وأيد هذا العمل عن طريق منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (MCB-0923794 لFT).

1. إنتاج Perithecia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مركز أجار الجزرة تطعيم 10 في طبق بيتري بقطر 6.0 سم مع سلالة خصبة من F. graminearum (رشح PH-1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تلقيح أطباق تحت الأضواء الفلورية مشرق في درجة حرارة الغرفة (18-24 درجة مئوية) والسماح لتنمو حتى المشيجة وصلت الى الحافة الخارجية للطبق بيتري (3-5 أيام). أضواء الفلورسنت المنزلية التجارية تعمل بشكل جيد لتحفيز الاثمار تشكيل هيئة والتفريغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف فطر جوي مع المسواك العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع 1.0 مل 2.5٪ توين 60 AQ إلى السطح مع hockeystick زجاجية معقمة أو نهاية مقربة من قضيب زجاجية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة لوحات للضوء. لا تضيف Parafilm إلى لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، وينبغي على السطح من لوحات لها مظهر لامع. إذا فطر يظهر، سطح كشط وإعادة تطبيق توين-60 حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة تطور perithecia خلال الاسبوع المقبل. في المراحل المتوسطة منيمكن حصاده مزقاق التنمية عن طريق كشط بلطف من سطح أجار وفلاش تجميد لاستخراج الحمض النووي الريبي (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تتراكم الجراثيم الناضجة على غطاء لوحة من قبل يوم واحد 7. في البداية سوف تكون هذه فقط مرئية تحت المجهر تشريح، ولكن بحلول يوم 9، أنها سوف تراكمت لكثافة كافية لكي تكون مرئية للعين المجردة. </li></ol> 2. بوغ زقي التفريغ الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 6 بعد تطبيق حل توين، وقطع بقطر 1 سم للخروج من دائرة أجار مع حفار الخشب. بدلا من ذلك، يمكن استخدام مشرط لإزالة قطعة مماثلة الحجم. يمكن شرائح الدائرة في كل شوط ونصف وضعها على شريحة ميكروسكوب زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتطلق توجيه القطع بحيث السطح تحتوي على جثث الاثمار هو عمودي على سطح الشريحة، والجراثيم في أسفل طول الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة في غرفة الرطوبة بين عشية وضحاها تحت الاضواء. وسوف تتراكم على جراثيمالشريحة وتكون مرئية للعين المجردة في صباح اليوم التالي (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن غسلها الجراثيم المتراكمة خارج الشريحة بالماء وكميا اذا شئت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن يعاير المحتملة مثبطات التفريغ بوغ زقي عن طريق إضافتها إلى الجانب الخلفي من كتلة أجار خلال الجمعية العامة للفحص. وقد تم بعض مثبطات قناة أيون التي تقلل من إفرازات يعاير سابقا مع هذه التقنية 15. </li></ol> 3. جيل من نسل المؤتلف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء عبور، فحقن أجار الجزرة مع اثنين من سلالات F. graminearum (واحد + الصأبة واحد أحمق)، ووضع نقاط تطعيم على طرفي نقيض من طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة خيوط ملأت السطح، وكشط جزء من الجو وتطبيق توين-60 حل على النحو المبين أعلاه. استخدام علامة ملاحظة على جانب طبق بيتري حيث خيوط الوفاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى ضوء الثقافات واحتضان حتى perithecia قد وضعت، ويكون قد cirrhiمسدس على شكل من perithecia على طول التقاطع بين الثقافتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، جلب إلى عرض perithecia على طول التقاطع من الثقافتين. باستخدام دبوس الحشرات، وتعقيمها، وانخفض إلى الماء المعقم، لمس cirrhus على طول هذه الحدود بخفة مع غيض من دبوس. ينبغي للرطوبة على دبوس السماح للcirrhus التمسك دبوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف غيض من دبوس مع cirrhus عليها في المياه المعقمة 200 ميكروليتر في أنبوب إيبندورف لغسل قبالة جراثيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشعلة دبوس، بلل مرة أخرى واختيار آخر cirrhus. اختيار 10-15 cirrhi، ووضع كل منها في أنبوب منفصلة من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التي تحتوي على أنابيب علقت لفترة وجيزة دوامة cirrhi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 60 ميكرولتر من تعليق بوغ مع ماصة والمكان في المتوسط ​​MMTS 1 في طبق بيتري الطول 9. نشر بعصا الهوكي عقيمة. ويمكن تخزين تعليق بوغ المتبقية في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع وreplated إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubaالشركة المصرية للاتصالات في درجة حرارة الغرفة (الضوء ليس ضروريا) لمدة 3-5 أيام حتى تظهر مستعمرات صغيرة جدا (الشكل 3). لن يكون هناك نوعين من الظواهر بين المستعمرات. وسوف المستعمرات أحمق يكون بين خيوط تناثرا من المستعمرات + الصأبة. وسوف Cirrhi من المؤتلف perithecia إظهار كل الظواهر مستعمرة في نسبة متساوية تقريبا. تجاهل لوحات مع مستعمراتها من النمط الظاهري واحد فقط عليها. لاحظ أنه في بعض الأحيان أكثر من عقدين من الظواهر ينتج بسبب الفصل بين عوامل أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المستعمرات إلى V8 أو أجار الجزرة للتخزين. المستعمرات اختبار على أجار تشابيك لدوكس (سلالات أحمق، لن تنمو في دوكس تشابيك) وعلى المساعد الشخصي الرقمي مع كلورات (0.5 M كلورات البوتاسيوم، وسلالات + الصأبة لن تنمو على المساعد الشخصي الرقمي مع كلورات) لتأكيد النمط الظاهري الصحيح. فحص هذه المستعمرات لالصفات المطلوبة. </li></ol> 4. ممثل النتائج إنتاج perithecia الهدف هو الحصول على حشيش<html> perithecia دون أي فطر أو جراثيم واضح. وعلى سطح الثقافة تظهر مشابهة المخمل الأسود (الشكل 1). في 24 ساعة بعد تطبيق توين ينبغي على سطح أجار لها معان طفيف. إذا فطر ظهور مرة أخرى، ثم قد لا لوحة تم كشط ما يكفي للحث على تطوير مزقاق. بوغ زقي التفريغ تقدم دائما في فحص الخاص بك كتل من أجار من سلالة من النوع البري. إذا كان هؤلاء لا النار، ثم إما perithecia الخاص صغار جدا أو قديمة جدا. إذا كانت قديمة جدا، وبعد ذلك سوف تظهر خيوط عديدة على سطح الثقافة ويعطيها صبغة بيضاء. إذا لم تكن هذه هي الحالة، قد تكون صغيرة جدا، ويجب ان يحاكم الفحص مرة أخرى بعد 24 ساعة. في بعض الأحيان، والثقافات لا أداء جيدا، وهذه التجربة لا بد من تكرارها. تأكد من إجراء فحص تحت ظروف الإضاءة المناسبة. المؤتلف ذرية وينبغي&gt; perithecia المؤتلف يشكلون الغالبية من perithecia على طول التقاطع بين سلالتين. نقوم بمعالجة عادة 10 cirrhi من كرة عرضية، وعلى الأقل 4-6 من هؤلاء ينبغي أن يكون المؤتلف. أحيانا جدا، طفرة يمنع سلالة من التزاوج. إذا كان أحد الوالدين لديه النمط الظاهري نمو شاذ، ثم قد يكون أكثر من 2 الظواهر تكون موجودة بين المستعمرات في MMTS. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> الشكل 1. مراحل تطور مزقاق على أجار الجزرة. اليسار، بعد 72 ساعة من تطبيق توين. لاحظ الصباغ الأحمر وperithecia الصغار جدا مرئيا كمحرك الحبوب السوداء على السطح. الحق، في ح 144، وقد شكلت perithecia ناضجة. لاحظ غياب شبه الكامل للفطر سطحي في كل الثقافات. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> مقايسة شخصية إبراء الذمة 2. وأجار الجزر البرتقالي المكونات هو المنحى حتى ثايمكن للجراثيم تي خرجوا قسرا من perithecia ناضجة على سطحه تتراكم على سطح شريحة زجاجية. 15 دوام تراكم الموارد البشرية. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> الشكل 3. الاختلافات في النمو بين + الصأبة وأحمق، المستعمرات في المتوسط ​​MMTS انتقائي. المستعمرات أحمق-(السهام) هي أصغر. و+ المستعمرات الصأبة (الأسهم) تظهر نموا قويا. صورة التقطت بعد 7 أيام.

<ol>
	<li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae.">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li><li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Researches on Fungi. , (1909).</li><li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid1,+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel,+affects+growth,+development,+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae.">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li><li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization.">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li><li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -. H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -. W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+(MAT)+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae.">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li><li>Gueldener, U., Seong, K. -. Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -. R., Adam, G., Mewes, H. -. W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta.">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li><li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li><li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -. H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum),+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins.">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li><li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -. W., Yun, S. -. H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes:+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae.">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li><li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+(Gibberella+fujikuoi.">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li><li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -. C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene,+ROA,+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae.">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li><li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum).">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li><li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+cannons:+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota.">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li><li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perithecial+development+by+Gibberella+zeae:+a+light+microscopy+study.">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li><li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+(anamorph+Fusarium+graminearum.">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وبشكل خاص تكييف F. graminearum لدراسة تطوير هيئة الاثمار نظرا لتوافر من الجينوم جيدا المشروح ( <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> ، 4)، وتوافر وجود Affymetrix- استنادا ميكروأري 6. وقد سهلت هذه القدرة على التعرف على الجينات مهمة لتصريف بوغ زقي 7،11،3. والأساليب المقدمة هنا تسمح للباحث أن تركز على مجموعة منفصلة من مراحل النمو والوظائف من أجل التحليل الجيني الهيئات الاثمار من ف. graminearum. الطرق هي أيضا قابلة للتكيف بسهولة على الفطريات ذات الصلة التي يمكن أن يتسبب في الفاكهة في الثقافة، ويمكن استخدامها كمعيار للتنمية في مجموعة متنوعة من غيرها من أنواع الفطريات الجسم الاثمار. يمكن أن القدرة على تقييم النمط الظاهري اطلاق بوغ يكون دقيقا في الأنواع حيث جراثيم صغيرة والصعب أن نرى، مثل <eم&gt; ف. graminearum. مجموعة من الجراثيم على شريحة نظيفة يسهل على حد سواء تقييم البصرية، والتقييم الكمي، كما يمكن غسلها الجراثيم خارج الشريحة وquantitated. بعض الأنواع الفطرية انتاج الصمغ الذي يحيط بهم بوغ، ولا يمكن للجراثيم أن تشطف الخروج، ولكن يجب أن تحسب مجهريا كما أنها لا تزال على الشريحة. لقد وجدنا أن هذا صحيح من sclerotiorum الصليباء.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> فيوزاريوم graminearum سلالة PH-1 </td><td> علم الوراثة الفطرية سهم المركز، كانساس </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> توين 60 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> تشابيك للآجار دوكس </td><td> Difco، بيكتون ديكنسون </td><td> 233810 </td></tr><tr><td> كلورات البوتاسيوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

sexual development and ascospore discharge in fusarium graminearum

لقد أصبح الفيوزاريوم graminearum نظام نموذجي للدراسات في التنمية وتسببها الفطريات الخيطية. F. graminearum معظم بسهولة وتنتج الهيئات الاثمار، ودعا perithecia، على أجار الجزرة. Perithecia تحتوي على العديد من أنواع الأنسجة، أنتج في مراحل معينة من تطور مزقاق. وتشمل هذه (بالترتيب من مظهر) تشكيل بالاحرف الاولى مزقاق (والتي تؤدي إلى خيوط ascogenous)، الجدار الخارجي، paraphyses (فطر العقيمة التي تحتل المركز من مزقاق حتى زقاق تطوير)، زقاق، وascospores لل في زقاق 14. يتم فصل التنمية في كل من هذه الأنسجة من قبل ما يقرب من 24 ساعة، وكانت أساس الدراسات transcriptomic خلال التطور الجنسي 12،8. الرجوع إلى هولن وآخرون (2007) للحصول على وصف أكثر دقة للتنمية، بما في ذلك الصور الفوتوغرافية من كل مرحلة. هنا، نقدم وسائل لتوليد وحصاد متزامنلاي من المروج النامية perithecia للدراسات الزماني للتنظيم الجينات، والتنمية، والعمليات الفيزيولوجية. على الرغم من أن تتم كتابة هذه الأساليب على وجه التحديد لاستخدامها مع ف. graminearum، يمكن استخدام التقنيات لمجموعة متنوعة من الفطريات الأخرى، بشرط أن يكون ذلك حافزا الاثمار في الثقافة، وهناك بعض التزامن في التنمية. تكيفنا مؤخرا هذا البروتوكول لدراسة التطور الجنسي من ف. verticillioides. على الرغم من أن يجب أن تكون فردية perithecia منتقاة في هذا النوع، لأنه لم يكن في الحديقة تطوير perithecia أن يتسبب فيها، وعملت العملية بشكل جيد لدراسة التنمية (Sikhakolli وتريل، غير منشورة). أهم وظيفة من الهيئات الاثمار الفطرية هو تشتت جراثيم. في كثير من الأنواع من Ascomycota (زق انتاج الفطريات)، وأطلقوا النار جراثيم من زق، ويرجع ذلك إلى توليد ضغط تورم في زق، والقيادة طرد من الجراثيم (وسائل epiplasmic) من خلالالمسام في الطرف زق 2،7. وقد أسفرت نتائج الدراسات لدينا التفريغ بوغ زقي القسري في وضع &quot;فحص التفريغ بوغ&quot;، والتي نستخدمها للكشف عن الطفرات في هذه العملية. هنا نقدم تفاصيل هذا الفحص. واو graminearum هو homothallic، وبالتالي يمكن أن تشكل الهيئات الاثمار في ظل عدم وجود شريك ملائم. ميزة تماشر هو أن المعبر ليس من الضروري لتوليد ذرية متماثلة اللواقح عن سمة خاصة، وجها التي يسرت دراسة التطور الجنسي في هذه الأنواع 14،7. ومع ذلك، فقد تم توليد سلالات heterothallic التي يمكن استخدامها لعبور 5،9. ومن الممكن أيضا لعبور سلالات homothallic للحصول على المسوخ للجينات عدة في سلالة واحدة 1. يتم ذلك عن طريق coinoculating 1 طبق بيتري مع 2 السلالات. على طول نقطة لقاء، فإن الغالبية العظمى من perithecia يكون المؤتلف (شريطة طفرة في واحدة من سلالات الأم لا تمنعالتهجين). كما سن perithecia، فإنها تحلب ascospores بشكل جماعي بدلا من تفريغ قسرا. والافرازات الناتجة بوغ (تسمى cirrhus) يجلس على طرف مزقاق ويمكن بسهولة إزالة للتعافي من جراثيم الفردية. هنا نقدم بروتوكول لتسهيل التعرف على المؤتلف perithecia واسترداد ذرية المؤتلف.

Watch this Scientific Journal Video about Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum at JoVE.com

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

الصلبان الجنسي والعزلة من ذرية المؤتلف هي أدوات هامة لبحث الفطريات الخيطية،<em&gt; فيوزاريوم graminearum</em&gt;، والتقنيات اللازمة ينفذ بنجاح وتقدم هذه العمليات.

الجنسي للتنمية والتفريغ في بوغ زقي فيوزاريوم graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

sexual-development-and-ascospore-discharge-in-fusarium-graminearum

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

21.8K Views.  Michigan State University. الصلبان الجنسي والعزلة من ذرية المؤتلف هي أدوات هامة لبحث الفطريات الخيطية، فيوزاريوم graminearum، والتقنيات اللازمة ينفذ بنجاح وتقدم هذه العمليات.

Video: Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

بوغ زقي zeae Gibberella الإنتاج والتحصيل للتجارب ميكروأري.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

في التصوير Bioluminescent المجراة من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

التعريفي واستخراج السم من البروتين فيوزاريوم النيابة. الثقافات للدراسات البروتين

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

تقييم التنمية وظيفة الغدة الثديية في نماذج الماوس

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

الحمض النووي RNA-مجتمعة نيون<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين (FISH) لدراسة كروموسوم X التعطيل في المتباينة أنثى الفأر الخلايا الجذعية الجنينية

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...