Name: rna isolation from mouse pancreas: a ribonuclease-rich tissue
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue at JoVE.com

نشكر جيان هوا لينغ، ريموند ماكدونالد، جالفين سويفت، ميشيل غريفين، بول Grippo وساتيانارايانا Rachagani الخاصة بهم مفيدة تعليقات واقتراحات وتبادل بروتوكولاتها. وأيد هذا العمل من قبل U01CA111294 منحة وجائزة تنمية فكرة من برنامج بحوث جماعية جامعة ولاية أوهايو.

1. إعداد الممارسات التالية الالتزام بالسياسات التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسة ل(IACUC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المستحسن لعزل ما لا يزيد عن 6 البنكرياس الماوس في أي يوم من الأيام. لديك كل الأدوات الجراحية نظيفة وتعقيمها، مجموعة واحدة لكل حيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية كل أنابيب microcentrifuge. أربعة أنابيب 2 مل لكل حيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 8 مل من تحلل كاشف في 50 مل أنابيب الطرد المركزي على الجليد. ملاحظة: على الرغم من أن عدة تنقية يأتي مع ثيوسيانات الجوانيدين الفينول كاشف التي هي مناسبة لعزل البنكرياس، ويستخدم كاشف تحلل بسبب كميات كبيرة والتي هي ضرورية في العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 10 مل من الحلول التالية في 15 مل أنابيب الطرد المركزي لتنظيف ريش الخالط لل. الإيثانول، 70٪ (2 أنابيب)، HPLC المياه الصف (1 أنبوب) وهبلك الصف المياه التي تحتوي على ما يقرب من 200 ميكرولتر من ريبونوكلياز بعيدا أو ما يعادلها ريبونوكلياز inactivator. </li></oل&gt; 2. جراحة، تشريح البنكرياس والتجانس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1-2 مل من isoflurane وإلى جرة تحتوي على شاش القطن أو المناشف الورقية. يتم وضع الفئران على منصة يمنعهم من الوصول إلى مصدر isoflurane و. إضافة جديدة لisoflurane والجرة قبل التخدير لكل الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس بلطف في جرة تحتوي على isoflurane و. سقف الجرة ورصد آثار التخدير عن طريق تناوب بلطف الجرة ذهابا وإيابا. يتم تخدير الحيوان مرة واحدة هو في غير قادر على الوقوف في &#39;الخاصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على تأكيد من التخدير، وإزالة الحيوان من الجرة وتطبيق قرصة أخمص القدمين الشركة. إذا لا تتفاعل الماوس إلى قرصة أخمص القدمين، انتقل إلى الخطوة 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا يتفاعل الماوس إلى قرصة أخمص القدمين، ثم كرر الخطوات من 2،2-2،3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان تخدير على أعلى مقاعد البدلاء في وضعية الانبطاح. خلخل عنق الرحم الماوس، عن طريق وضع بإحكام اليد اليسرى على عنق الرحم الفأر. لناجي اليد اليمنى فهم ذيل الماوس، وبسرعة سحب صعودا في حوالي بزاوية 45 درجة الى خلخل عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين الذبيحة على سطح (قطعة من الستايروفوم مستوى مغطاة المناشف الورقية) من خلال ثقب كل أربعة الكفوف الحيوان في سطح مستو باستخدام قياس 25 إبر الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأدوات الجراحية المعقمة، وقطع القسم الوسطي من الفأرة مفتوحة وبسرعة إزالة البنكرياس من الماوس. استخدام ملقط لعقد البنكرياس وقطع عليه من الطحال والأمعاء الدقيقة باستخدام مقص الربيع. يجب الحرص على عدم تمتد البنكرياس خلال إزالة من الماوس. تعطيل الأنسجة قد يفرج عن ريبونوكلياز. ملاحظة: إن الوقت الذي يستغرقه لإزالة البنكرياس من الماوس أمر بالغ الأهمية. وينبغي أن يكون الشخص قادرا على المهرة تشريح البنكرياس في حوالي 1 دقيقة أو أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البنكرياس بأكمله في أنبوب 50 مل تحتوي على 8 مل من الجليد الباردة كاشف تحلل. غطاء الأنبوب لفترة وجيزة يهز لتزج منظمة الشفافية الدوليةssue في كاشف والمضي قدما إلى الخطوة التالية دون تأخير. نسبة تحلل الأنسجة كاشف لأمر بالغ الأهمية. راجع قسم نتائج مقارنة لسلامة الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام كميات مختلفة من تحلل كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس لمدة 5 ثوانى. فمن المهم للضغط على شفرات الخالط إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي للسماح للأنسجة ليتم سحبها في شفرات لتجانس كفاءة. </li></ol> 3. إزالة الأنسجة غير المهضومة ملاحظة: بعد التجانس، وقطع صغيرة من الأنسجة البقاء في كاشف تحلل. هو أكثر أهمية لليز بسرعة الأنسجة ترك بعض الأنسجة عسر الهضم بدلا من أكثر من المجانسة وتدهور خطر الحمض النووي الريبي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 2 مل من كاشف تحلل تحتوي على البنكرياس هي lysed إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل. جمع اثنين من أنابيب microcentrifuge جناسة في العزلة. تجاهل جناسة المتبقية أو تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة الدراسات المستقبلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سنتrifuge في 4 درجات مئوية، 12،000 × ز لمدة 5 دقائق لبيليه الأنسجة عسر الهضم. هذا هو خطوة حاسمة كما المرحل من الأنسجة غير مهضوم إلى حلول لاحقة من الحمض النووي الريبي من المرجح أن تلوث العينة مع ريبونوكلياز (الخطوة 5.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 مل من طاف في أنبوب microcentrifuge 2 مل. المضي قدما في عزلة فورا وتخزين أنبوب تكرار في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. وضع جميع الأنابيب التي تحتوي على جناسة على الجليد الرطب في حين الشروع في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من المتبقي تحلل كاشف إلى وعاء النفايات الكيميائية المناسبة. </li></ol> 4 تنظيف من ريش الخالط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الانتقال إلى العزلة المقبل، وتنظيف ريش الخالط عن طريق وضعها في 10 مل من الايثانول 70٪. تفعيل الخالط لمدة 20 ثانية لإزالة أي قطع من الأنسجة التي يمكن اصطيادها في ريش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض 200 ميكرولتر الماصة لإزالة أي القطع التي تبقى في ريش الخالط. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.1 في الماء، العام ريبونوكلياز inactivator والايثانول 70٪. تجفيف رمح الخالط مع كيم يمسح نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.1 لعزل البنكرياس من الحيوانات المتبقية، وحفظ الحمض النووي الريبي معزولة عن كل حيوان منفصلة بدلا من تجميع الحمض النووي الريبي. </li></ol> 5. عزل الحمض النووي الريبي المقطع التالي هو مطابق لبروتوكول طقم تنقية. الاستفادة من عدة تنقية هو أنه سوف عزل الحمض النووي الريبي مجموع بما في ذلك الرنا الصغيرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام الحل جناسة المجمدة، وذوبان الجليد على الجليد الرطب واسمحوا الوقوف على RT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم، وكأب أنبوب ويهز بقوة باليد لمدة 15 ثانية. السماح للأنبوب الوقوف على RT لمدة 2-3 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12،000 x ج، 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبقة المائية العليا في أنبوب microcentrifuge. إضافة 1.5 حجم الأيزوبروبانول ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ما يصل الى 700 ميكرولتر من العينة في عمود الدوران التي يتم وضعها في أنبوب جمع 2 مل. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 15 ثانية في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5،5-5،6، وذلك باستخدام ما تبقى من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر العازلة RWT إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 500 ميكرولتر العازلة RPE في العمود تدور. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8000 x ج لغسل العمود. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 8،000 x ج لتجف العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عمود الدوران إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. الماصة 80 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه مباشرة على غشاء عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 8،000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع في حل الحمض النووي الريبي. تخزين في -80 درجة مئوية أو الشروع في 5.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من صحة سلامة الحمض النووي الريبي، وحساب لأول مرة بغية دراسته واقراره الحمض النووي الريبيntration و260/280 نسبة استخدام الطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع جزء من الحل RNA إلى ما يقرب من 500 نانوغرام / ميكرولتر مع البيولوجيا الجزيئية المياه الصف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد النزاهة الحمض النووي الريبي (أي رين) باستخدام التحليل الكهربائي الشعري. حوالي 5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الريبي كافية للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة الحل الحمض النووي الريبي (انظر الشكل 2) وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).</li><li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease.">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li><li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas.">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li><li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum.">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li><li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases.">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li><li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas.">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA A Laboratory Manual. , (2011).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة التي يتم ريبونوكلياز الغنية يمثل تحديا كبيرا للتجارب البيولوجيا الجزيئية. والمتاحة تجاريا التي تستند الكواشف المختلفة ومجموعات في المقام الأول على طريقة الفينول الجوانيدين ثيوسيانات من استخراج الحمض النووي الريبي. الجوانيدين ثيوسيانات يبدل طبيعة البروتين وبالتالي يقلل من نشاط ريبونوكلياز. ومع ذلك، فإن ضخامة ريبونوكلياز في البنكرياس يتطلب تعديلات إضافية على البروتوكولات القياسية للعزل الحمض النووي الريبي. وتفيد التقارير بروتوكول هنا أن يتم على أساس معيار طريقة الجوانيدين ثيوسيانات بعد يحتوي على العديد من التعديلات الحرجة فضلا عن نصائح لعزل ناجحة من الحمض النووي الريبي من الأنسجة الغنية ريبونوكلياز مثل البنكرياس. وتجدر الإشارة إلى المبادئ التوجيهية القياسية لعزل الحمض النووي الريبي. هذه التقنيات هي حاسمة لنجاح العزلة من الحمض النووي الريبي، وحتى من العينات التي هي أقل ريبونوكلياز غنية من البنكرياس. وتشمل بعض الأمثلة باستخدام البيولوجيا الجزيئية الصف واثالثا، والمواد الاستهلاكية خالية من ريبونوكلياز والأدوات البلاستيكية بدلا من الزجاج. فمن المستحسن لتغيير القفازات بين كل العزلة. للشخص الذي هو عديم الخبرة مع عزل الحمض النووي الريبي، فمن المستحسن أنها اكتساب الخبرة مع عزل الحمض النووي الريبي من عينات ريبونوكلياز فقيرة مثل الكبد أو من الثقافات الخلية قبل الشروع في العمل الذي يتطلب عزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس. بروتوكولات ممتازة موجودة والتي توفر مجموعة متنوعة من النقاط للعمل بنجاح مع الحمض النووي الريبي 8. يتم الإبلاغ عن العديد من العوامل الهامة لعزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية من الماوس البنكرياس هنا. وتشمل هذه حجم كاشف تحلل المستخدمة خلال التجانس وإدراج المانع ريبونوكلياز إلى الحل الحمض النووي الريبي. طريقة بما في ذلك المانع ريبونوكلياز يعمل بشكل جيد، ولكن سوف تتكرر دورات تجميد ذوبان الجليد في نهاية المطاف خفض رين، على الأرجح بسبب تغيير طبيعة المانع ريبونوكلياز. تجدر الإشارة إلى أن جميع الحلول RNA يوااا في هذه الدراسة من خلال واحدة ذهب ذوبان التجميد قبل تحديد رين. طريقة أخرى للحد من تدهور على ذوبان الجليد تجميد لتخزين الحل الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية في شكل عجلت 2. هذا يقدم بعض المضايقات وهي إزالة الإيثانول وإعادة تذويب بيليه قبل باستخدام الحمض النووي الريبي. بالمقارنة مع الفينول / جوانيداين بروتوكولات ثيوسيانات كاشف 2، ذكرت مزايا البروتوكول هنا هو البساطة في العمل مع كاشف تحلل وعدة تنقية التي لا تتطلب إعداد الحلول المتخصصة ومخازن. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح لعزل الرنا صغيرة من الماوس البنكرياس. وتشمل النصائح الإضافية سرعة تشريح البنكرياس وطريقة التخدير قبل القتل الرحيم (ويفضل isoflurane والاستنشاق إلى CO 2 الاختناق). ينصح العديد من المحاولات في ممارسة الجراحة البنكرياس قبل توقع quali تي عاليةتاي الحمض النووي الريبي. وينبغي أن يكون التكيف من هذا البروتوكول إلى الأنسجة ريبونوكلياز الغنية مثل الطحال أو الرئتين يمكن تحقيقه بسهولة.

مطلوب عزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية للروتين تجارب البيولوجيا الجزيئية مثل شمال النشاف 9، QRT-PCR 1 أو التعبير الجيني التنميط 5. وتستند معظم الطرق المعاصرة لعزل الحمض النووي الريبي على إدخال تعديلات على البروتوكولات ثيوسيانات الجوانيدين 2، 3. الجوانيدين ثيوسيانات هو ممسخ بروتين قوي وفعال وتعطيل نشاط ريبونوكلياز في معظم الظروف. طريقة شعبية من Chomczynski وساكي 3 مجتمعة الفينول في حل الجوانيدين ثيوسيانات تحلل، مما يقلل من الوقت العزلة إلى حوالي 4 ساعة. وتقوم العديد من الكواشف المتاحة تجاريا استخراج الحمض النووي الريبي على Chomczynski وطريقة ساكي 3. الأنسجة الغنية ريبونوكلياز مثل الإنسان أو الماوس البنكرياس يمثل تحديا إضافيا لعزل الحمض النووي الريبي. قد تحتوي الماوس البنكرياس تصل إلى 75 ملغ من ريبونوكلياز 6 سيصدر بعضها الزيتوز تعطيل الأنسجة البنكرياس مما يؤدي إلى انحلال ذاتي الأنسجة. وقد استخدمت التعديلات على البروتوكولات الجوانيدين ثيوسيانات بنجاح لعزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس مع سلامة عالية 2، 4، 7، 10. التسريب من الحمض النووي الريبي لتحقيق الاستقرار في الماوس كاشف البنكرياس العزلة سهلت من الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية 4، 7، 10، ولكن ضخ الحلول في البنكرياس يتطلب مهارة كبيرة، قد تتطلب أدوات متخصصة مثل مجهر تشريح وتعطيل العمارة الأنسجة أثناء إجراء قد يؤدي إلى تحلل الخلايا. Perfusing الأنسجة مع تثبيت الحمض النووي الريبي كاشف قد تتداخل مع غيرها من التطبيقات بما في ذلك عزل البروتين وتلطيخ النسيجية. علاوة على ذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لعزل الحمض النووي الريبي من البنكرياس الإنسان. بروتوكولات أخرى تتطلب إعداد حلول محددة من قبل المحقق 2. نفيدكم بروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي مع سلامة عالية من الماوس البنكرياس. اليستخدم بروتوكول البريد عناصر الأساليب المنشورة سابقا، ويستند إلى حد كبير على الفينول / جوانيداين تحلل بروتوكولات كاشف القائم على ثيوسيانات القياسية. أنها لا تتطلب إعداد الحلول المتخصصة كما أنها لا تتطلب ضخ الكواشف في البنكرياس. وتشمل الخطوات الحاسمة لنجاح عزل الحمض النووي الريبي عالية الفينول / القائم جوانيداين تحلل كاشف إلى نسبة الأنسجة، وإزالة الأنسجة غير مهضوم قبل مرحلة الانفصال وإدراج المانع ريبونوكلياز إلى حل RNA الناتجة عن ذلك. باستخدام هذه التعديلات وغيرها، ونحن عادة عزل الحمض النووي الريبي مع رين أكبر من 7 لاستخدامها في تحليل التعبير الجيني الروتينية.

<table><tbody><tr><td>Power Gen 500&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-03&amp;nbsp;</td><td>Homogenizer</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Refrigerated microcentifuge</td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Lysis reagent</td></tr><tr><td>Student Vannas spring scissors</td><td>Fisher</td><td>91500-09&amp;nbsp;</td><td>Use to cut pancreas from attached tissues</td></tr><tr><td>Surgical scissors, 6 inch</td><td>Fisher</td><td>08-951-20</td><td>Use to cut scin of mouse</td></tr><tr><td>Blunt end forceps</td><td>Fisher</td><td>1381239</td><td>Use to hold pancreas while dissecting</td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Anesthetic</td></tr><tr><td>Rnase out (40 U/&amp;micro;l)</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhbitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>General Rnase inactivator</td></tr><tr><td>HPLC grade water</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td>For washing homogenizer blades</td></tr><tr><td>Molecular biology grade water</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>Elution of RNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Purification Kit</td></tr><tr><td>2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free</td><td>USA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>For cleaning homogenizer blades</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td></td><td>RNA Stabilization Reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy&amp;nbsp;spin columns&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Spin columns&amp;nbsp;as a part of the miRNeasy Mini kit</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Chales River</td><td>Strain C57BL/6</td><td>Their age ranged from 4 to 12 months.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mice&amp;nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>strain 129</td><td>Their age ranged from 4 to 12 months.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

rna isolation from mouse pancreas: a ribonuclease-rich tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

مجموع العائد الحمض النووي الريبي من 1 مل من تحلل جناسة هو 20-40 ميكروغرام. OD 260/280 نسب هي عادة حوالي 2.0 ورين أكبر باستمرار من 7.0. إذا كان رين و≤ 6، سيتعين على العزلة أن تتكرر. في بعض الأحيان، وحقق رين الذي هو أعلى من 8.0. طريقتين الأكثر استخداما القتل الرحيم الفئران قبل إزالة البنكرياس هي CO 2 الاختناق أو استنشاق isoflurane و. ويتبع كل من التقنيات من قبل خلع عنق الرحم. نظرا لأنه من الممكن أن يكون وكيل و / أو إجراء الكيميائية الوقت قد تؤثر على سلامة الحمض النووي الريبي، ورين من الماوس الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام البنكرياس ومقارنة كل من التقنيات. تم تخدير الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 الاختناق أو استنشاق isoflurane و؛ وأعقب كل التقنيات من قبل خلع عنق الرحم. كان وقت التخدير الحيوانات قبل خلع عنق الرحم حوالي 1-2 دقائق أطول لCO 2 الخنق مقارنة isoflurane. الحمض النووي الريبي معزولة التالية استنشاق isoflurane وأنتجت رين 7.5 ± 0.31 مقارنة رين من 2.2 ± 0.3 (ع &lt;10 -4، يعني ± SD، ثلاث نسخ العزلة) لCO 2 الاختناق. طريقة القتل الرحيم لديها تأثير كبير على سلامة الحمض النووي الريبي ويفضل أسلوب استنشاق isoflurane وإلى CO 2 الاختناق. وتمت مقارنة على سلامة الحمض النووي الريبي معزولة عن بنكرياس الفأر التي تم المتجانس في 2 و 4 و 8 مل من تحلل كاشف. افترضنا أن زيادة حجم تحلل كاشف سيؤدي إلى درجة أكبر من ريبونوكلياز التعطيل. بخلاف حجم تحلل الكاشف، كانت كل ظروف مماثلة لتلك الواردة في البروتوكول. كان هناك علاقة مباشرة بين حجم كاشف تحلل المستخدمة في تجانس ووحدة الحمض النووي الريبي (الشكل 1). ورين من الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام 2 و 4 و 8 مل من تحلل كاشف كان 4.2، 6.5 و 7.4 على التوالي (يعني ثلاث نسخ هيolations). لذا 8 مل من تحلل كاشف ينبغي أن تستخدم في هذا البروتوكول. بالنسبة لبعض التجارب، فإنه قد يكون من الضروري جمع كل من الحمض النووي الريبي والبروتينات من نفس البنكرياس. على سبيل المثال، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي لQRT-PCR ويمكن تصور البروتين باستخدام المناعية. إذا كان هذا هو الحال، فمن المستحسن لخفض البنكرياس في النصف من الرأس إلى الذيل. هذا أمر مهم لأن البنكرياس يختلف تشريحيا من الرأس إلى الذيل. لإثبات إن وجدت اختلافات في الحمض النووي الريبي سلامة القائم بين الحمض النووي الريبي معزولة عن إما نصف البنكرياس، تم إجراء التجربة التالية. تم عزل الحمض النووي الريبي من النصف الأول من البنكرياس. تحديد رين من هذا الحمض النووي الريبي ومقارنة بما كان عليه من الحمض النووي الريبي معزولة عن النصف الثاني من البنكرياس بعد أن جلس على RT لمدة 30 ثانية خلال workup من الشوط الأول. كان رين في النصف الأولي من البنكرياس 7.4 ± 0.20 مقارنة رين من 6.9 ± 0.55 للنصف اللاحقة. في حين خفض البنكرياس فيلا يبدو بهذه الطريقة لاطلاق سراح ريبونوكلياز وهضم الحمض النووي الريبي، إذا البنكرياس هو أن تكون مقطوع، فمن المستحسن استخدام النصف الأول لتحليل الحمض النووي الريبي والنصف الثاني للبروتين. تحلل كاشف يعطل بنية البروتين وبالتالي يقلل من نشاط ريبونوكلياز. ويرجع ذلك إلى كمية كبيرة من ريبونوكلياز التي موجود في البنكرياس، فمن الممكن أن بعض ريبونوكلياز نشطة يبقى في جناسة تحلل وسوف تتوازن هذه ريبونوكلياز إلى المرحلة المائية. فإن أي ريبونوكلياز أن يبقى في حل RNA مشاركة تعيق النزاهة. للتغلب على هذا، واضاف نحن المانع ريبونوكلياز إلى محلول مائي من الحمض النووي الريبي. ومقارنة سلامة الحمض النووي الريبي من حل RNA التي تحتوي على ريبونوكلياز المانع لأحد أن لم يفعل ذلك. على واحدة ذوبان التجميد، كان رين من أجل حل RNA مع مثبط 7.3 ± 0.15 مقارنة مع 2.9 ± 0.65 (الشكل 2، ص &lt;0.001، يعني ± SD، ثلاث نسخ العزلة) لالحل الذي لم يتضمن المانع. مسألة أخرى هي احتمال أن تتكرر سوف تجميد ذوبان تفسد ريبونوكلياز المانع جعلها غير فعالة. لدراسة هذا الاحتمال، وهو حل من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ريبونوكلياز المانع جمد مرارا وإذابة. الحلول الحمض النووي الريبي التي تم تجميدها وإذابة تصل إلى 5 مرات تزال تنتج ورين من 7 أو أعلى بينما أنتجت تلك الحلول التي تم تجميدها وإذابة 6 مرات أو أعلى رين أقل من 7 (الشكل 2). فمن المستحسن أن قسامة الحل الحمض النووي الريبي قبل التجميد والحد من عدد دورات ذوبان التجميد. للتدليل على فائدة هذه الطريقة، أجرينا QRT-PCR على الحمض النووي الريبي معزولة. كان متوسط ​​رين من العزلة RNA ثلاث نسخ 7.4 ± 0.20 (يعني ± SD). تم تصنيعه [كدنا] معبي عشوائية من الحمض النووي الريبي وتم قياس التعبير عن ثلاثة جينات التدبير المنزلي عن طريق QPCR باستخدام تقنيات القياسية. البيانات هو مبين في الشكل (3) بالتحقق من صحةقدرتنا على استخدام الماوس بنجاح RNA البنكرياس في تقنية البيولوجيا الجزيئية القياسية. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51779/51779fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. عالية تحلل كاشف إلى نسبة الأنسجة ويحسن سلامة الحمض النووي الريبي. وسلامة الحمض النووي الريبي معزولة عن بنكرياس الفأر الذي كان المتجانس في 2 (A، D)، 4 (B، E) أو 8 (C، F) مل من تحلل كاشف كان مقارنة. بخلاف حجم تحلل الكاشف، كانت كل ظروف مماثلة لتلك التي في موضح في البروتوكول في هذه الوثيقة. وهناك علاقة مباشرة بين حجم تحلل كاشف المستخدمة في التجانس والحمض النووي الريبي النزاهة. (G) متوسط ​​± SD، العزلة ثلاث نسخ. ع &lt;0.05، ** ع &lt;0.001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51779/51779fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر</a>من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51779/51779fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. يتحلل الحمض النووي الريبي في نهاية المطاف على تكرار ذوبان التجميد. الحمض النووي الريبي معزولة عن الماوس البنكرياس جمد مرارا وإذابة في وجود أو عدم وجود المانع ريبونوكلياز (ريبونوكلياز الأول). يعني ± SEM، ** ع &lt;0.001. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51779/51779fig3highres.jpg" width="300" /> الرقم 3. QRT-PCR RNA من الماوس البنكرياس. تم عزل الحمض النووي الريبي من ثلاثة البنكرياس الماوس باستخدام بروتوكول الأمثل. تم تحديد التعبير عن 18S الرنا الريباسي، β-2 المكروغلوبولين وsnoRNA251 باستخدام QRT-PCR (متوسط ​​± SD).

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue at JoVE.com

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

rna-isolation-from-mouse-pancreas-a-ribonuclease-rich-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

27.5K Views.  The Ohio State University. We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Video: RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Murine Pancreatic Islet Isolation

Hi, I am Greg Zott. I'm with the UCSF Diabetes Center in the Bluestone Laboratory, and today I'm gonna show you the process for isolating mouse eyelets. The procedure involves the injection of a collagenase solution into the pancreas of a C3 H donor mouse, where we will then remove that pancreas, digest it away, purify the eyelets on a fial gradient, and then handpick them for ultimate transplant into the kidney capsule of a diabetic NOD mouse, Which will be our recipient.Before we start this procedure, we diluted our ATE solution in a modified Hanks buffer and we have adjusted the concentration specific for the strain of mouse that we're using the C3 H.We found digests better at a 0.8 mgs per mil collagenase solution, and we will use that to inject into the common bile duct to distend the pancreas.Performing. The procedure today Will be Pavo codre of the diabetes center. He will inject, open up the mouse, expose the the intestines, and then inject into the common bile duct.We will spray down the mouse with ethanol to keep the hair down, and then we will also verify that the mouse has been sacrificed properly with a toe pinch. Pavo will now open up the mouse and exposing the intestine and the pancreas with a midline incision. The diaphragm will also be cut to verify that the mouse will be sacrificed.Before we get started, I'd like to point out some of the important structures. The stomach is lying right here with the pancreas attached underneath into the duodenum and above. This is the liver where we'll find the gallbladder and the common bile duct, which you can see right here.So what Pavo will do next is he will isolate the small intestine, find where the common bile duct enters the small intestine. Once the intestine is exposed, we clamp on either side of the common bile duct with mosquito clamps. We find that this allows more collagenates to enter the pancreas while other groups try to direct the clamp on top of the common bile duct.We find that this is a better technique in allowing enzyme to enter the pancreas. This is a gentle procedure. You don't want to tear the bowel.You wanna allow the clamps to lie gently on either side of the common bile duct. Now we will find a gallbladder, and once the gallbladder's exposed, we will use that as a guide to injecting the collagenase into the common bile duct. Powell's using a 30 gauge needle with a five cc syringe containing three mills of collagenase solution.As he's entering the common bile duct, he's distending that duct with collagenase solution and then he travels down the common bile duct till he reaches near the intestine. And as he's going down, the enzyme solutions being pumped into the injected into the pancreas. Now that the pancreas is inflated with collagenase solution, Powell's gonna remove the hemostats and then remove the pancreas from the the mouse carefully tearing it away from the intestine.He removes it from the stomach. Okay, and then using the spleen as a handle, he lifts up the pancreas and then slowly snips it away in the common bile duct, and that's it. Pancreas is laid out and then the spleen is removed, and there he's removing the meso enteric tissue, and then the pancreas is placed in a two mill collagenase solution and a sterilized glass vial and it's placed back on Ice.The isolated pancreas that we put into the glass vials will now be placed into a 37 degree water bath for approximately 17 minutes. We placed them into a 50 mil conical rack so that they don't float up. Once during the bath, the timer starts and the digestion begins.Once the digestion time is completed, vials are removed, and then they are shaken and disrupted gently. And once the tissue starts falling apart, the vial is then placed on ice. A sterile screen is placed over a 400 mil beaker that contains washing buffer.The pancreas digest is then carefully poured over the screen into the wash buffer. For demonstration purposes, the hood has been turned off and the glass of the hood has been raised so we could see what we're doing. Once the pancreas digest is poured into the beaker, the vials are rinsed with the same washing buffer and the wash buffer placed over the screen.We have a syringe filled with washing buffer. We will use that to forcefully wash the tissue through the screen. The idea is to release any loose eyelets that are unattached to the matrix, but leaving the membranes and the undigested tissue on the screen.And when you're finished washing a tissue, this is what you usually See at the end of the procedure. The Pancreas tissue that's in the bottom of the tube will now be transferred to two 50 mil conical, and the tissue will be washed, the tissue's mixed evenly, and then distributed evenly so that we have a equal pellet volume in each tube. The beaker is now rinsed with more washing buffer.The sides are rinse so that you get all tissue that is entered the beaker again. Then it's equally distributed between each two, both 50 mil. Conical then are topped off with wash buffer.The tissue is inverted several times and then placed into a centrifuge. This is a quick spin. The centrifuge is allowed to reach a thousand RPM and then is turned off.The tissue at this time is very S eyelets are very sensitive, and you don't want to over compact them. The tubes are removed and we will do this wash step three more times. This is the end of the third wash.The components of the 50 mil conical tube are transferred to the 15 conical tube and centrifuge for a thousand RP M and then stopped. The supernat will be removed and the first part of the FI Call will be started. We are at the step where we Have our pelleted di pancreas digest.We'll resuspend that tissue so it's nice and loose to the pellets. We'll add the first density gradient, which is 1 1 0 8. We'll add five mils to each tube.The pellet is then mixed thoroughly in each of the gradients. It's important that you get good tissue distribution in your heaviest gradient. Now we will layer two mils of 1 0 9 6 density.We will then on top of that, layer two mils of 1 0 6 9 density, and then on top of that 1 0 3 7 density. It's important while you're layering the densities that you don't mix. Then all the layers have been added to the tube.And you can see this is the top of 1 1 0 8, the top of 9 1 0 9 6, the top of 1 0 6 9 and the top of 1 0 3 7. And you could see the tissue is already starting to move to its proper density even without centri fusion. The fial gradients are brought up to speed at 1800 RPM for 15 minutes, and remember to keep the brake off after the tubes are removed from the centrifuge.You can see between the 0 0 9 6 and 0 0 7 layer, there's a nice band of eyelet tissue Pablo's. Now removing the 0 3 7 layer to remove any tissue debris and DNA that might have been released during the processing. Using a sterile plastic pasture pipette, he will now remove the islet layer and transfer them to a 50 mil conical containing 25 mils of wash buffer.You want do this step quickly because fol is toxic to eyelets. We actually removed the entire 0 6 9 and 0 9 6 layer. Pavo cuts the top of the plastic pasture pipette and rinses it with wash buffer.The eyelets are then centrifuge like we centrifuge previously. Centrifuge is brought up to a Thousand RPM and then we stop it and We aspirate off. The supernatant eyelets will be washed three times with wash media.So we just completed the eyelid Isolation process we took from the digest to the fol gradient to the purified eyelets after our third wash with wash buffer, we resuspended the eyelets in our RPMI media and we played it in a tissue culture plate. These eyelets are now ready for in vitro assays or in vivo preps like eyelet Transplant.

فأري عزل جزيرة البنكرياس

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Genetics

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

استخراج RNA سريع وفعال من حيث التكلفة من أنسجة البنكرياس الجرذ

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Biochemistry

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

تحديد سمات تعبير الجينات الخاص بنوع الخلية في كبد الماوس

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.