The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

<ol>
	<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes.">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li><li>Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+deterioration+determines+the+onset+and+rate+of+progression+of+secondary+dietary+failure+in+type+2+diabetes+mellitus:+the+10-year+follow-up+of+the+Belfast+Diet+Study.">Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study.</a> Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).</li><li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass.">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).</li><li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLGA-based+nanoparticles:+an+overview+of+biomedical+applications.">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).</li><li>Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta+cell+lines+and+their+applications+in+diabetes+mellitus+research.">Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research.</a> ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).</li><li>Rui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+using+poly-lactic-co-glycolic+acid+microspheres:+in+vitro+characterization+and+application+in+polycaprolactone+fumarate+nerve+conduits.">Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits.</a> Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).</li><li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas.">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization+and+in-vitro+evaluation+of+sustained+release+protein-loaded+nanoparticles+based+on+biodegradable+polymers.">Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers.</a> Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).</li><li>Riley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connective+tissue+growth+factor+modulates+adult+beta-cell+maturity+and+proliferation+to+promote+beta-cell+regeneration+in+mice.">Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice.</a> Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).</li><li>Mosser, R. E., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+small+scale+screening+of+candidate+beta+cell+proliferative+factors+using+intact+islets.">An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets.</a> Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).</li><li>Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+interactions+regulate+beta-cell+proliferation+in+islet-like+structures.">E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures.</a> Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).</li><li>Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+regulation+of+islet+beta+cell+mass+in+mice:+the+role+of+E-cadherin.">Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin.</a> Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).</li><li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation.">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li><li>Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+culture+and+preservation+strategies:+advances,+challenges,+and+future+outlook.">Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook.</a> Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+(ROS)+Responsive+Polymers+for+Biomedical+Applications.">Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications.</a> Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).</li><li>Makadia, H. K., Siegel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+Lactic-co-Glycolic+Acid+(PLGA)+as+Biodegradable+Controlled+Drug+Delivery+Carrier.">Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier.</a> Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).</li><li>Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+loaded+with+insulin-phospholipid+complex+for+oral+delivery:+preparation,+in+vitro+characterization+and+in+vivo+evaluation.">Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation.</a> J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).</li><li>Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-based+technologies+for+osteoarthritis+detection+and+therapy.">Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li><li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues.">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li><li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وعادة ما يعرقل دراسة انتشار β خلايا في الثقافة من قبل العديد من الصعوبات. أولا، تتميز خلد خطوط β-الخلية درجات أعلى من انتشار من ما هو موجود في الذاتية β-الخلايا في الجزر الحية. بالإضافة إلى ذلك، هذه خطوط الخلايا خلد تفتقر إلى بنية طبيعية حاسمة لوظيفة عادية β-الخلية. هاتين الحقيقتين تجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام خطوط β خلايا خلدت سيعقد صحيح عند اختباره في الجسم الحي أو في الجزر كلها. لدينا بروتوكول وصفها، والذي يستخدم المعزولة حديثا الجزر الماوس سليمة، وتلتف هذه القضايا كما يتم الحفاظ على العمارة جزيرة وانتشار β-خلية مماثلة لتلك الموجودة في الجسم الحي. واحد قلق كبير عند زراعة الجزر سليمة هو احتمال أن الخلايا داخل نواة جزيرة سيخضع نخر الناجم عن نقص الأكسجة أو لن تتعرض لrhCTGF. لهذا السبب، نهائييضاف تركيز 0.1 ملي EGTA إلى وسائل الإعلام لتخفيف الاتصالات خلية خلية دون تعطيل العمارة جزيرة. نشرنا سابقا أن إضافة EGTA وحدها يمكن أن تزيد من انتشار خلايا بيتا، ويرجع ذلك يفترض أن زيادة فرص وصول المواد الغذائية وmitogens في وسائل الإعلام حتى النخاع جزيرة 12. ويمكن أيضا أن يكون راجعا إلى انخفاض في خلية خلية الاتصال نفسه 13،14 الزيادة في انتشار β خلايا ردا على EGTA. وتستكمل وسائل الإعلام وصفها في هذا البروتوكول أيضا مع مصل الحصان بدلا من أكثر تقليدية الجنين المصل البقري. يتم هذا الاستبدال بسبب وجود محفز الإلبان المشيمي في المصل البقري الجنين، والتي يمكن أن تحفز تكاثر خلايا بيتا من تلقاء نفسها، ويحتمل أن يعقد التحليل في فحص انتشار الأسلحة النووية. تحديد سمية النسبية للالمجهرية PLGA (مع أو بدون هيئة النزاهة) إلى الخلايا جزيرة يمكن تقييمه من خلال تحليل المناعي أماهrkers من موت الخلايا أو التلف في الحمض النووي، بما في ذلك النفق أو γ-H2AX 15،16. على الرغم من أن إضافة المجهرية PLGA لم تظهر أي آثار ضارة واضحة إلى الجزر المجراة سابقا، يجب أن يكون المستخدمون على بينة من الآثار التي يمكن أن تترتب على المجهرية تحليل الصور. كما هو موضح في الشكل (3) والمذكورة في قسم النتائج، يمكن المجهرية undegraded يكون واضحا كما البقع الداكنة في الصور مناعي، مع مزيد المجهرية التي تظهر عندما يتم استخدام تركيزات متزايدة. وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول وصف وجرى تصميم للعمل مع الجزر الماوس معزولة. على هذا النحو، فإنه من غير الواضح إذا كانت الظروف متطابقة ستعمل مع الجزر تحصد من الكائنات بديلة، مثل الفئران والبشر. والجدير بالذكر أن الجزر تحصد من الكائنات الحية المختلفة في كثير من الأحيان ظروف مختلفة زراعة الأمثل وبدرجات متفاوتة من β خلايا انتشار 17،18. العديد biomالمقيدين تتوفر لإدارة rhCTGF إلى جزر معزولة، بما في ذلك بولي (thioketal يوريتان) وبولي (البروبيلين كبريتيد) 19 محتملة. اخترنا التركيز على PLGA بسبب عدة الصفات البارزة التي تملكها. أولا، PLGA هو كاشف بأسعار معقولة نسبيا والمجهرية يمكن أن تتولد مع المعدات القياسية (الطرد المركزي، الخالط، مجفاد) متوفرة في معظم المؤسسات البحثية. PLGA هو البوليمر الاصطناعية التي لديها سابقة للاستخدام الناجح في الأجهزة المعتمدة ادارة الاغذية والعقاقير نظرا لتوافق مع الحياة، التحلل البيولوجي، وقدرتها على تعديل معدلات الانبعاث مركب 20. PLGA يحط من قبل التحلل المائي في وجود الماء، والإفراج عن البضائع في هذه العملية. التركيب الكيميائي للجزيئات PLGA يمكن أن تكون مصممة بحيث يتم الإفراج عن مركب في الجسم الحي على مدى عدة أسابيع. كما تم استخدام PLGA في التجارب على الحيوانات قبل السريرية والعلاجات السريرية الإنسان محليا إدارة المركبات لمختلف الأجهزة وTISSUوفاق 21،22. ويمكن أيضا البوليمرات مسعور أخرى يمكن استخدامها في توليد المجهرية القابلة للتحلل. ويمكن لهذه البوليمرات يستجيب للمؤثرات بيئية محددة، مثل درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، ووجود أنواع الاكسجين التفاعلية 23،24. وبالتالي، يجب على الباحثين أن ينظر بعناية مادة بيولوجية هو الأنسب لدراستهم. أي باحث الاستفادة PLGA، أو المواد الحيوية الأخرى، لدراسة انتشار خلايا بيتا خارج الحي يجب أن يكون على بينة من الخلافات المحتملة بين آثار النزاهة مغلفة مقارنة unencapsulated هيئة النزاهة. على سبيل المثال، يمكن تسليم rhCTGF عبر PLGA تغيير درجة وتوقيت β خلايا انتشار تحريض مقارنة مع العلاج مع البروتين unencapsulated. الدراسات الجارية في مختبرنا وتدرس حاليا هذه الاختلافات المحتملة. تحليل انتشار β خلايا في الجزر مثقف هو نموذج قوي لتحديد وليتحليل chanistic من mitogens β-الخلية. باستخدام مقايسة الموصوفة هنا نعرض طريقة سريعة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لإدارة لجنة النزاهة في الجزر مثقف معزولة مع وسيلة الافراج عن تسليم طويلة. وينبغي أن يكون هذا الاختبار ينطبق على أي نحو النزاهة من الفائدة، وخيارنا للتركيز على CTGF يستند فقط على قدرة نشرت سابقا لتحفيز تكاثر خلايا بيتا في الجسم الحي وخارج الحي 11. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا الفحص صحة فعالية وسلامة استخدام PLGA كوسيلة من وسائل إيصال قبل التقدم إلى نماذج حيث يتم زرع الجزر في الكائنات الحية. وعموما، يوفر بروتوكول وصف طريقة جديدة لإدارة المركبات في الجزر مثقف مع تأثير أوسع على قياس سلامة PLGA إلى الأنسجة استنساخها.

البنكرياس β-الخلايا هي الوحيدة الخلايا المنتجة للانسولين في الجسم وحاسمة للحفاظ على مستوى السكر في الدم التوازن. بينما الأفراد الأصحاء لديها ما يكفي من الكتلة β خلايا وتعمل على تنظيم مستوى السكر في الدم بشكل صحيح، وتتميز الأفراد مع مرض السكري عن طريق عدم كفاية كتلة β خلايا و / أو وظيفة 1،2. وقد اقترح أن يحفز انتشار β خلايا يمكن أن تزيد في نهاية المطاف كتلة خلايا بيتا واستعادة توازن الجلوكوز في الأشخاص الذين يعانون من مرض السكري 3. ومع ذلك، وتقييم والتحقق من المركبات التكاثري β خلايا المحتملة في الجزر سليمة ضروري قبل علاجات فعالة يمكن تطويرها. زرع الجزر الإنسان المتوفين دماغيا في الأفراد الذين يعانون من مرض السكري يعيد السكر في الدم التوازن لبعض الوقت، ولكن يكبح توافر ونجاح هذا الإجراء التجريبي بسبب النقص في الجزر البشرية المتاحة للزرع وفاة بيتا خلية في الخلف الجزرزرع إيه 4. حتى مع اكتشاف العوامل التي تحفز على تكاثر الخلايا المنتجة للأنسولين، تحديا كبيرا لا يزال موجودا في تقديم هذه العوامل إلى المواقع ذات الصلة في الجسم الحي. استراتيجية واحدة للتسليم المحلي المستدام من β خلايا المركبات التكاثري هي بولي (اللبنيك-ك-الجليكوليك) حامض (PLGA). لديها PLGA تاريخ استخدام في ادارة الاغذية والعقاقير وافق تسليم المنتجات المخدرات بسبب سلامتها عالية، التحلل البيولوجي، وحركية الافراج عن 5 ممتدة. على وجه التحديد، PLGA هو كوبوليمر من lactide وglycolide أن يحط عن طريق التحلل بالماء إما في الجسم الحي أو في الثقافة إلى حمض اللاكتيك وحمض الجليكوليك، والتي تحدث بشكل طبيعي التمثيل الغذائي في الجسم. مجمع المخدرات مغلفة يمكن أن تنطلق في البيئة المحيطة من قبل كل من نشر و / أو آليات الافراج التي تسيطر عليها تدهور. التغليف من هيئة النزاهة يوفر الحماية ضد تدهور الأنزيمية، وتحسين التوافر البيولوجي للكاشف مقارنة unencapsulaتيد هيئة النزاهة 5. نقترح المجهرية PLGA يمكن استخدامها لإدارة المركبات مرشح لجزر سليمة في الثقافة، وفي نهاية المطاف في الجسم الحي. اختبار فعالية PLGA لإدارة mitogens خلايا بيتا في جزر المجراة سابقا من الأهمية بمكان قبل أن يتم استكشاف بروتوكولات الزرع. حاليا، ليس هناك تقنية لقياس انتشار خلايا بيتا في الحيوانات الحية. التجارب لتقييم فعالية مركبات التكاثري المحتملة في الجسم الحي وبالتالي تتطلب إدارة هذه المركبات للعيش الحيوانات، مع تشريح لاحق وتجهيز بنكرياسات لimmunolabeling. هذه البروتوكولات هي مكلفة وشاقة، وتتطلب مجمع على أن تدار بشكل منتظم، دون أي ضمانات بأنهم سوف تصل إلى الجزر. على العكس، هي عدة خطوط خلايا بيتا خلد المتاحة لدراسة الخلايا المنتجة للأنسولين في الثقافة، ولكن هذه خطوط الخلايا تفتقر إلى بنية جزيرة والبيئة ...ر الموجودة في الكائنات الحية 6. تتميز خلد خطوط خلايا بيتا أيضا وجود درجة أعلى بكثير من النسخ من الذاتية β خلايا في الجسم الحي، مما يعقد تحليل المركبات التي تحفز على انتشار الأسلحة النووية. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول يستخدم الجزر سليمة معزولة من فئران بالغة. على عكس خطوط β خلايا، الجزر سليمة تحتفظ العمارة جزيرة طبيعية. وبالمثل، على النقيض من التجارب التي أجريت في الجسم الحي، وإدارة المركبات التكاثري مباشرة إلى الجزر سليمة مثقف يقلل بشكل كبير من كمية من الكواشف ما هو ضروري لقياس بدقة انتشار خلايا بيتا. الدراسة الحالية تستخدم PLGA لإدارة هيئة النزاهة، في هذا المثال، الضامة عامل نمو الأنسجة البشري المؤتلف (rhCTGF). الطريقة الموصوفة هنا يمنح تفوقا كبيرا على إدارة مجمع الخام إلى الجزر مثقف لأنها تسمح لاطلاق سراح المستمر من المركب إلى عشروسائل الإعلام الإلكترونية. والجدير بالذكر أن هذا الاختبار يمكن تعديلها لإدارة مجموعة واسعة من البروتينات والأجسام المضادة التي تهم الجزر سليمة. الآثار على أنواع الخلايا في الغدد الصماء الأخرى، بما في ذلك α خلايا، ويمكن أيضا أن تحلل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O6149</td>
			<td style="width:307px;">For labeling COI with fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP231-1</td>
			<td>For dissolving fluorophore in step 1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable PD-10 Desalting Columns</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td>Desalting column used in step 1</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000-69,000</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">739960</td>
			<td>Used in generation of microspheres in step 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000-98,000</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">341584</td>
			<td>Used in generation of microspheres in step 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11879-020</td>
			<td>For culturing islets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dextrose Anhydrous</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">200-075-1</td>
			<td>Supplement for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td>Antibiotics for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal horse serum</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">008-000-121</td>
			<td>Supplement for islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3603</td>
			<td>For culturing islets</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td>Supplement for pre-assay islet media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A78300003</td>
			<td>For spinning cells onto microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EZ Single Cytofunnel</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A78710020</td>
			<td>For spinning cells onto microscope slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>Used in dissociating islets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>For fixing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton&#160; X-100</td>
			<td style="width:179px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP151</td>
			<td>For permeabilizing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal donkey serum</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">017-000-121</td>
			<td>Blocking reagents for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab15580</td>
			<td>For Ki67 immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">A0564</td>
			<td>For insulin immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-165-152</td>
			<td>For Ki67 immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">706-175-148</td>
			<td>For insulin immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aqua-Mount</td>
			<td style="width:179px;">Lerner Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13800</td>
			<td>Fast drying mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">FreeZone -105&#176;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td style="width:179px;">Labconco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7382020</td>
			<td>For lyophilization of microspheres</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

تطوير المواد الحيوية قد زاد بشكل كبير من إمكانية تسليم المخدرات تستهدف مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة أنواع، بما في ذلك β خلايا البنكرياس. وبالإضافة إلى ذلك، توفر أيضا جزيئات بيولوجية، الهلاميات المائية، والسقالات فرصة فريدة لإدارة مستدامة وتقديم الأدوية يمكن السيطرة على بيتا خلايا في الثقافة وفي نماذج الأنسجة المزروعة. تسمح هذه التقنيات لدراسة العوامل انتشار مرشح β-الخلية باستخدام الجزر سليمة ونظام ذات الصلة translationally. وعلاوة على ذلك، تحديد فعالية وجدوى من العوامل مرشح لتحفيز انتشار β خلايا في نظام الثقافة أمر بالغ الأهمية قبل المضي قدما إلى نماذج في الجسم الحي. هنا، نحن تصف طريقة للمشاركة في ثقافة الجزر الماوس سليمة مع مجمع للتحلل من الفائدة (هيئة النزاهة) بولي -loaded (حمض اللبنيك-ك-الجليكوليك) (PLGA) المجهرية لغرض تقييم آثار مستمرة في الموقع الافراج سالعوامل مولد للتفتل و على انتشار β-الخلية. توضح هذه التقنية بالتفصيل كيفية توليد المجهرية PLGA التي تحتوي على البضائع المطلوب باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا. في حين تستخدم تقنية الموضحة عامل المؤتلف الإنسان الضامة نمو الأنسجة (rhCTGF) على سبيل المثال، يمكن بسهولة أن تستخدم مجموعة واسعة من النزاهة. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة تستخدم لوحات 96-جيدا لتقليل كمية من المواد الكيميائية اللازمة لتقييم انتشار خلايا بيتا. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام المواد الحيوية البديلة وغيرها من الخصائص خلية الغدد الصماء مثل بقاء الخلية وحالة التمايز.

الرقم 1 هو تمثيل مرئي للالمجهرية المولدة باستخدام بروتوكول أعلاه. بروتوكول الموصوفة هنا غلة المجهرية تحميل rhCTGF من مختلف الأحجام. وأكبر جزء من المجهرية أن يكون بين 1 و 10 ميكرون في القطر، وعلى الرغم من بعض المجهرية قد يكون أكبر (الشكل 2). إذا رغبت في ذلك، حجم microsphere يمكن ضبطها والأمثل استنادا إلى معايير تلفيق مثل سرعة التجانس والوقت، والتركيز السطحي المستخدمة، وكميات النسبية لكل مرحلة المياه / النفط / الماء (10). وبعد تشتت الجزر سليمة تعامل مع المجهرية PLGA وimmunolabeling لاحقا، فمن الشائع أن نرى مناطق العينة خالية من أي وضع العلامات في بين الخلايا (الشكل 3). في حين أن معظم المجهرية التي لا تزال على حالها بعد فترة العلاج الثقافة هيإزالة خلال خطوات الغسيل، لا تزال بعض بعد نسج الجزر على شرائح المجهر. هذه المجهرية تتسبب في هياكل تشبه ثقب تصور أثناء التصوير. هذه المجهرية المتبقية عادة لا تتداخل مع الكمي لاحق. بعد التصوير، والنسبة المئوية للخلايا Ki67 إيجابية / إيجابي الأنسولين يمكن أن يكون كميا عن طريق العد يدويا العدد الكلي للخلايا المسمى، أو باستخدام تحليل صورة البرنامج. سابقا، لقد أثبتنا أن الضامة عامل نمو الأنسجة البشري المؤتلف (rhCTGF) يمكن أن تحفز انتشار الماوس β خلايا في الجزر سليمة خارج الحي 11. باستخدام بروتوكول المذكور، ولدت لنا المجهرية PLGA التي تحتوي على rhCTGF (rhCTGF-PLGA). علاج الجزر سليمة مع المجهرية rhCTGF-PLGA لمدة 3 أيام أسفرت عن زيادة مماثلة في انتشار β-خلية كما ذكرت سابقا مع البروتين الخام، مما يدل على أن البروتين لم يكن لو<html> حد ذاتها أي وظيفة خلال جيل microsphere (الشكل 4). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig1.jpg" /> الشكل 1: التمثيل المرئي للPLGA الجزئي من خلال دمج صبغة الفلورسنت في بروتوكول التصنيع، المجهرية PLGA يمكن تصور باستخدام مجهر epifluorescent. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54664/54664fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig2.jpg" /> الشكل 2: حجم توزيع PLGA الجزئي على الرغم من أن حجم التوزيع قد تختلف، ومعظم المجهرية سيكون أقل من 10 ميكرون في القطر.arget = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig3.jpg" /> وimmunolabeled التصور مناعي من فرقت المتكاثرة خلايا بيتا فرقت الجزر للعلامة انتشار Ki67 (الحمراء)، والانسولين (الأخضر) للاحتفال تنتشر خلايا بيتا: الرقم 3. وصفت نوى مع دابي (الأزرق). السهام تشير الخلايا Ki67 إيجابية / الإيجابي المعتمد على الأنسولين. النجمة (*) تشير المجهرية undegraded. يمثل شريط مقياس 100 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54664/54664fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54664/54664fig4.jpg" /> الشكل 4: الكمي وتحليل β خلايا بروliferation. الجزر تعامل مع كميات مختلفة من المجهرية rhCTGF-PLGA. وقد أحصى عدد الخلايا Ki67 إيجابية / إيجابي الانسولين يدويا من جميع العينات وكنسبة مئوية من إجمالي عدد β-خلايا الأنسولين الإيجابي. X-محور يتوافق مع تركيز النهائي من rhCTGF موجودة في كل معاملة. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام باتجاه واحد يتبع أنوفا من التجارب المقارنة متعددة توكي و. تم تعيين دلالة إحصائية عند P ≤ 0.05. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54664/54664fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sustained Administration of ÃŽÂ²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres at JoVE.com

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

إدارة مستدامة للMitogens β-خلية لالفشوت ماوس سليمة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; عن طريق تحلل بولي (حامض اللبنيك في-ك-الجليكوليك) الجزئي

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Views.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

Video: Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

عالية الدقة 3D تصوير السابقين فيفو العينات البيولوجية بواسطة CT مايكرو

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

خارج الحي تقليد تكون الدم الإنسان العادية وغير العادية

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

التصوير الضوئي المجال تواتر<em&gt; خارج الجسم</em&gt; عينات استئصال الرئة: الحصول على صورة واحدة واحدة لارتباط لالتشريح المرضي

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; الإنسان المشيمة الإرواء الموديل

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

الخلايا الجذعية العلاجية البرمجة لتكوين الأوعية الدموية عن طريق تحلل البوليمر النانوية

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these foreign molecules to T and B lymphocytes. Lymph nodes have thus become critical targets for new vaccines and immunotherapies. A recent strategy for targeting these tissues is direct lymph node injection of soluble vaccine components, and clinical trials involving this technique have been promising. Several biomaterial strategies have also been investigated to improve lymph node targeting, for example, tuning particle size for optimal drainage of biomaterial vaccine particles. In this paper we present a new method that combines direct lymph node injection with biodegradable polymer particles that can be laden with antigen, adjuvant, or other vaccine components. In this method polymeric microparticles or nanoparticles are synthesized by a modified double emulsion protocol incorporating lipid stabilizers. Particle properties (e.g.&#160;size, cargo loading) are confirmed by laser diffraction and fluorescent microscopy, respectively. Mouse lymph nodes are then identified by peripheral injection of a nontoxic tracer dye that allows visualization of the target injection site and subsequent deposition of polymer particles in lymph nodes. This technique allows direct control over the doses and combinations of biomaterials and vaccine components delivered to lymph nodes and could be harnessed in the development of new biomaterial-based vaccines.

Lymph nodes are the immunological tissues that orchestrate immune response and are a critical target for vaccines. Biomaterials have been employed to better target lymph nodes and to control delivery of antigens or adjuvants. This paper describes a technique combining these ideas to inject biocompatible polymer particles into lymph nodes.

حقن العقدة داخل الليمفاوية من جزيئات البوليمر القابلة للتحلل الحيوي

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

استخدام لل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; جهاز تشاندلر حلقة لتقييم توافق مع الحياة من التعديل أنابيب الدم البوليمرية

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

تحضير وإدارة وتقييم الامتصاص الخلوي الخاص بالأنسجة الحية للجسيمات الشحمية الفلورية ذات العلامات الصبغية

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...