نشكر الدكتور Vladana Vukojeviç، مركز الطب الجزيئي، معهد كارولينسكا للصيانة وثيقة زايس Confocor 3 و للحصول على نصائح مفيدة بشأن القياسات الخلية. وقد تم تمويل هذه الدراسة من المنح المقدمة من Vetenskapsrådet (منحة رقم 2012- 1629)، ماغنوس Bergvalls stiftelse، ومن STIFTELSEN كلايس Groschinskys minnesfond.

<ol>
	<li>Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+structure+and+dynamics+of+cell+membranes:+an+update+of+the+Singer-Nicolson+model.">The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).</li><li>Bagawath-Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+Induce+Faster+Membrane+Diffusion+of+MHC+Class+I+and+the+Ly49A+Receptor+in+a+Subpopulation+of+Natural+Killer+Cells.">Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+for+the+study+of+membrane+dynamics+and+protein/lipid+interactions.">Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions.</a> Methods. 46, 116-122 (2008).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).</li><li>Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+vivo.">Fluorescence correlation spectroscopy in vivo.</a> Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).</li><li>Lidke, D. S., Wilson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+act:+quantifying+protein+behaviour+in+living+cells.">Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells.</a> Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).</li><li>Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+correlation+spectroscopy:+principles+and+applications.">Image correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).</li><li>Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImFCS:+a+software+for+imaging+FCS+data+analysis+and+visualization.">ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization.</a> Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).</li><li>Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-techniques:+advances+in+receptor+protein+studies.">The F-techniques: advances in receptor protein studies.</a> Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+principles+and+applications.">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).</li><li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+novel+variations+of+an+established+technique.">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).</li><li>Widengren, J., Thyberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FCS+cell+surface+measurements--photophysical+limitations+and+consequences+on+molecular+ensembles+with+heterogenic+mobilities.">FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities.</a> Cytometry A. 68, 101-112 (2005).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li><li>Meinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+NK+cell+magnetic+bead+isolation+methods+on+phenotype+and+function+of+murine+NK+cells.">Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells.</a> J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).</li><li>Bacia, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+dual-color+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy.">Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).</li><li>Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+coefficients+of+several+rhodamine+derivatives+as+determined+by+pulsed+field+gradient-nuclear+magnetic+resonance+and+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy.</a> J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).</li><li>Petrasek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).</li><li>Stromqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+FCCS+procedure+applied+to+Ly49A-MHC+class+I+cis-interaction+studies+in+cell+membranes.">A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes.</a> Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).</li><li>Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+of+Triplet-States+in+Solution+-+a+Theoretical+and+Experimental-Study.">Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study.</a> J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).</li><li>Humpolickova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 91, L23-L25 (2006).</li><li>Guo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+approach+to+the+analysis+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+data+II:+application+to+simulated+and+in+vitro+data.">Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data.</a> Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).</li><li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).</li><li>Chiu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+(mICS).">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435 (2016).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هذا البروتوكول لFCS يمكن استخدامها لتقييم ديناميات الجزيئية لجزيئات على سطح كل أنواع من الخلايا المناعية (الفئران والبشرية، أو الأنواع الأخرى). تدابير FCS الجزيئية ديناميات المكانية والزمانية وصولا الى قرار جزيء واحد في الخلايا الحية. كثافة الجزيئية، فضلا عن معدل الانتشار وتجميع ديناميات البروتينات من الفائدة، يمكن استخلاصها من منحنيات الارتباط الذاتي. وضع العلامات الفلورية له أهمية محورية للتجارب FCS ناجحة. وقد جرت العادة على تسمية البروتينات من الفائدة على غشاء الخلية باستخدام الأجسام المضادة، والأجسام المضادة وغالبا ما تكون الأكثر ملاءمة للاستخدام على سطح البروتينات في الخلايا المناعية ساذجة. الأجسام المضادة غير المسماة يجب مترافق مباشرة إلى الأصباغ الفلورية صورة مستقرة مع سطوع عالية الجزيئية. اختيار fluorophore لتصريف الأجسام المضادة مهم لجودة القياسات. تسميات موحدة لالتدفق الخلوي،مثل فلوريسئين والأصباغ القائم على فيكوإيريترين، لا ينصح بسبب تبييض السريع. يتم توفير الأصباغ صورة مستقرة للاقتران المباشر إلى أجسام حاليا من قبل العديد من الشركات. دائما ما تقدم الشركات المصنعة للبروتوكولات مرضية للتصريف وتنقية الأجسام المضادة مترافق الناتجة عن ذلك، وهذا يمكن أن يتم في غضون ساعات قليلة. ومن الممكن أيضا لأداء السفح باستخدام البروتينات الفلورية، ولكن ينبغي إيلاء عناية خاصة لتقليل قوة الليزر، منذ البروتينات الفلورية وبشكل عام أكثر عرضة للتبيض من معظم fluorophores الكيميائية صورة مستقرة. وفقا لخبرة سابقة، والإفراط في التعبير عن البروتينات غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كبير في معدل الانتشار بسبب الازدحام، مما يجعل استخدام البروتينات الفلورية غير مناسبة. معايرة ذات الثقب قبل القياسات هي أيضا خطوة حاسمة. وfluorophores المستخدمة لتحديد حجم وحدة التخزين التنسيق يجب أن يكون معروفا معامل الانتشارالصورة (انظر المعادلة 2). استخدام fluorophores حرة المقابلة ارتباطا وثيقا أطياف الانبعاث من التسميات الأجسام المضادة لتحديد حجم وحدة التخزين البؤري. يجب أن يتم ذلك لضمان الكفاءة إشارة الأمثل وكشف المناسب لالمحتملة عبر الارتباط بين قنوات اللون. إجراء FCS سلسلة قوة الليزر للfluorophores نشرها بحرية للتأكد من أن النظام يعطي إشارة خرج المتوقع على نطاق وبين السلطات. مقارنة الاجتماع التحضيري للمؤتمر في قوة الليزر نفسها بين التجارب لضمان الاتساق بين التجارب. في خطوة التحليل، فمن الضروري وضع حدود معقولة والقيم انطلاق للمتغيرات عندما تركب النماذج. استخدام المعرفة التي نشرت في وقت سابق من أنظمة خلايا مماثلة للعثور على نقطة انطلاق جيدة. من الناحية النظرية، FCS هو أسلوب الكمية، ولكن منذ الظروف المثلى نادرا ما يحدث، وعلى درجة معينة من الحذر يجب أن يؤخذ عند تفسير النتائج. وسوف يتم تسجيل جميع أنواع التقلبات،بغض النظر عن منشأ هذه التقلبات. وبالتالي، فإنه من المفيد أن يكون أكبر قدر من المعلومات الممكنة حول النظام التجريبي من أجل استبعاد مصادر الخطأ المحتملة. على سبيل المثال، سوف تنقل غشاء الخلية كله يؤدي إلى تقلبات مع أطول TauD (الشكل 3A)، في حين أن الملوثات المفترضة من fluorophores الحرة في الحل ومنتشر مع عشر مرات على الأقل أقصر TauD. هذا البروتوكول الأساسي يمكن تعديله في عدة طرق. إذا وصفت اثنين من البروتينات مع fluorophores مختلفة، وشارك في نشر (مقياس غير مباشر من التفاعل) يمكن تقييم من خلال توسيع منهجية للكشف عن عبر الارتباط. ويمثل مدى هذه البروتينات تربط مع بعضها البعض في غشاء الخلية من طول منحنى عبر ارتباط نسبة إلى ارتفاع منحنيات الارتباط الذاتي للقنوات الألوان الفردية. يرمز عبر الارتباط كما CH1-CH2 في برنامج القياس. ما قبلتحليل CISE من عبر ارتباط يتطلب ضوابط عبر الحديث وبالتالي فهي إلى حد ما أكثر تعقيدا من بروتوكول المعروضة هنا. وصف مفصل لكيفية المضي قدما، امتدادا لهذا البروتوكول الأساسي، ويمكن العثور عليها في Strömqvist وآخرون. 13. لتحسين المواقع في زي الاتجاه، FCS-مسح ض يمكن استخدام 22. وفقا لتجربة السابقة، فقد كان مرضيا للقيام بذلك يدويا. ومن الممكن أيضا لتتناسب مع عدة معاملات نشر لمنحنى الارتباط الذاتي FCS 23. وهذا يتطلب معرفة سابقة لعدد من الفئات السكانية ذات معدلات الانتشار المختلفة ومعدلات انتشار التقريبية واحد على الأقل من القطعان. خلاف ذلك، سيكون هناك الكثير من المتغيرات الحرة، والتي سوف تجعل من المناسب وغير موثوق بها. ومن الأمثلة النموذجية تكون بروتين السطح الذي تباطأ بشكل ملحوظ بنسبة الربط ليجند معدل الانتشار. وأخيرا، تنظيف ونانوغرام أثر القيم المتطرفة دون تكرار إزالة تماما من الممكن 24. عدم وجود إشارة الفلورسنت هي مشكلة مشتركة لاستكشاف. لنزع فتيل fluorophores بحرية، استخدام مصابيح الهالوجين لمعرفة ما اذا كان الانخفاض الفلورسنت. إذا كان الانخفاض ليس الفلورسنت، مزيج دفعة جديدة من fluorophores مع زيادة طفيفة في تركيز (ضمن نطاق نانومتر) وحاول مرة أخرى. تأكد من أن يتم داخل قطرة الفلورسنت، وتحول تركيز أشعة الليزر على في البرنامج، وقوة الليزر كافية، ويتم اختيار المرشحات الانبعاثات الصحيحة وكاشفات، ويتم تنشيط القنوات الصحيحة في إطار &quot;FCS القياس&quot; (راجع الخطوة 3.6). بدء تشغيل الليزر والبحث من جانب لتأكيد بصريا أن ضوء الليزر يصل العينة. تجنب النظر مباشرة إلى مصدر الليزر. إذا يشمل تصفية الانبعاثات اختيار الطول الموجي ليزر، ومصراع كتلة تلقائيا مسار الضوء لتجنب الأضرار التي لحقت كاشف. أناو كل الإعدادات على ما يرام ولكن لا يوجد ضوء وصول، وإعادة تشغيل جهاز أشعة الليزر، ونظام FCS، والكمبيوتر. اسأل خبير إذا كان عدم وجود إشارة الفلورسنت لا يزال قائما. وينطبق إجراءات مبسطة إذا كانت الخلايا المسمى لا يتم عرض مضان. تأكد من وجود مضان مع مصابيح الهالوجين. بدوره على الليزر، اختيار القنوات الليزر، وضبط قوة الليزر. تحديد موقف من غشاء الخلية، إما باستخدام &quot;التقاطع&quot; أو خيار &quot;إضافة موقف&quot; (راجع الخطوة 6.4). التبديل إلى عينة المقبلة إذا كانت إشارة لا تزال منخفضة جدا. أحد الجوانب الهامة للأساس تذبذب التقنية هو أن الجزيئات يجب أن تكون متحركة بشكل معقول ليتم الكشف. تتحرك ببطء شديد أجزاء من الجزيئات أو جزيئات المحاصرين داخل مناطق أصغر من التركيز خلال فترة القياس كله بالتالي لا يمكن قياسها. وهذا يؤدي إلى التقليل ممكن من الكثافة السطحية والمبالغة في تقدير معدل الانتشار. تبيضويمكن أيضا أن تسهم في التقليل المفترض من كل من الكثافة وTauD، منذ الجزيئات سوف يكون لها احتمال أكبر من أن تبييض قتا أطول ينفقون في الحجم البؤري مضيئة ليزر. سيكون تأثير من الخلفية (مضان من خارج البؤري)، من ناحية أخرى، وزيادة مصطنعة عدد الجزيئات الكشف عن ويقلل من الاجتماع التحضيري للمؤتمر قياسها. سابقا، تم تقدير الخطأ الأقصى الكلي في تحديد كثافة المطلق أن يكون حوالي 40٪ 20. ومع ذلك، فمن الممكن عادة لمقارنة العينات البيولوجية المختلفة لبعضها البعض، حيث أن مصادر الخطأ هي، في معظم الحالات، على قدم المساواة في جميع أنحاء التجارب. مصدر الخطأ محتمل آخر هو أن الأجسام المضادة هي الثنائي التكافؤ، وهذا يعني أن كل الأجسام المضادة يمكن أن يحتمل ربط اثنين من الجزيئات المستهدفة. إلا أن الكتاب لم تلتزم هذه الظاهرة، ولكن لا يمكن ضمان أن هذه الميزة العالمية للأجسام أخرى. التأثير المحتمل لثنائية التكافؤ يجبوبالتالي يتم اختبارها بشكل فردي لكل الأجسام المضادة. مزيج من الأجسام المضادة الابتدائية وصفت محددة يجب ألا تستخدم أبدا بسبب المخاطر العالية على إحداث مجموعات الاصطناعية من تسميات اثنين الثنائي التكافؤ المتعاقبة. إذا وبدلا من ذلك تم transfected الخلايا مع إصدارات الفلورسنت المسمى البروتين من البروتين من الفائدة، فإن كل البروتين يكون تسمية واحدة فقط. ومع ذلك، وهذا يتطلب ترنسفكأيشن، وهي ليست دائما مرغوب فيه وربما لا يكون من الممكن (على سبيل المثال، إذا كان استخدام الخلايا المناعية معزولة مباشرة من الدم البشري). وأخيرا، نقطة واحدة FCS لا تسجيل الصور. إذا كانت هناك حاجة الصور للنشر أو لأغراض أخرى، وهذه يجب أن يتم القبض على حدة باستخدام جزء تصوير البرنامج. دائما التقاط الصور بعد القياسات FCS لتجنب التبييض لا لزوم لها على سطح الخلية. على عكس FCS، المجهري القائم متحد البؤر التقليدية، مثل FRAP، ومنهجيات صورة ارتباط لا يمكن قياس تقلبات مضانعلى مستوى جزيء واحد (6). منهجيات صورة ارتباط قياس عدد جزيئات غير مباشر ومع دقة أقل، ولكنها يمكن تقييم التغير في الانتشار الجزيئي والتجميع على المنطقة بأسرها المصورة 25. معيار SPT قياسها بواسطة المجهر متحد البؤر ديه مستوى مثالي من وضع العلامات، وأوامر من حجم أقل من FCS 7. ولذلك، فإن الكثافة من البروتينات المسمى لا يمكن أن يقاس معيار الفرعية. الجمع بين SPT مع تقنيات المجهر الأخرى (على سبيل المثال، ستوكاستيك المجهر إعادة البناء الضوئي أو تنشيط ضوئي توطين المجهر) يسمح للكثافة وحركة على أن يقسم، ولكنه يتطلب الأصباغ متخصصة جدا أو البروتينات 11. تقنيات فائقة الدقة، مثل عينات غالبا ما تتطلب ثابت منظم إضاءة المجهر والانبعاث المستحث المنضب المجهر، ومزيج من التعليم الابتدائي والأجسام المضادة الثانوية للlabelinز 26. وبالتالي توطين دقيق جدا، في حين أن ديناميات النظام لا يمكن في كثير من الأحيان يتم تقييمها. بالمقارنة مع اللجنة الفرعية وتقنيات فائقة الدقة، كما يتطلب FCS أقل بكثير طاقة الكمبيوتر والوقت لتحليل واستخراج النتائج. التدفق الخلوي هو العمود الفقري لعلم المناعة ويمكن الجمع بين ايجابيا مع FCS. يمكن، على سبيل المثال، ينبغي اتباعها الفرز الخلية عن طريق القياسات اللاحقة على السكان الخلية المحددة إذا استخدمت-صورة مستقرة الأصباغ قبل الفرز. FCS بالتالي هو المنهجية التي يمكن استخدامها وحدها أو بالاشتراك مع الأساليب الأخرى. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ملامح غير معروفة حاليا ديناميات الخلايا المناعية والتفاعلات داخل غشاء الخلية على مستوى جزيء واحد. وعلاوة على ذلك، ملامح السكان كله مقابل فرعية مختارة يمكن مقارنتها. كما أن لديها دور محتمل كخطوة اختيار العلاج الخلايا المناعية. منذ القياسات تفعللا تستهلك الخلية، على عكس معظم وسائل أخرى للتحقيق في وظيفة الخلايا المناعية، يمكن أن الخلايا الفردية المحتمل أن تعافى ومثقف. وهكذا، وبعد تحليل منحنيات FCS، خلايا واعدة يمكن استخراج وتوسيعها لتطبيقات إضافية، بما في ذلك التطبيقات السريرية المفترضة.

العديد من وظائف الخلايا المناعية تعتمد على الانتشار الجزيئي والتفاعلات داخل الأغشية. الأغشية البيولوجية المعقدة، والعديد من العوامل التي قد تكون مهمة لوظيفة الخلايا المناعية يمكن التأثير على سرعة نشر متعدية من البروتينات داخل الأغشية الخلوية 1. وأظهرت لنا مؤخرا أن القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، الخلايا الليمفاوية التابعة للنظام المناعة الفطري، تظهر نشر فرق من اثنين من البروتينات درس في غشاء الخلية تبعا للحالة NK تنشيط الخلايا 2. مضان الارتباط الطيفي (FCS) هو تقنية قادرة على قياس معدلات انتشار الجزيئية داخل الأغشية البيولوجية. فإنه تقارير متوسط ​​معدل الانتشار وصفت من fluorescently الجزيئات في حجم ثابت، وعادة محور المجهر متحد البؤر. لأنه يقوم على قياس التقلبات في مضان التي تحدث على الحركة الجزيئية فينظام في حالة مستقرة. وقد استخدم على نطاق واسع السفح لدراسة نشر الأصباغ الفلورية والبروتينات، سواء في حل وداخل الأغشية الدهنية. ويمكن أيضا معلمات الإخراج الأخرى التي تؤثر على معدل انتشار دراستها بشكل غير مباشر في هذا الشكل (على سبيل المثال، والتغيرات متعلق بتكوين بروتينات أو تفاعلات الجزيئات على أغشية الخلايا) 3، 4. FCS تبرز مقارنة مع التقنيات الأخرى نظرا لحساسيته العالية، مما يتيح إمكانية الكشف عن جزيء واحد. أنه يعمل بشكل جيد لتركيزات الجزيئية في nanomolar إلى مجموعة millimolar، الذي هو الحال بالنسبة للمستويات التعبير الذاتية لمعظم البروتينات 5. وعلاوة على ذلك، يمكن FCS إعطاء رقم تقريبي لعدد المطلق من البروتينات داخل حجم درس، في حين أن معظم تقنيات أخرى تعطي إلا معلومات النسبية حول مستويات بروتين تعبير. طرق أخرى لقياس معدلات انتشار الجزيئية ضمن تشمل الأغشية فلووانتعاش rescence بعد photobleaching من (FRAP)، جسيم واحد تتبع (SPT)، متعددة الثقب FCS، وارتباط صورة الأساليب. FRAP وارتباط صورة الأساليب هي أساليب المجموعات، والتي عادة لا تعطي معلومات حول العدد المطلق للجزيئات 10. مقارنة SPT، مرت من FCS أعلى فيما يتعلق تميز المتوسط ​​السكان. التحليل هو أيضا أقل تطلبا منذ يقاس معدل انتشار الجزيئات الموجودة داخل التركيز الليزر، بدلا من نسبة الجزيئات واحدة. أيضا، إلا إذا المجاهر المتخصصة المتاحة 11، SPT لا يمكن إعطاء أي معلومات عن تركيزات، منذ معيار العلامات الفرعية يجب أن تكون منخفضة جدا للسماح للتعرف على الجزيئات واحدة. من ناحية أخرى، FCS يتطلب الجزيئات قيد الدراسة لتكون متنقلة. انها ببساطة لن يكشف عن أي كسور أو جزيئات متحركة المفترضة تتحرك ببطء شديد. معدل انتشار الجزيئات التييقيمون في التركيز أطول من أن ما يقرب من عشر اكتساب الوقت لا تكون ممثلة بشكل صحيح في القياسات FCS 3، 12. وبالتالي، معاملات نشر سجلتها FCS تميل إلى أن تكون أسرع من معدلات انتشار ذكرت من التقنيات مثل FRAP والفرعية، حيث يتم أخذ الكسور وثيقة لمتحرك وبطيئة جدا في الاعتبار كذلك. سوف SPT أيضا إعطاء وصفا أكثر تفصيلا من تباين معدلات الانتشار بين السكان الجزيئي من FCS سوف. FCS الكمي تذبذب كثافة مضان مع مرور الوقت في حجم متحمس. في حالة قياسات غشاء، وهذا يترجم إلى منطقة مضيئة من الغشاء. في هذه الورقة، ونحن الاستفادة من حقيقة أن مثل هذه التقلبات تكون ناتجة عن جزيئات العارضة نشر البراونية، وبالتالي فهي تتحرك في والخروج من حجم الإثارة. هناك أيضا العديد من مصادر أخرى محتملة للfluctuaستعقد في إشارة مضان، مثل امض أو وجود حالة الثلاثي في ​​fluorophores، والآثار البيئية، ملزم غير ملزم ليجند، أو حركة غشاء الخلية بأكملها. يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند تصميم تجربة FCS من أجل تفسير النتائج بدقة 12، 13 هذه المصادر خطأ المفترضة. عادة، ومعدلات الانتشار الأفقي في الأغشية البيولوجية منخفضة بسبب الازدحام والتفاعلات، سواء بين بروتينات الغشاء وبين البروتينات والهيكل الخلوي. تاريخيا، وبالتالي أعاق استخدام FCS في الأغشية بسبب عدم وجود fluorophores-صور ثابتة، وهي مطلوبة لتجنب التبييض خلال أوقات العبور طويلة من خلال التركيز الإثارة 14. ولكن اليوم، هناك الكثير من الخيارات لالأصباغ صورة مستقرة مناسبة. تحسينات كبيرة في الكشف عن والأجهزة الأخرى تسمح أيضا للكشف عن المتواجد الفلورسنتخصوصيات والأصباغ انخفاض السطوع. هنا، وبروتوكول الأساسية لتطبيق FCS باستخدام الخلايا الليمفاوية الأولية الفئران، حيث يتم وضع علامة على البروتين من الفائدة مع الموسومة fluorescently الأجسام المضادة، وصفت. ويرد أيضا نهجا لتناسب منحنيات الارتباط الذاتي من أجل استخراج معامل الانتشار والكثافة الجزيئية. ويهدف البروتوكول على أن يتبع بسهولة عن طريق المناعة مع عدم وجود خبرة سابقة من التقنيات لدراسة انتشار الجزيئات. ومع ذلك، من المتوقع فهم أساسي من الفحص المجهري متحد البؤر (للحصول على هذا الفهم الأساسي، أنظر المرجع 15). يمكن بسهولة نسبيا أن تتكيف هذا البروتوكول لخلايا تعليق الأخرى، سواء خطوط الخلايا والخلايا الأولية. لمزيد من المستخدمين FCS ذوي الخبرة، وأساليب تحليل أكثر دقة موجودة، وصفها البعض منها في المناقشة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1206">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">MACS NK Cell Isolation Kit mouse II</td>
			<td style="width:367px;">Miltenyi Biotec NordenAB</td>
			<td style="width:181px;">130-096-892</td>
			<td style="width:337px;">Negative selection of NK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Adlrich</td>
			<td style="width:181px;">F7524</td>
			<td style="width:337px;">Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:367px;">-</td>
			<td style="width:181px;">-</td>
			<td style="width:337px;">Made in house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td>
			<td style="width:367px;">PAA The Cell Culture Company&#160;</td>
			<td style="width:181px;">E15-848</td>
			<td style="width:337px;">Transparent medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Antibody clone 2.4G2</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:181px;">553140</td>
			<td style="width:337px;">For blocking Fc-receptors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-Ly49A antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone JR9.318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-H-2Dd antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;">BD Pharmingen</td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;">558915</td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Conjugated in house to MFP488</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone 34.5.8S</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">MFP488</td>
			<td style="width:367px;">Mobiotech</td>
			<td style="width:181px;">MFP-A2181</td>
			<td style="width:337px;">Fluorescent dye for antibody conjugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in distilled water (1.10)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:321px;">Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)</td>
			<td style="width:367px;">SuSoS AG</td>
			<td style="width:181px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Rhodamine 110 chloride</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">432202</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 3.3 &#215; 10&#8722;10 m2/s 19</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Alexa fluor 647</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">A20006</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 4.4 &#215; 10&#8722;10 m2/s 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;">LSM510</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Confocor 3</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Matlab with curve fitting toolbox</td>
			<td style="width:367px;">Matlab</td>
			<td style="width:181px;">Version R2013b</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:367px;">Thermo-scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">155411</td>
			<td style="width:337px;">8 wells, 1.0 borosilicate bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy

مضان الارتباط الطيفي (FCS) هي تقنية قوية لدراسة انتشار الجزيئات داخل الأغشية البيولوجية مع القرار المكانية والزمانية عالية. FCS يمكن قياس الجزيئي تركيز ومعامل الانتشار من جزيئات fluorescently المسمى في غشاء الخلية. هذه التقنية لديها القدرة على استكشاف خصائص الانتشار الجزيئي للجزيئات في الغشاء البلازمي للخلايا المناعية في حالة مستقرة (أي بدون العمليات التي تؤثر على نتيجة خلال فترة القياس الفعلي). FCS مناسبة لدراسة نشر من البروتينات التي يتم التعبير عنها على مستويات نموذجية للبروتينات الأكثر الذاتية. هنا، ويتجلى طريقة واضحة وقوية لتحديد معدل انتشار للبروتينات غشاء الخلية في الخلايا الليمفاوية الأولية. ووصف وسيلة فعالة لإجراء قياسات على خلايا حية ملطخة الأجسام المضادة والملاحظات التي تحدث عادة بعد الاستحواذ. التطورات الأخيرةفي تطوير الأصباغ الفلورية-صور ثابتة يمكن استخدامها من قبل التصريف الأجسام المضادة التي تهم الأصباغ التي لا التبييض على نطاق واسع خلال القياسات المناسبة. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يسمح للكشف عن الكيانات نشرها ببطء، وهي سمة مشتركة من البروتينات التي أعرب عنها في أغشية الخلايا. وسلط الضوء على إجراء تحليل لاستخراج المعلمات التركيز ونشر الجزيئية من منحنيات الارتباط الذاتي التي تم إنشاؤها. وباختصار، يقدم البروتوكول الأساسي لقياس FCS. ويمكن أن يتبعه المناعة مع فهم متحد البؤر المجهري ولكن مع عدم وجود خبرة سابقة أخرى من تقنيات لقياس معلمات الحيوية، مثل معدلات انتشار الجزيئية.

ونتيجة نموذجية توليد منحنى الارتباط الذاتي مع الوقت العابر في حدود 10 مللي ثانية إلى 400 مللي ثانية للبروتينات الغشاء. عدد الجزيئات يمكن أن تختلف بين 0.5 إلى نحو 200 في ميكرون 2 للبروتينات وأعرب التطور الطبيعي. التحقق بعناية أن الاجتماع التحضيري للمؤتمر ليس أقل مما كان متوقعا. وهذا قد يعني أن هناك تأثير للإشارة الخلفية. وكقاعدة عامة، لا ينبغي أن يكون إشارة الاجتماع التحضيري للمؤتمر على الخلايا التي يتم قبولها لتحليل أقل من 33٪ من الاجتماع التحضيري للمؤتمر لنزع فتيل بحرية الأجسام المضادة في قوة الليزر نفسها. الاجتماع التحضيري للمؤتمر يجب تحجيم خطيا مع قوة الليزر. ومن المتوقع أن يكون على نحو سلس، مع الجزء أشد بين 0.001 و 1 ثانية منحنى الارتباط الذاتي لمستقبلات سطح الخلايا المناعية الأولية. انظر الشكل 2 لمنحنى الارتباط الذاتي تمثيلا والتتبع وقته. كما ذكر لفترة وجيزة في المقدمة،إعادة لعدة حالات حيث FCS ليست مناسبة لقياس الانتشار الجزيئي بسبب تأثير مصادر أخرى للتقلبات مضان، التي تساهم في ارباك إشارة. ويبين الشكل 3 أمثلة على الحالات التي يجب التخلص من خلية أو قياس تكرار معين. وقد سبقت الإشارة إلى أنه إشارة منخفضة للغاية (CPM منخفضة جدا) ويسبب لالتخلص من الخلايا. وهناك سبب آخر لالتخلص من الخلايا الفردية هو أن الخلية تتحرك (الشكل 3A). في حالة تبيض (الشكل 3B) أو إذا مجموعات كبيرة موجودة (الشكل 3C)، يجب التخلص من القياسات إذا كان تأثير كبير أو حاضرا خلال قياس كله. إذا كانت هذه الميزة موجودة فقط في واحد أو اثنين من يكرر، قد يتم تجاهل هذه التكرارات الفردية، ولكن ربما لا تزال تستخدم يكرر المتبقية. ومن المهم على حد سواء استخدام الصحيحنموذج لاحتواء البيانات وأيضا للتحقق بعناية أن يصلح يتداخل بشكل وثيق مع منحنى الارتباط الذاتي. في الشكل (4)، وتظهر أمثلة من نوبات منحنى الجيدة والسيئة. إيلاء اهتمام وثيق من جانب نشر منحنى تمثل (الجزء المنحدرة الأكثر حاد). ومن المهم أيضا للتأكد من أن كلا من بداية ونهاية الجزء المنحدرة من منحنى مهيأة بشكل جيد في النموذج. إذا كان لائقا سيئة، دون مشاكل واضحة مثل الحركة، وتبيض، أو مجموعات، تعديل القيم البداية و / أو الحدود العليا والدنيا (ضمن نطاق معقول) قبل اتخاذ قرار نهائي لتجاهل الخلية. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig1.jpg" /> الشكل 1: واجهة البرنامج FCS. المعروضة هنا هي النوافذ الرئيسية اللازمة لتشغيل أداة برمجية لاكتساب FCS والتصوير، كما هو موضح في البروتوكول. نافذة لل، و &quot;شركة تكوينntrol &quot;نافذة إطار التحكم عن مسار الشعاع، وقنوات ليزر، والمرشحات للتصوير. النافذة B هو&quot; مسح تحكم &quot;نافذة للتصوير ويظهر إعدادات المسح الضوئي. النافذة C هو&quot; قياس &quot;النافذة، نافذة لل إعداد إعدادات قياس FCS. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig2.jpg" /> الشكل 2: أثر الممثل والارتباط الذاتي منحنيات نشرها من الدرجة الرابعة التوافق النسيجي الرئيسية-H 2D أنا سطح الجزيئات في الفئران المعزولة حديثا الخلايا القاتلة الطبيعية. تظهر لوحة العليا في الشكل التقلبات مضان بوصفها وظيفة من الزمن في جميع أنحاء الوقت أثر كاملة من 7X 10 القياسات ثانية. تمثل اللوحة السفلىق منحنى الارتباط الذاتي متوسط ​​من هذه تكرار سبعة. ارتفاع منحنى الارتباط الذاتي يتناسب عكسيا مع تركيز fluorescently المحمول المسمى الكيانات د H-2D في الحجم البؤري. قيمة محور س في الجزء أشد المنحدر من منحنى، نصف السعة، ويمثل متوسط فترة بقاء fluorescently المسمى H-2D جزيئات د في الحجم البؤري. قياس قدم هو جزء من مجموعة البيانات المنشورة في اشارة 2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig3.jpg" /> الشكل (3): أمثلة من آثار خلية إشكالية. (أ) خلية متحركة، كما يتضح من أثر عدم وجود مستقر القاعدية جنيه<html> فيل. تظهر لوحة أعلى على سبيل المثال حيث انتقلت من خلية كاملة من التركيز بعد حوالي 35 ثانية، ممثلا في إشارة منخفضة جدا بعد هذه النقطة الوقت. في اللوحة السفلى، وأثر هو أكثر دقة، مع تموجات واضحة في الفترة الفاصلة من عدة ثوان. (ب) الخلية يعرض التبييض، وارتفاع أثر تناقص مع مرور الوقت. مقارنة ارتفاع التتبع في بداية القياس لأنه في نهاية القياس. (ج) وجود مجموعات كبيرة، ممثلة المسامير في التتبع. في لوحة العلوي، واحدة كتلة كبيرة في 20-25 ثانية موجودة. في اللوحة السفلى، عدة مجموعات موجودة في جميع أنحاء القياس. القياسات المقدمة هي جزء من مجموعة البيانات المنشورة في اشارة 2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> er.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig4.jpg" /> الشكل 4: منحنيات الارتباط الذاتي التمثيلية مع منحنى العظام والبقايا. تمثل خطوط عمودية حمراء وزرقاء حدود النافذة مرة تستخدم لتركيب. (أ) مثال لصالح الممثلين نموذج نشر 2-الأبعاد إلى منحنى عينة الارتباط الذاتي. في لوحة العلوي، ومنحنى الأخضر (نموذج) يعلو منحنى الأزرق (والارتباط الذاتي المكتسبة)، مما يدل على حسن صالح. تظهر لوحة أقل المتبقي من منحنى المناسب. تقلبات حوالي 1 ثانية، والتي لم يتم تركيبها بشكل جيد، هي نموذجية لقياس الخلايا وتكون مقبولة. (ب) مثال من نوبة سيئة للنشر 2-الأبعاد لنفس منحنى الارتباط الذاتي. نموذج المجهزة لا تراكب منحنى الارتباط الذاتي، وأنها لا تتلاقى في 1. في أقل الألواح في (A و B) تظهر المتبقي من منحنى المناسب. المخلفاتهي أكبر بكثير لنوبة سيئة، وخصوصا للمناطق انتشار المنحنى. قياس قدم هو جزء من مجموعة البيانات المنشورة في اشارة 2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

الانتشار الجزيئي في أغشية البلازما للخلايا الليمفاوية الأولية يقاس بواسطة التحليل الطيفي للارتباط الفلوري | علم المناعة والعدوى | فيديو

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

molecular-diffusion-plasma-membranes-primary-lymphocytes-measured

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Membranes and Cellular Transport

SCIENTISTS IN ACTION

10.8K Views.  Karolinska Institutet. A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Video: Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

قياس درجة الحموضة يبلوع التي كتبها Ratiometric المجهر مضان

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

يبلوع الهجرة والسرعة تقاس في لايف الابتدائية الضامة الإنسان المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...