+to+expression+of+glucose+transporter+isoforms.">Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms.</a> Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).</li><li>Song, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+inactivation+of+glycogen+synthase+kinase+3beta+(GSK3beta)+by+dual-specificity+tyrosine+phosphorylation-regulated+kinase+1A+(Dyrk1A).">Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A).</a> J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).</li><li>Hohmeier, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+INS-1-derived+cell+lines+with+robust+ATP-sensitive+K++channel-dependent+and+-independent+glucose-stimulated+insulin+secretion.">Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion.</a> Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).</li><li>Cozar-Castellano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+the+first+comprehensive+molecular+characterization+of+cell+cycle+control+in+rodent+insulinoma+cell+lines.">Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines.</a> Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).</li><li>Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transformation+of+a+pancreatic+beta-cell+line+derived+from+transgenic+mice+expressing+a+tetracycline-regulated+oncogene.">Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small-molecule+inducers+of+pancreatic+beta-cell+expansion.">Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).</li><li>Annes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication.">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication.">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li><li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents.">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).</li><li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells.">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, 997-1003 (1995).</li><li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1/insulin+dual-reporter+lentivirus.">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li><li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry,+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets.">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation.">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الطرق التجريبية لدراسة المسارات الجزيئية التي تتحكم في نمو الخلايا وبيتا وتجديد أدوات مهمة للباحثين مرض السكري. هنا، يتم تقديم منصة الفحص القائمة على الفئران جزيرة لتحديد وتوصيف التحفيز والتشجيع جزيء صغير من تكرار β-الخلية. في حين يتم تنفيذ معظم جوانب هذا البروتوكول بسهولة من قبل الباحثين من ذوي الخبرة، تتطلب خطوات قليلة تقنية معينة. أولا، خلال عزل خلايا البنكرياس، إقناء؛ إدخال القنية من الصفراء-القناة دون تعطيل سلامتها يتطلب الممارسة. استراتيجية مفيدة هي لتضخيم الحد الأدنى من القناة الصفراوية لضمان تحديد المواقع المناسبة من الإبرة قبل الاستغناء تماما الحل الهضم البنكرياس. ثانيا، كفاءة العزل جزيرة من الأنسجة الإفرازية تتطلب اهتماما وثيقا لمدة الهضم والتحريض المناسب. يجب توخي الحذر لضمان تسخين حتى في جميع أنحاء هضم من خلال دوامات متقطعة. ثالثا، نجاح التجربة يتوقفالصورة على التمييز يتقن بين الجزر والحطام الإفرازية أثناء اليدوي جزيرة قطف. تحسن هذه المهارة مع الممارسة. رابعا، يتم تشتت جزيرة والطلاء بحيث منتشرة جميع الجزر في خليط من الخلايا وحيدة ومجموعات صغيرة من اثنين أو ثلاثة من الخلايا. فوق وتحت الهضم من الجزر قبل الطلاء تتداخل مع الأداء التجريبي. وينبغي أن تكون مطلية حديثا خلايا جزيرة حوالي 50٪ متموجة قبل أن تنتشر وسمح لنعلق على مدى ساعة 48 دون أن بالانزعاج. يوضح الشكل (1) ومظهر نجاح زراعة الخلايا جزيرة في أوقات مختلفة بعد الطلاء. خامسا، تتم التغييرات الوسائط للثقافات جزيرة خلايا بعناية لتجنب تعطل الخلايا الملتصقة ضعيف. سادسا، يجب أن يتم استرجاع مستضد بحذر لتجنب تشويه لوحة متعددة جيدا لكن بما فيه الكفاية لتمكين الناجح كي-67 تلطيخ وهي حساسة لكلا الناقص والإفراط في التعرض لارتفاع درجة الحرارة؛ لوحات مشوه لا يمكن أن تستخدم لالحصول على الصور الآلي. ملاحظة، والإفراط في البنكرياس الهضم، والتعرض لحطام الأنسجة الإفرازية و / أو trypsinization هي الأسباب الشائعة لفشل ثقافة جزيرة خلايا. واحد الحد من هذا البروتوكول هو الاعتماد على علامات التعبير محددة لهوية β خلايا والأحداث النسخ المتماثل. استخدام علامات واحدة لديه القدرة على أن تكون مضللة. على سبيل المثال، يتم التعبير عن PDX-1 بواسطة β خلايا، مجموعة فرعية من δ الخلايا، معربا عن السوماتوستاتين والأسلاف β-الخلية 29،30. وبالتالي، والمركبات التي تزيد من تكرار PDX-1-خلية قد تكون تعمل خصيصا على السكان غير β-الخلية. ونتيجة لذلك، دراسات تأكيدية التي تستخدم علامات β خلايا بديلة ضرورية. وبالمثل، كي-67 التعبير ليست علامة مثالية للنسخ المتماثل ومؤشرات إضافية مثل BrdU والفوسفات-هيستون 3 ينبغي أن تستخدم 31. والقيد الثاني من هذا الاختبار هو أن المركبات التي تحفز تكرار β-الخلية قد simultaneزيادة ously الخلايا خلايا بيتا أو إلغاء التمايز. وبالتالي، فمن المهم لتقييم ما إذا كان المركب يستحث زيادة مطلقة في عدد β خلايا، و / أو يحرض الخلايا خلايا بيتا وعما إذا خلايا β المعالجة مجمع تحتفظ ظيفة عادية (حفز إفراز الأنسولين الجلوكوز) 32. والقيد الثالث من هذا الاختبار هو الإنتاجية المتواضعة المرتبطة باستخدام جزيرة الخلايا الأولية؛ الجزر من ستة الفئران يولد 228 بئرا التجريبية التي تسمح ~ 55 المجمعات التي سيتم فرزهم في quadruplicate (بالإضافة إلى الضوابط الإيجابية والسلبية). قيود إضافية على منصة خلايا بيتا فحص تكرار وصفها هو استخدام الجزر الفئران بدلا من الجزر الإنسان. الاختلافات بين الجزر الإنسان والفئران هي كافية لتتطلب أن جميع المركبات ودعم تكرار حددت باستخدام وأكد الثقافات الفئران جزيرة باستخدام الثقافات جزيرة الإنسان. ومع ذلك، ونظرا لمحدودية، وارتفاع تكلفة الجزر الإنسان، غربلة أولية مع ط البشريslets غير عملي بالنسبة لمعظم الباحثين. المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي: 1) استخدام الجزر الأولية المعزولة حديثا للحفاظ على قيود النمو الطبيعي إلى أقصى حد ممكن، 2) استخدام شكل 384 بئر للسماح فحص سرعة معتدلة (عادة الجزر المعزولة من ستة الفئران تكفي ل 228 بئرا) و 3) استخدام الحصول على الصور الآلي وتحليل لتسريع وتيرة التجريب وللحد من التحيز. على النقيض من ذلك، النهج البديلة التي يشيع استخدامها تعتمد على الحصول على الصور اليدوية وتقييم شخصي لأحداث النسخ المتماثل β-الخلية أو كله جزيرة دمج ثيميدين المشعة التي لا تميز بين الخلايا linages، مثل الخلايا الليفية مقابل تكرار β-الخلية 15،17. وبالتالي، يمثل بروتوكول المعروضة أداة هامة ومحسنة لتحقيق نمو التنظيم من β-الخلايا. نحن نتصور مجموعة متنوعة من تكييفهايستخدم لهذا النظام الأساسي الفرز. أولا، زيادة مطلقة في عدد β خلايا يمكن قياسها عن طريق حساب عدد من PDX-1 + - أو الأنسولين + -cells. لحساب التغير في عدد الخلايا مطلي لكل بئر عددا أكبر من مكررات لكل حالة قد يتم تضمين (عادة ن = 8). ثانيا، يمكن تكييفها منصة ل overexpression القائم الفيروسة البطيئة أو خروج المغلوب / لأسفل التجارب لتحديد المسارات المتضمنة في النسخ المتماثل β-الخلية. وباختصار، فإن تقنية تجريبية وصفه مفيدة على نطاق واسع لتحديد المركبات والمسارات الجزيئية التي تنظم تكرار خلايا بيتا.

مرض السكري يشمل مجموعة من الاضطرابات تقاسم نقطة النهاية المشتركة للتوازن الجلوكوز تعطلت. على الرغم من أن الآليات المسببة للأمراض من أنواع فرعية مرض السكري تختلف، إلا أنهما يشتركان نتيجة لانخفاض كتلة خلايا بيتا، أي فقدان القدرة على إنتاج الأنسولين 1،2. في الوقت الحاضر، واستراتيجيات علاج مرض السكري تعتمد على إدارة المزمنة من الأنسولين خارجي، وتحفيز الصيدلانية إنتاج مادة الأنسولين أو تعزيز الحساسية للانسولين، ونادرا ما، وزرع جزيرات البنكرياس أو كله البنكرياس 3،4. وللأسف، فإن نجاح هذه الاستراتيجيات قصيرة الأمد و / أو يفشل في تلخيص بما فيه الكفاية وظيفة إنتاج الأنسولين الذاتية. وعلى الرغم من فائدة من تطوير طريقة لتحفيز تجديد خلايا بيتا، لا يوجد نهج من هذا القبيل. ونتيجة لذلك، وهو هدف أبحاث مرض السكري الرئيسي هو تطوير طرق لتوليد خلايا β جديدة أو لتوسيع الذاتية β خلايا كتلة 5 </sup&gt;. على الرغم من تجديد β خلايا من مصادر الطاقة المتجددة مثل الخلايا الجذعية الجنينية تتقدم، مخاوف تتعلق بالسلامة والكفاءة تجعل السعي الاستراتيجيات البديلة، بما في ذلك توسيع β خلايا ناضجة، أولوية 6،7. الأهم من ذلك، المصدر الغالب للخلايا β جديدة في الجسم الحي هو موجودة من قبل خلايا β بدلا من الخلايا الاصلية المتخصصة 8،9. على الرغم من أن β خلايا يبدو أن لديها قدرة محدودة النسخ، زيادة صغيرة في كتلة β خلايا (~ 30٪) قد تكون كافية لاستعادة توازن الجلوكوز في كثير من مرضى السكر. وعلاوة على ذلك، في تحفيز الصيدلانية الموقعي من كتلة β-الخلية هو استراتيجية المعاملة التي قد تكون غير مكلفة وقابلة للتطوير. وهنا يرد طريقة فحص عالية المحتوى من أجل تحديد وتوصيف جزيئات صغيرة التي تحفز نمو خلايا بيتا. ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من في المختبر الطرق التجريبية لتحديد المنتجات الجينات و / أو جزيئات ثار تشجيع تكرار β خلايا الأساسي. الجهود المبكرة لقياس خلايا بيتا تكرار الحث المستخدمة الجنين الثقافة القوارض بنكرياسات أو سليمة الثقافات جزيرة معزولة لقياس [3 H] التأسيس الثيميدين، BrdU التأسيس أو هيئات الإنقسامية داخل ألدهيد-thionine أو الأنسولين السكان الملون في استجابة لظروف علاج محدد 10، 11. هذه الأساليب في المختبر، والمتغيرات وثيقة يكون لها العديد من القيود. وتشمل أوجه القصور البارزة (1) استخدام الخلايا الجنينية التي، على عكس β خلايا ناضجة، عرض وارتفاع معدل تكرار β-الخلايا القاعدية وهي النمو ينظم بطريقة متميزة 12؛ (2) طبيعة الشخصية للتحكيم التي تعتمد على المجرب من أحداث النسخ المتماثل β-الخلية؛ (3) العمل وطبيعة مكثفة وقت العد التي تعتمد على المجرب من أحداث النسخ المتماثل β خلايا يؤخر الإنتاجية التجريبية. (4) استخدام النووي التأسيس / وصمة عار / مظهر لتحديد تكرار حتىالخبر وصمة عار هيولي غير متداخلة لتحديد خلايا بيتا يؤدي إلى misattribution من أحداث النسخ المتماثل غير β خلايا المباشرة لبيتا خلايا. وفي الآونة الأخيرة تم استخدام ناضجة خلايا β الأولية لتقييم أثر التحوير الإفراط في التعبير وكذلك علاج الجين المنتج أو مركب على النسخ المتماثل β خلايا 13-16. ومع ذلك، فقد اعتمدت هذه الدراسات أيضا على العد شخصي لأحداث النسخ المتماثل، staining- حشوية أو غير محددة اساليب تحديد β خلايا و / أو خطوات كثيفة العمالة التي تحد من الإنتاجية، على سبيل المثال، الفردي الطلاء الشرائح جيدا من الخلايا أو جزيرة سليمة تضمين البارافين وتجهيز 17. والجدير بالذكر، وهو الإنسان β-خلية منهجية فرز تكرار الصورة القائمة، مماثلة لتلك الواردة في هذه الوثيقة، تم نشر 18. ومع ذلك، لم يثبت الاستخدام الناجح لهذا الاختبار واستخدام الجزر الإنسان لغربلة أولية قد لا تكون على نطاق واسع الهيئة الاتحادية للبيئةsible. استراتيجية بديلة لتحديد المواد المعززة للتكرار هو تقييم تحريض نمو خطوط β-الخلية. الجهود الأولية المستخدمة تحولت β خلايا خطوط مثل min6 الخلايا أو INS 832/13 خلايا 14،19-21. ومع ذلك، هذه خطوط الخلايا تظهر النمو غير المقيد وتحمل شبها جيدا متباينة β خلايا 22. ونتيجة لذلك، والقدرة على النمو الاستقراء هو الحد الأدنى، من أهمية واضحة وصعبة في بعض الأحيان أن ألخص. استراتيجية محسنة لفحص المستندة إلى خط الخلية يستخدم &quot;تحويل عكسية&quot; الخلايا التي هي نمو اعتقل في غياب التتراسيكلين (الدوكسيسيكلين) معتمد على SV40 المستضد T التعبير 23،24. ومع ذلك، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت هذه الخلايا تعود إلى &quot;طبيعية&quot; حالة شبيهة β-خلية على إزالة الدوكسيسيكلين. للأسف، واستخدام هذه الخلايا قد حقق المركبات المعززة للنمو المعممة التي لا يبدو أن لها فائدة فورية24. وعموما، قد يكون استخدام خطوط الخلايا لدراسة تنظيم نمو الخلية من نوع عرض الحد الأدنى من النشاط تكرار عفوية محدودة التطبيق. وβ خلايا تكرار منصة فحص المقدمة هنا تستخدم الناضجة الفئران الأساسي β خلايا للاحتفاظ في تنظيم نمو الجسم الحي إلى أقصى حد ممكن والثقافات جزيرة الخلية المختلطة تكوين خلية من نوع لتمكين تحديد الأنشطة المعززة للنمو المقيدة النسب، متعددة -well تهيئة إلى تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية وتحليل الآلي للقضاء على التحيز وتسهيل الإنتاجية. وقد مكن الاستخدام الناجح لهذه المنصة تحديد العديد من المركبات التي تعزز تكرار خلايا بيتا 25،26. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام فحص للدراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط والتجارب قشوة الكيميائية لتقديم رؤى الآلية في تنظيم الجزيئي للتكرار β-الخلية. تم تعديل منصة عرض بنجاح FOالتحقيق استنادا رني ص lentiviral النسخ المتماثل β خلايا الممرات 25. وتشمل القيود المفروضة على فحص قابلية محجوب (استخدام الخلايا الأولية)، واستخدام القوارض بدلا من جزيرة خلايا الإنسان (على الرغم من أن الفحص يمكن تكييفها للدراسات جزيرة الإنسان)، والنفقات المرتبطة التصوير القائم على الأجسام المضادة واستخدام جزيرة الأساسي، واستخدام من الجزر المتناثرة (تعطلت العمارة جزيرة) لتسهيل الحصول على الصور الآلي والاعتماد على توافر المجهر الآلي مع الحصول على الصور والقدرة على التحليل. على الرغم من أن سطحي جدا في الجسم الحي منهجية الفرز لتحديد المنتجات الجينات أو المركبات التي تحفز تجديد الخلايا بيتا في الموقع سيكون امرا مثاليا، مثل هذا المنبر ليست متاحة بعد 27. وبالتالي، فإن منصة وصف مناسبة للباحث مهتم في التحقيق في معظم جوانب تكرار β-الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:364px;">250g male Male Sprague Dawly Rat</td>
			<td style="width:196px;">Charles River</td>
			<td style="width:147px;">Stain # 400</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:364px;">12 cm teeth tisuue forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">11.5 cm fine scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">14.5 cm surgical scissors</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">14001-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">16 cm curved forceps</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">11003-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12 cm curved hepostat</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">13011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12 cm scalpel handle</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:147px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Tissue sieve-30 mesh</td>
			<td style="width:196px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:147px;">1985-85000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cizyme RI, 375,000 CDA units</td>
			<td style="width:196px;">VitaCyte</td>
			<td style="width:147px;">005-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:364px;">Hanks&#39; Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++)</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td>
			<td style="width:196px;">JHP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:147px;">NDC# 42023-113-10</td>
			<td>to make anesthetic cocktail&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Xylazine (5 g/50 ml)</td>
			<td style="width:196px;">LLOYD</td>
			<td style="width:147px;">NADA# 139-236</td>
			<td>to make anesthetic cocktail&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Histopaque 1077</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">H-1077</td>
			<td>to make histopaque 1100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Histopaque 1119</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">H-1119</td>
			<td>to make histopaque 1100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Newborn Calf Serum 500 ml</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30118.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Hanks&#39; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30268.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30021.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Functionality/Viability Solution&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Mediatech</td>
			<td style="width:147px;">99-768-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">RPMI1640 media&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Hyclone</td>
			<td style="width:147px;">SH30096.01</td>
			<td>to make conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">804G rat bladder carcinoma cell-line</td>
			<td style="width:196px;">Available upon request</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>to make conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">26160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">GlutaMax-I</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:147px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&#160;</td>
			<td style="width:196px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Formamide 500 mL</td>
			<td style="width:196px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:147px;">BP227-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">H-3300</td>
			<td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Dextrose, Anhydrous</td>
			<td style="width:196px;">EMD Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">DX0145-1</td>
			<td>to make 1 M glucose solution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:364px;">Nomal Donkey Serum (Powder)</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Mouse anti-human Ki67 antibody</td>
			<td style="width:196px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">556003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Goat anti-human PDX-1 antibody</td>
			<td style="width:196px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:147px;">AF2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2016-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2014-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Dako</td>
			<td style="width:147px;">2011-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td>
			<td style="width:196px;">abcam</td>
			<td style="width:147px;">ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">715-065-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:147px;">S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">705-025-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">706-025-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">711-025-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">706-175-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:147px;">703-175-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">S7113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Disposable Reagent Reservoir 25 mL</td>
			<td style="width:196px;">Sorenson BioScience</td>
			<td style="width:147px;">39900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td>
			<td style="width:196px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:147px;">353962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td>
			<td style="width:196px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Multi-channel pipettor</td>
			<td style="width:196px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">12-channel vaccume aspirator</td>
			<td style="width:196px;">Drummond</td>
			<td style="width:147px;">3-000-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:196px;">Falcon</td>
			<td style="width:147px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">Isotemp Water Bath Model 2223&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

Watch this Scientific Journal Video about A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃŽÂ²-cell Replication Discovery Platform at JoVE.com

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

تحديات بالغة الأهمية للبحث ميداني مرض السكري لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم جزيرة تكرار β خلايا وتطوير طرق لتحفيز تجديد خلايا بيتا. هنا طريقة فحص عالية المحتوى لتحديد وتقييم وقدم النشاط ودعم تكرار β-خلية من جزيئات صغيرة.

والمحتوى العالي<em&gt; في المختبر</em&gt; البنكرياس جزيرة β خلايا النسخ المتماثل منصة ديسكفري

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

a-high-content-vitro-pancreatic-islet-cell-replication-discovery

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

11.1K Views.  Stanford University School of Medicine.  تحديات بالغة الأهمية للبحث ميداني مرض السكري لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم جزيرة تكرار β خلايا وتطوير طرق لتحفيز تجديد خلايا بيتا. هنا طريقة فحص عالية المحتوى لتحديد وتقييم وقدم النشاط ودعم تكرار β-خلية من جزيئات صغيرة. 

Video: A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

فحص محتوى عالية في أمراض الاعصاب

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:<em&gt; في المختبر</em&gt; ثنائي الخلايا العصبية اللدونة الفحص

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon dioxide and waste products. The impairment of microvascular vasomotion might be a crucial step in the development of microcirculation-related diseases. In addition, the highly vascularized pancreatic islet is adapted to support endocrine function. In this respect, it seems possible to infer that the functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion might affect pancreatic islet function. Analyzing the pathological changes of the functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion may be a feasible strategy to determine contributions that pancreatic islet microcirculation makes to related diseases, such as diabetes mellitus, pancreatitis, etc. Therefore, this protocol describes using a laser Doppler blood flow monitor to determine the functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion, and to establish parameters (including average blood perfusion, amplitude, frequency, and relative velocity of pancreatic islet microvascular vasomotion) for evaluation of the microcirculatory functional status. In a streptozotocin-induced diabetic mouse model, we observed an impaired functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion. In conclusion, this approach for assessing pancreatic islet microvascular vasomotion in vivo may reveal mechanisms relating to pancreatic islet diseases.

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Pancreatic islet microvascular vasomotion regulates islet blood distribution and maintains the physiological function of islet &#946; cells. This protocol describes using a laser Doppler monitor to determine the functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion in vivo and to assess the contributions of pancreatic islet microcirculation to pancreatic-related diseases.

دوبلر الليزر: أداة لقياس البنكرياس جزيرة فاسوموشن ميكروفاسكولار في فيفو

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

تطبيق ملامسة نهاية إلى نهاية في بانكريتيكتومي الوسطى إليه (روبوت)

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Hydra, a Computer-Based Platform for Aiding Clinicians in Cardiovascular Analysis and Diagnosis

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect of different cardiovascular risk factors (e.g., diabetes, raised blood pressure, unhealthy diet, tobacco use, stress, etc.) that commonly coexist and act multiplicatively. Most CVDs can be prevented by an early identification of the highest risk factors and an appropriate treatment. The stratification of cardiovascular risk factors involves a wide range of parameters and tests that specialists use in their clinical practice. In addition to cardiovascular (CV) risk stratification, ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) also provides relevant information for diagnostic and treatment purposes. This work presents a list of protocols based on the Hydra platform, a web-based system for clinical decision support which incorporates a set of functionalities and services that are required for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment and monitoring of patients over time. The program includes tools for inputting and managing comprehensive patient data, organized into different checkups to track the evolution over time. It also has a risk stratification tool to compute a CV risk factor based upon several risk stratification tables of reference. Additionally, the program includes a tool that incorporates ABPM analysis and allows the extraction of valuable information by monitoring blood pressure over a specific period of time. Finally, the reporting service summarizes the most relevant information in a set of reports that aid clinicians in their clinical decision-making process.

This article presents a protocol based on Hydra &#8212; a web-based system for clinical decision support that integrates a full and detailed set of functionalities and services required by physicians for complete cardiovascular analysis, risk assessment, early diagnosis, treatment, and monitoring over time.

هيدرا، منصة حاسوبية لمساعدة الأطباء في تشخيص وتحليل القلب والأوعية الدموية

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death throughout the world. The total risk of developing CVD is determined by the combined effect ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

التصور من المجمعات Mitophagy الذاتية في الموقع في خلايا بيتا البنكرياس البشرية باستخدام القرب الربط اختبار

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Robotic Enucleation of an Intra-Pancreatic Insulinoma in the Pancreatic Head

Pancreatic parenchyma sparing surgery for insulinomas avoids the risk of endocrine and exocrine insufficiency, and potential high-risk anastomoses associated with pancreatic resection. Robotic surgery may be used as an alternative for open pancreatic enucleation without compromising dexterity and 3D-vision.
We present the case of a 42-year old woman who presented with sweating, tremor and episodes of hypoglycemia. A fasting test confirmed endogenic insulin overproduction. After inconclusive CT- and MRI imaging, endoscopic ultrasonography showed a hypoechoic lesion, which was fully within the pancreatic head. Although consent was obtained for pancreatoduodenectomy, robotic enucleation seemed feasible. After mobilization, intraoperative ultrasonography was used to identify the lesion and its relation with the pancreatic duct. Dissection was performed using a traction suture, hot shears and bipolar diathermia. A sealant patch was applied for hemostasis and a drain placed. The patient developed a grade B pancreatic fistula for which endoscopic sphincterotomy was performed; the surgical drain could be removed in the outpatient clinic after 20 days. Prospective studies should confirm the short- and long-term benefits of robotic enucleation of insulinomas.

Here, we present a robotic approach to enucleate an insulinoma in the pancreatic head.

والمحتوى العالي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video