يمكن استخدام هذا البروتوكول للإجابة على السؤال حول ما إذا كان التكسير الهيدروليكي يؤثر على البكتيريا في الجداول القريبة وبالتالي الجداول نفسها وكيف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي طبيعتها الشاملة ، لأنها تأخذ الباحث من جمع العينات على طول الطريق من خلال تحليل البيانات. إثبات الإجراء سيكون جيريمي تشانسي، أخصائي المعلوماتية الحيوية في مختبري، سيدني ريجال، طالب جامعي في كلية جونياتا، وجيليان ليستر، مدير مختبري.
لجمع عينات من الرواسب لاستخراج الحمض النووي، استخدم قفازات لغمر أنبوب مخروطي متوج ومعقم 50 ملليلتر في مياه المجرى من الشاطئ. أثناء غمر الأنبوب، قم بإزالة الغطاء واستخدم الغطاء لاستخراج ما يقرب من ثلاثة ملليلترات من الرواسب من عمق سنتيمتر إلى ثلاثة سنتيمترات في الأنبوب. بعد جمع العينة، تفريغ جميع ما عدا ما يقرب من ملليلتر واحد من الماء من الأنبوب واستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لإضافة ثلاثة ملليلتر من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الحافظة للعينة.
قم بتدمير الأنبوب المخروطي المتوج لمدة خمس ثوان لخلط المادة الحافظة وعينة وتخزين العينة على الجليد. عند العودة إلى المختبر، قم بتخزين العينة عند ناقص 20 درجة مئوية لتحليل الحمض النووي 16S أو ناقص 70 درجة مئوية لتحليل الحمض النووي الريبي metatranscriptomics. لجمع مرشح، وملء تماما وتفريغ زجاجة كاملة معقمة لتر واحد مع تيار المياه ثلاث مرات لشرط زجاجة قبل ملء زجاجة مرة واحدة النهائي.
على سطح مستقر، ارسم حجما كاملا من مياه المجرى في حقنة قفل لوير معقمة وربط المحقنة بمصفاة بولي إيثرسولفون معقمة والحمض النووي/الحمض النووي الريبي قطرها 1.7 سنتيمتر مع حجم مسام 0.22 ميكرون. مسح كامل حجم مياه الدفق من خلال مرشح. عندما تتم تصفية حجم العينة بالكامل بنفس الطريقة، ارسم حوالي 20 ملليلتر من الهواء في المحقنة وادفع الهواء عبر الفلتر لإزالة أي ماء زائد من الفلتر.
بعد ذلك ، استخدم P1000 micropipette لإضافة ملليلترين من مادة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الحافظة إلى الفتحة الأكبر للفلتر أثناء الضغط على الفلتر أفقيا مع طرف المصة في برميل الفلتر لضمان دخول المادة الحافظة إلى الفلتر. ثم ختم مرشح مع مربعات ملفوفة بإحكام من فيلم البارافين حول كل افتتاح ووضع مرشح في كيس عينة عقيمة على الجليد. عند العودة من أخذ العينات، قم بتخزين المرشحات ل 16S أو للتحليل الميتاترانسكريبتومي كما هو موضح.
قبل البدء في نقل العينة، قم بتنظيف منطقة العمل بنسبة 10٪ من التبييض و70٪ من الإيثانول. لاستخراج الحمض النووي من عينة الرواسب، استخدم أداة معدنية معقمة للهب والإيثانول لنقل ما يقرب من 250 ملليغرام من العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. لاستخراج الحمض النووي من عينة مرشح، استخدم 70٪ الإيثانول واللهب المعقم قبضة نائب لكسر فتح غلاف مرشح على السطح العقيم وإزالة جوهر من الغلاف.
استخدم مشرط معقم لشريحة في أعلى وأسفل وعلى طول التماس من جوهر واستخدام ملاقط معقمة لطي ورقة التصفية قبل قطعها إلى قطع صغيرة مع مشرط. ثم ضع قطع الفلتر بعناية في أنبوب طرد مركزي صغير دون الاتصال بأي أسطح غير مقمرة. لتحلل الخلايا داخل أي نوع من العينة، تخضع أنبوب لتعطيل الخلية بسرعة عالية.
بعد خمس دقائق على الأقل، طرد العينات ونقل supernatant إلى أنبوب جديد ميكرو سنتر الطرد المركزي العقيمة. إضافة تحلل المخزن المؤقت إلى supernatant بنسبة واحد إلى واحد ونقل الحل إلى عامل التصفية المتوفرة. ضع الفلتر في أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإعداد إلى الأنبوب.
بعد الطرد المركزي، أضف 700 ميكرولتر من عازل الغسيل إلى الأنبوب واطرد الفلتر مرة أخرى. بعد التخلص من التدفق من خلال، إضافة 400 ميكرولتر من العازلة غسل إلى أنبوب لطرد مركزي إضافية ونقل مرشح إلى أنبوب جديد ميكرو سنتر الطرد المركزي العقيمة. لeute الحمض النووي، وعلاج مرشح مع 50 ميكرولتر من المياه الخالية من DNase / RNase لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
في غضون ذلك ، ضع مرشح HRC ثلاثة في أنبوب جمع وإضافة 600 ميكرولتر من حل الإعدادية مجلس حقوق الإنسان. بعد الطرد المركزي، قم بنقل الفلتر إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم جديد ونقل الحمض النووي المذر إلى المرشح للطرد المركزي. التدفق من خلال يحتوي على الحمض النووي المستخرج.
لإنشاء مكتبة الحمض النووي RNA 16S، استخدم أولا منتج الحمض النووي المستخرج حديثا لتضخيم الحمض النووي الريبي الريبي 16S مع بروتوكول PCR قياسي. امزج سبعة ميكرولترات من منتج PCR الناتج و13 ميكرولتر من المياه الخالية من DNase وحمل محلول PCR على هلام agarose بنسبة 2٪. ثم تشغيل هلام في 90 فولت لمدة 60 إلى 90 دقيقة للتحقق من حجم الفرقة من 386 أزواج قاعدة كدليل على تضخيم ناجحة.
لتنقية مكتبة الحمض النووي 16S ريبوسومال الجيش الملكي النيبالي، تجمع 10 ميكرولتر من منتجات PCR التي أسفرت عن عصابات مشرق و 13 ميكرولتر من العينات التي أسفرت عن نطاقات خافتة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق العقيمة وتحميل حوالي 150 إلى 200 نانوغرام من كل عينة مجمعة في آبار فردية من هلام 2٪ جديدة. بعد تشغيل الجل كما هو موضح ، اقتطع نطاقات الزوج الأساسي 386 من الجل واستخدم مجموعة تجارية لتنقية الحمض النووي. ثم elute الحمض النووي المنقى مع 30 ميكرولتر من 10 ملليمولار تريس هيدروكلوريد وحزمة المكتبات المنقى في الجليد الجاف قبل الشحن لتسلسل الجيل القادم.
في هذا التحليل التمثيلي، سيتم وصف جميع عمليات الاستخراج باستثناء واحدة بأنها ناجحة. تشير النطاقات الساطعة التي تمت ملاحظتها بعد تضخيم PCR إلى نجاح بروتوكول 16S. يجب أن يكون الحد الأدنى لعينات 16S 1000 تسلسل مع ما لا يقل عن 5000 كونها مثالية ، في حين أن عينات metatranscriptsomic يجب أن يكون الحد الأدنى من 500،000 تسلسل مع ما لا يقل عن 2 مليون مثالية.
وتظهر عينات الرواسب من 21 موقعا مختلفا في 13 تيارا مختلفا لتحليل 16S و metatranscriptomics. ومن بين تلك المواقع ال 21، كان هناك 12 موقعا في المصب لنشاط التكسير وصنفت على أنها إيجابية للتكسير الهيدروليكي، وكان تسعة منها إما في المنبع من نشاط التكسير أو في مستجمعات مياه كان فيها التكسير غائبا ومصنفا على أنه سلبي التكسير الهيدروليكي. وكما قيم تحليل بيرمانوفا، فإن الفصل الملاحظ بين البيانات الإيجابية والسلبية للتكسير الهيدروليكي يشير إلى أن العينات الإيجابية للتكسير الهيدروليكي تأثرت بالتكسير.
ومن شأن أهم تنبؤات الغابات العشوائية أن تكشف عن السمات الأكثر أهمية للتمييز الصحيح بين العينات. إذا تم تحديد التصنيف على أنه مهم من خلال نموذج الغابة العشوائي ، يمكن مقارنة ملف مقاومته المضادة للميكروبات في العينات الإيجابية للتكسير الهيدروليكي بملفه الشخصي في العينات السلبية التكسير الهيدروليكي. إذا كانت تختلف اختلافا كبيرا، يمكن أن تشير إلى أن السائل التكسير التي تحتوي على المبيدات الحيوية دخلت تيار.
الميكروبات موجودة في كل مكان ، لذلك التلوث هو قضية محتملة كبيرة مع هذا النوع من العمل. تكون خطوات نقل العينة الأولية عرضة بشكل خاص لهذا. إذا كان أحد المهتمين في التحلل البيولوجي الميكروبي أو غيرها من عمليات التمثيل الغذائي، يمكن استخدام تسلسل بندقية من الحمض النووي الريبي للتحقيق في التعبير الجيني الميكروبي النشط.
تسمح هذه التقنية بتوحيد التقنيات الجزيئية للتحقيق في المجتمعات البكتيرية في الموقع ، وكذلك تحليلات المعلوماتية الحيوية لبيانات التسلسل البكتيري.
