This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.

Hayvan kullanım protokolü M belirtilen prosedürleri takip / Gu için Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış / 181 11. CD1 veya CBA / BL6 fareler ticari satıcılardan satın alınan ve neonatal fareler elde etmek için Vanderbilt hayvan tesisinde geçti bulundu. Farelerin 1. Hazırlık, Stok Çözümleri ve Ekipmanları <ol><li> Fare çapraz için: fare çapraz kurmak ve deneysel planlama yardımcı olmak için takmayı tarihleri ​​kaydedin. CD1 fareler genellikle çiftleşme gün sonra 19 civarında doğurur. Kullanım CD1 veya CBA / BL6 sırasıyla CD1 veya CBA / BL6 yenidoğan elde geçer. İki çizgi arasındaki ara-CD1 kadın ve CBA / BL6 erkek kullanmaktadır. </li><li> kollajenaz stokunun için: yüksek hassasiyetli terazi ile 200 mg kollajenaz Tip IV tartın. 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne transfer edin. Ca 40 mi HBSS içinde çözündürülür 2 + / Mg2 + (sırasıyla 1.26 ve 0.5 mM), 5 mg / ml stok çözelti yapmak için. <ol><li> için kollajenaz izinhafifçe çalkalanarak ~ 30 dakika boyunca çözülür. Kısım ve en az bir yıl boyunca açık kalır stok olarak -20 ° C&#39;de, donmuş çözelti tutun. </li></ol></li><li> diseksiyon ve adacık toplama için cımbız, makas ve P20 ipuçları birkaç çift sterilize etmek otoklavlayın. </li><li> 1 M glükoz stoğu için: 50 ml santrifüj tüpüne 9 g glukoz ağırlık glukoz eritmek için 50 ml RPMI 1640 ortamı eklenir. kullanılana kadar 4 ° C tutun, ama en fazla 6 aydır. </li></ol> 2. Çalışma Çözümleri NOT: adacık izolasyonu gün, aşağıdaki reaktifler hazırlayın. <ol><li> kollajenaz tip IV çalışma çözümü için: çözülme ve buz üzerinde kollajenaz stok sulandırmak. Her 1.7 ml mikrofüj tüpe 0.15 ml stok koyun. Ca 2+ / Mg 2+ ile 1.35 ml HBSS ekleyin. tüpü 5 kez ters çevirin. 15 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. <ol><li> bir mikrosantrifüj içinde 3 dakika yüksek hızda dönerler. Yeni bir tüp süpernatant aktarın. kullanılıncaya kadar buz üzerinde bırakın. çözünmez enkaz ile tüp atın. </li></ol></li><li> desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı için 500 ml RPMI 1640 ortamı içine 2.5 mL 1 M glükoz, FBS 50 ml ısı ve 5 mL 100X Pen-Strep suyunu ekleyin. kullanılana kadar buz üzerinde bırakın. </li></ol> 3. Pankreas İzolasyon ve Sindirim <ol><li> onaylanmış protokollere göre dekapitasyon izofluran ile yenidoğan, euthanize. </li><li> karnı yukarı bakacak şekilde fareyi yatırın. Sterilizasyon% 70 etanol ile püskürtülür. </li><li> Cımbız ile karın cildi yukarı kaldırın ve göğüs kafesine genital bölgede, bir makas ile orta hat boyunca uzunlamasına deri ve kas katmanları kesti. Bu, tüm iç organlarını açığa karın boşluğuna açılır. </li><li> cımbız ile 100 cm çanak tüm iç organları aktarın. Mide ve dalak ve duodenum 11 yapışan bir ventral kısmına yapışan bir sırt bölümü ile dağınık-organdır pankreas, bulun. </li&gt; <li> organları batırmak için çanak içine HBSS ekleyin. çözümde, pankreas dokuları artık duodenum, mide, dalak veya sarılmak. Çünkü onun tipik beyaz renkli bir diseksiyon kapsamında kolayca tanınabilir. HBSS ile yeni bir 60 mm çanak uzak çevresindeki doku ve transfer pankreas dokuları soymak için bir cımbız kullanın. </li><li> Herhangi boyutları arasında 5 mm&#39;den küçük parçalar halinde bir makas ile her pankreas kesin. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer edin. En fazla beş pankreata (P7 daha genç) bir tüp içinde sindirilebilir. P8-P16 fareler için, pankreas başına bir tüp kullanın. </li><li> Her bir tüpe 1 mL kolajenaz çalışma çözeltisi (her bir P1-P7 pankreas 0.2 mL, her P8-P16 pankreasta 0.5 mL kullanın.) - 0.5 ekleyin. en fazla 15 dakika süreyle 37 ° C kuluçka makinesi içinde tüpü terk. tüpü iki kez her dakika çevirin. </li><li> ~ 5 dakika sonra, pankreas dokusu sindirim durumunu izlemek için tüp dokunun. pankreatik çoğu kadar sindirim işlemine devamDoku çapı &lt;2 mm kadar parçalanmış hücre kümeleri, görünür. lizat, normal asiner hücre autolysis nedeniyle bulanık görünecektir. </li></ol> 4. Lizat Yıkama <ol><li> Bir mikrosantrifüj 10 saniye süreyle 500 xg&#39;de lizat dönerler. Bir P1,000 Pipetman süpernatant tabakası çıkarın. süpernatant bulanık ama hücre kümeleri yoksun görünmelidir. hızlı nedeniyle bazı yapışkan DNA varlığı altındaki doku parçaları uzak aspire olabilir, aspirasyon kullanmayın. </li><li> 1 ml RPMI 1640 tam ortam ekleyin. parçalanmış lizat tekrar süspansiyon tüp hafifçe dokunun. yukarı ters çevirin ve 10 kez aşağı. Adımı tekrarlayın 4.1. </li><li> Adımı yineleyin 4.2 iki kez daha ya da süpernatant berrak görünene kadar. 1 ml tam RPMI 1640 medya içinde yıkanmış pankreas parçaları yeniden askıya. </li></ol> 5. Adacık İzolasyonu NOT: pancreata küçük sayılar için, doğrudan el toplama aşağıdaki gibi (5.1) adacık isol için kullanılabilirtirme. Pankreatanın büyük sayılar için (&gt; 6), 5.2 özetlenen yöntemi tercih edilir. <ol><li> Doğrudan el toplama: <ol><li> 60 mm çanak adım 4.3 lizat aktarın. 5 ml tam RPMI 1640 ortam ekleyin. bir mikroskop altında getirin. </li><li> mikroskop parlak alan aydınlatma ayarlayın. ışık yoğunluğunu maksimum güç ~% 50 olarak ayarlayın. Bu durumda, adacıklar asiner hücreler koyu düzensiz şekilli kümeler ise (Şekil 1A) gibi hafif pembe kümeleri görünür. ~ 50X (objektif gücünü ve göz parçayı birleştirerek) bir büyütme görselleştirme adacıklar en iyi yolu ve toplamak için aynı anda pipetlemeyin ucu açıklığı sunmak için tavsiye edilir. </li><li> asiner kümeleri kaçınarak bir P20 pipet ile adacıklar toplayın. Dağıtın RPMI tam medya (Şekil 1B) ile yeni bir 60 mm çanak kesirler adacıklar zenginleştirilmiş. </li><li> iki kez daha el toplama işlemi tekrarlayın. Yeni bir 60 saf adacıklar bırakın4 mL tam RPMI medya (Şekil 1C) mm çanak. </li></ol></li><li> Gradyanlı santrifüjleme: <ol><li> 1.077 g / ml yoğunluğunda 2 mL polisükroz ve sodyum Diatrizoate ile önceden yüklenmiş bir 15 ml santrifüj tüpü hazırlayın. kullanılana kadar buz üzerinde tüp bırakın. </li><li> Pasteur pipeti ile polisükroz ve sodyum diatrizoate çözeltisinin üst üzerine adım 4.3 süspansiyon aktarın. Alt tabaka Rahatsız etmeyin. kadar yeni doğmuş 10 ya da 2 pankreata P17 dokular her 15 ml tüp içine yüklenebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika için bir döner rotor içinde ~ 600 x g&#39;de tüp dönerler. Fren-off ayarları kullanın. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, yeni bir 15 ml tüp içine medya ve interfaz katmanları (İdeal çalışma koşulları altında, adacıklar santrifüj sonra polisükroz ve kültür ortamı arasındaki interfaz yer alacak unutmayın) aktarın. 10 ml medya ekle yavaşça ama iyice karıştırın. </li><li> adacık zenginleştirilmiş kısmını aşağı Spin5 dakika boyunca 300 x g&#39;de. Yıkama ortamı çıkarın. tam RPMI medya ile yıkayın bir kez daha tekrarlayın. Çoğunlukla adacıklar ve oluklar (Şekil 1D) içeren 4 mL medya, pelet tekrar. </li><li> bölüm 5.1&#39;de belirtildiği gibi adacıklar elle seçin. </li></ol></li></ol> İzole adacıklardaki 6. GSIS Tahliller <ol><li> 37 ° C, doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 saat boyunca tam RPMI ortamı içinde aşama 5.1.4 adacıklar inkübe edin. </li><li> bir mikroskop altında RPMI kaldırmak için bir pipet kullanın. Plaka 3-2,8 mM glukoz ihtiva eden 3 mL KRB solüsyonu eklenir. adacıklar yıkamak için 10 kez girdap. KRB çözümlerini çıkarın. <ol><li> bir kez yıkama işlemi tekrarlayın. bir kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca 37 ° C de 3 ml KRB çözeltisi ile adacıklar inkübe edin. </li></ol></li><li> 12 oyuklu plakanın her oyuğuna kısım 1 ml KRB. Bir inkübatör içerisinde 37 ° C&#39;ye kadar KRB stokları ve plaka önceden ısıtın. </li><li> 6.2 gibi önceden ısıtılmış KRB ile iki kez adacıklar yıkayın. Transfer önceden ısıtılmış levhaların her çukuruna 10 adacıklar. 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. </li><li> 45 dakika sonra, süpernatan 50 ul geri. Bu temel şeker altında salgılanan insülin çözeltisi içerir. </li><li> 32 uL 500 mM glikoz eklenmektedir. solüsyonu karıştırmak için plaka 20 kez döndürülür. 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. plaka kez 5 kez her 5 dk girdap. </li><li> 45 dakika sonra, 50 uL süpernatant çıkarın. Bu yüksek glukoz altında salgılanan insülin olduğunu. </li><li> 1.5 ml tüp tüm adacıklar aktarın. 30 dakika boyunca -20 ° C&#39;de dondurun. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında çözülme. donma ve çözülme işlemi tekrarlayın. </li><li> 20 mM HCI ile 0.5 mL% 70 etanol ekleme. gece bekletin. Bu adacıkların sol insülin olduğunu. </li><li> Insülin seviyelerini analiz etmek için geleneksel bir ELISA kullanarak, daha önce 3 açıklandığı. </li></ol>

<ol>
	<li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation.">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells.">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li><li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes:+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes.">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li><li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy.">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li><li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans.">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li><li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K++channels.">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li><li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells.">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li><li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3.">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li><li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans.">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li><li>Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. A., Sto&#382;er, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445 (2015).</li><li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).</li><li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas.">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li><li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass.">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests for the described work.

Burada, alışılmış perfüzyon için çok küçük pankreatasmdan adacığı izolasyonu adım adım protokolü sağlar. Vb beta hücresi saflaştırma, gen ekspresyon analizi, doku adacığı beta hücresi olgunlaşması, çoğalması, hücre stres yanıtları, hücrenin hayatta kalması, metabolizma ve fonksiyonel GSIS bakım, tüm doku adacığı temelli çalışmalar hazır adacıklar elde etmesi beklenmektedir. Bu bilgimiz, neonatal fareden adacık izolasyonunu gerçekleştirmek için yeni araştırmacılar kılavuzları ilk detaylı görsel protokolünün en iyi şekilde olacaktır. Bu görsel yardımcıları olmadan, geniş deneme yanılma küçük pancreata başarılı adacık izolasyonu ulaşmanın en araştırmacılar için bekleniyor. adımlarda 3,6 belirtildiği gibi başarılı bir adacık izolasyonu için en kritik faktör pankreas sindirim doğru derecesidir - 3.8. Genel olarak, altta ve aşırı sindirim hem de adacık verimi azaltır. Aşırı sindirim ileri tavizler adacık mimarisi, makbunların işlevsel deney için müsait es. En iyi sindirim sonucu elde etmek için, reaksiyon sürekli doku parçalanması işlemini görselleştirmek için izlenecek vardır. kollajenaz her parti farklı olduğundan ve asiner-adacık ayrımı yargılamak için sindirim süresine Sayma, en güvenilir yöntemdir derinden başlayan pankreas etkileri sindirim süreci yaşı / boyutu. altı sindirim durumunda, büyük bir endokrin-ekzokrin kümeleri HBSS yıkanabilir ve kolajenaz ile tekrar sindirilmiştir. sindirim sonra devam sindirim süresini belirlemek için mikroskop altında doğrudan izlenebilir. Nazik pipetleme da yardımcısı doku ayrılma için kullanılabilir. Bu durumda, geniş açılış ihtiyaçları olan bir P1,000 ucu adacık mimarisi yok edebilecek kesme kuvveti azaltır, hangi kullanılabilir. Aşırı sindirilmiş adacıklar en sonraki çalışmalar için tavsiye edilmez, ancak bu dikkatli bir şekild gen ekspresyon analizi gibi bazı deneylerde, kullanılabilirl kontrolleri. Yukarıdaki dikkatli yanında, çok sayıda prosedür faktörlere dikkat daha nihai adacık verim ve kalitesini artırabilir. İlk olarak, Ca2 + ve Mg2 +, tüm çözeltiler dahil edilmelidir olmayan ticari kaynaklardan kullanıldığı taktirde. Bu katyonlar adacık bütünlüğünü korumak için gereklidir. İkinci olarak, yüksek etkinliğe sahip, taze kolajenaz çözeltisi gereklidir. Doku ayrışma için daha uzun bir süre düşük aktivite sonuçları ile kollajenaz çözüm. Bu, önemli ekzokrin hücre otolitik ve adacık yıkımına neden olur. Bu amaçla, donma-çözülme fazla üç mermi ile kollajenaz stokları kullanan tavsiye edilmez. doku yıkama sırasında Üçüncü olarak, düşük hız santrifüj tavsiye edilir. başparmak kuralı ag kuvveti protokolü aşama 4.1 yüzer hücre artıkları korurken, hücre kümeleri çöktürmek için yeterli olan (&lt;500 xg) kullanmaktır. Bu hız, sadece adacıklar yok önler, aynı zamanda remo olurEl toplama sırasında daha kolay adacık görselleştirme etkinleştirmek için hücre artıkları ettik. Son olarak, kolajenaz serum 12 ile inaktive edilemez. Bu nedenle, yıkama durumunda bunun çıkarılması sonraki çalışmalarda doku adacığı bütünlüğünü sağlamak için gereklidir. Son olarak, sunulan protokol P1 P17 fare pankreası sınırlı gerektiği not edilmelidir. O P18 daha yaşlı pancreata için iyi çalışmaz. bu eski fareler için geleneksel perfüzyon daha iyi verim ve sağlıklı adacıklar için tavsiye edilir. Ayrıca, farelerin genetik arka plan ve yaş derinden adacık verim 13,14 etkiler. Bu nedenle, hatta optimum koşullar normal ve beklenen bir pankreas başına adacıklar farklı sayıda, verecektir.

Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies. 
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Collagenase&#160; Type IV</td>
			<td style="width:253px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:128px;">C5138</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:169px;">1X HBSS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:253px;">Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td>
			<td>MT21020CV</td>
			<td style="width:219px;">If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:169px;">RPMI 1640 w/o glucose</td>
			<td style="width:253px;">Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td>
			<td>11879-020</td>
			<td style="width:219px;">Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Glucose</td>
			<td style="width:253px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>G-7021&#160;</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:169px;">polysucrose and sodium diatrizoate solution</td>
			<td style="width:253px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>Histopaque-10771</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:253px;">Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Stemi2000</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:253px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica M165</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>Centrifuge 5417C</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Centrfuge</td>
			<td style="width:253px;">Eppendorf, Hauppauge, NY</td>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">15-ml centrfuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-666</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">50-ml centrfuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>89039-658</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Precision balance</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>VWR-225AC</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>87003-294</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Pipetman P1000</td>
			<td style="width:253px;">Fisher Scientific,&#160; Waltham, MA</td>
			<td>F123602</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Pipetman P20</td>
			<td style="width:253px;">Fisher Scientific,&#160; Waltham, MA</td>
			<td>F123600</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">100X15 millimeter dish</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25384-088</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">60X15 millimeter dish</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25384-168</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:169px;">12-well plates</td>
			<td style="width:253px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td>665-180</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:169px;">Scissor</td>
			<td style="width:253px;">Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td>
			<td>14080-11</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:169px;">Tweezers</td>
			<td style="width:253px;">Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td>
			<td>5708-5</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:169px;">CD1 mice</td>
			<td style="width:253px;">Charles River Laboratories, Wilminton, MA&#160;</td>
			<td>CD-1</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:169px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:253px;">The Jackson laboratory, Farmington, CT&#160;</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">B6CBAF1/J</td>
			<td style="width:253px;">The Jackson laboratory, Farmington, CT&#160;</td>
			<td>B6CBAF1/J</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas

Büyük memeli pancreata gelen perfüzyon tabanlı adacık izolasyon protokolleri iyi bilinmektedir. Bu tür protokoller kolayca nedeniyle hazır kollajenaz enjeksiyonu ve sonraki doku perfüzyon için izin veren pankreas kanalının büyüklüğü birçok laboratuvarlarda yapılır. perfüzyon kolayca küçük pancreata başarılabilir değil çünkü aksine, küçük pancreata adacık izolasyonu, yenidoğan farelerin olduğu gibi, zordur. Burada görsel yardımı ile yeni doğan farelerin adacıklar önemli sayıda kurtarır ayrıntılı basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taze parçalara Bütün pankreastan mikrosantrifüj tüpleri içinde, 37 ° C &#39;de Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözülmüş 0.5 mg / ml kollajenaz IV ile sindirildi. Tüpler doku dağılmasına yardımcı olması için düzenli olarak aday bulundu. doku en fazla 1 mm civarında küçük kümelere dağıtılmıştır zaman lizatları% 10 cenin sığır serumu (FBS) kültür ortamı ile dört kez yıkanmıştır. Adacık kümeler,tanınabilir asiner dokuların yoksun, daha sonra stereoskopla diseksiyon altında elde edilebilir. Yeni doğan fare pankreas başına büyük boyutlu adacıklar 80 küçük - Bu yöntem 20 kurtarır. Bu adacık insülin sekresyonu, gen ekspresyonu ve kültür dahil olmak üzere en akla alt deneyleri için uygundur. insülin salgılanması tahlilinin bir örneği, yalıtım işlemi doğrulamak için sunulmuştur. genetik altyapı ve sindirim derecesi verimi belirleyen en büyük faktörlerdir. Endokrin-ekzokrin izolasyon yardımcıları gibi yüksek aktiviteli taze hazırlanmış kolagenaz çözeltisi tercih edilir. Yıkama tüm çözümler ve fetal sığır serumu katyonların mevcudiyeti [Kalsiyum (Ca2 +) ve magnezyum (Mg + 2)] / çekme ortamı, uygun bir bütünlük adacık iyi bir verim için gerekli değildir. iyi kontrast ve büyütme ile bir diseksiyon kapsamı da yardımcı olacaktır.

Her bir küçük fare pankreastan 80 adacıklar - optimum koşullar altında, sunulan yöntem 20 verim alınabilir. Bu sayı, farelerin genetik arka plan, yaşına ve adacıklar boyutu geri alınacak. Yaygın olarak kullanılan arasında, CD1 dışarı yetiştirilmiş ve C57BL / 6J safkan fareler CD1 ve C57BL / 6 veya ticari B6CBAF1 arasındaki melezler daha küçük boyutta daha az adacıklar üretmek / J fareleri yok. Genellikle toplama direkt elden nedeniyle ekzokrin dokularda (Şekil 1A-C) ile karıştırıldığında tanınan zor olabilir küçük adacıklar dışlama adacıklar daha az sayıda, muhtemelen verdi. Gradient santrifüj karışımı (Şekil 1D) küçük adacıklar da dahil olmak üzere daha fazla adacıklar, verim alınabilir. Doğumdan sonra devam adacık çoğalması beklendiği gibi eski fareler de, daha büyük adacıklar üretirler. İlginçtir ki, kazanılan adacık sayısı doğrudan pankreas boyutu ile ilişkili değildir: CD1 fareler genellikle F1 prog daha büyük pankreası varCD1 ve C57BL Enies / 6J fareleri kapısı. Oysa CD1 fareler genellikle F1 yavrularıyla daha az adacıklar üretirler. Ya insufficient- veya aşırı sindirim suboptimal adacık izolasyon kollajenaz sonuçları ile. İlk durumda, büyük bir adacık kolaylıkla görselleştirilebilir, ancak bazı adacıklar tam asinar doku (Şekil 2A) için ayrılamaz. Bu adacıklar verim azaltacaktır, ancak daha büyük adacıklar genellikle üretilir. İkinci durumda, asinar dokuların tamamen adacıklardan ayrışmış edilebilir. Ancak bu pürüzlü yüzeylerde (Şekil 2B) ile birçok adacık sonuçlanan adacık yapısı ödün. Bu yöntemle izole edilen neonatal adacık insülin salgılama profilleri beklenen. Örneğin, her iki P1 ve P7 adacıklar 2.8 mM glukoz betwee insülin salgılanmasının düzeylerinin karşılaştırılması, yüksek bazal insülin salgılanmasını (Şekil 3 gösterildi:N P1-P7 ve olgun P24 adacıkları), olgunlaşmamış doku adacığı beta hücrelerinin 7, 9, tipik GSIS profilleri. Bu bizim adacık izolasyon süreci büyük ölçüde yenidoğan adacıklar fonksiyonel özelliklerini korur düşündürmektedir. Bu nedenle bu adacıklar gen ifadesinin, metabolik analizleri, hayatta kalma deneyleri, ve stres yanıtları dahil olmak üzere diğer in vitro tabanlı çalışmalar için olası bir uyum olduğunu bekliyoruz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55160/55160fig1.jpg" /> İzolasyon Sürecinde Adacık 1. Görünüm Şekil. Kollajenaz sindirim sonra (A) P1 pankreata. nispeten büyük adacık puan ok. Ok uçları iki nispeten küçük adacıkları işaret. (B) P1 ilk turda el toplamadan sonra adacıklar. (C) sonra 3. yuvarlak Ayıklama adacıklar. Gradient santrifüj sonra (D) Adacık kesirler. Büyük bir adacık ok. Ok başı, birküçük adacık. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55160/55160fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55160/55160fig2.jpg" /> Insufficient- veya Kollajenazının ile Aşırı sindirim sonra 2. adacıklar rakam. (A) bazı adacıklar arasındaki ilişki (pembe kümeleri, oklar) ve asiner hücreleri (koyu kümeleri, ok başları) dikkat, altında sindirim sonra adacıklar El aldı. (B) aşırı sindirim, pürüzlü yüzeyler (oklar) ile adacıklar not sonra adacıklar. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55160/55160fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55160/55160fig3.jpg" /> Şekil 3. GSIS Resulİzole Islets gelen ts. Sunulan veriler ± SEM. Onlar belirtilen glikoz konsantrasyonu ile 45 dakika tahlil penceresi içinde insülin salınımı (başlangıç ​​adacıklar bulunan insülin toplam tutar üzerinden salınan insülin miktarı) yüzdesini temsil etmektedir. ICR farelerden adacıkları, doğrudan elle toplama ile, bu deneyler için kullanılmıştır. P24 adacıkları olgun 7 iken, 9, P1 ve P7 adacıklar olgunlaşmamış kabul edildi unutmayın. P değerleri t-testi kullanılarak gruplar arasında hesaplanmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55160/55160fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas at JoVE.com

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

effective-isolation-of-functional-islets-from-neonatal-mouse-pancreas

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Görüntüleme.  Vanderbilt University Medical School.  Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir. 

Video: Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

İzolasyon ve Neonatal Rat kardiyomiyositlerde Kryoprezervasyon

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetal fare bir yüksek frekans ultrason (30/45 MHZ) sistemi kullanarak Imaging kardiyovasküler

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...