مع TRAP-seq، يمكننا عزل الحمض النووي الريبي من أنواع خلايا محددة، مثل خلايا الكبد التي تُعاد اكتظاظها في الكبد المصاب لتحليل تغيرات التعبير الجيني التي تحدث في تلك الخلايا. لا يتطلب أي خطوات لإزالة الخلايا غير المرغوب فيها من الأنسجة. يتم عزل الحمض النووي الريبي النوع من الخلية عن طريق تنقية تقارب من lysates الجهاز كله.
تساعدنا هذه التقنية على تحديد كيفية استجابة خلايا محددة للإصابات، والتي يمكن أن تساعد في تحديد استراتيجيات أو أدوية جديدة لمكافحة أمراض الكبد. ويمكن استخدام هذا لتحديد كيفية استجابة خلايا الكبد لأنواع مختلفة من إصابات الكبد. حاليا, هناك عدد قليل من الخيارات لإصابات الكبد الحادة الحادة للغاية وهذه الطريقة سوف تساعد على دليل لنا في لعلاجات جديدة.
هذه الطريقة نشأت في الدماغ. في الكبد، تصورنا أنه يمكن استخدامه لدراسة التغيرات الديناميكية في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، وخلايا الكبد، وخلايا القناة الصفراوية، وخلايا كوبفر، وخلايا البطانية على سبيل المثال لا الحصر. إثبات الإجراء سيكون العنبر وانغ، طالب الدراسات العليا وmentee بلدي.
للبدء، resuspend الخرز المغناطيسي عن طريق الأنابيب لطيف. جمع الخرز على موقف مغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة وإزالة supernatant. ثم، إزالة أنبوب microcentrifuge من موقف المغناطيسي وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، تليها الأنابيب صعودا وهبوطا لغسل الخرز.
وضع أنبوب مرة أخرى على موقف المغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة لجمع الخرز وإزالة برنامج تلفزيوني. لإعداد الخرز المغلفة بالبروتين ، أضف 16 ميكرولتر من البروتين الحيوي L إلى الخرز المغناطيسي المغطى والمغسلة وأضف 1X PBS لجعل الحجم النهائي ملليلتر واحد ، إذا استخدم أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر ، أو 1.5 ملليلتر ، إذا باستخدام أنبوب microcentuge ذو ملليلتر. احتضان الخرز المغناطيسي مع البروتين الحيوي L لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار أنبوب.
ثم، وضع أنبوب على موقف المغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة وإزالة افرنح لجمع البروتين L-المغلفة الخرز. إزالة أنبوب microcentrifuge من موقف المغناطيسي وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني مع 3٪ BSA العازلة، تليها الأنابيب لطيف خمس مرات على الأقل لغسل الخرز البروتين المغلفة L. مرة أخرى، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة وإزالة ناظر لجمع الخرز المغلفة.
كرر غسل BSA أربع مرات أخرى. بعد ذلك، إضافة 50 ميكروغرام من الأجسام المضادة للأجسام المضادة GFP 19C8 والأجسام المضادة GFP 19F7 لكل منهما في الخرز المغلفة L البروتين، واحتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية على دوار أنبوب. لجمع مصفوفة التقارب، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لأكثر من دقيقة واحدة وأزالة المناط.
اتخاذ أنبوب بعيدا عن موقف المغناطيسي وإضافة ملليلتر واحد من العازلة منخفضة الملح. بلطف الأنابيب صعودا وهبوطا لغسل مصفوفة تقارب وتكرار غسل العازلة منخفضة الملح مرتين أخرى. Resuspend الخرز في 200 ميكرولترات من العازلة منخفضة الملح ، لجعل 200 ميكرولترات من مصفوفة تقارب.
أولاً، قم بإعداد طاحونة الأنسجة بحيث يمكن وضع الأنابيب الزجاجية PTFE على الجليد أثناء التجانس. ملء أربعة ملليلتر من عازلة التحلل الباردة في أنابيب الزجاج PTFE. وضع الكبد على طبق بيتري.
استخدم سكينا لعزل 200 إلى 500 ملليغرام من قطع الكبد والانتقال إلى أنابيب الزجاج PTFE. ضع أنسجة الكبد المتبقية في أنبوب microcentuge المبردة مسبقًا وتجميد الفلاش في النيتروجين السائل. التجانس العينات في التجانس المحرك يحركها، بدءا من 300 دورة في الدقيقة لمدة خمس ضربات على الأقل لتفكك خلايا الكبد من بنية الكبد.
خفض أنبوب الزجاج في كل مرة. منع التهيّم، الذي يمكن أن يسبب denaturation البروتين، عن طريق الحفاظ على الآفة تحت المحلول. ثم، رفع السرعة إلى 900 دورة في الدقيقة لتجانس أنسجة الكبد تماما لمدة 12 السكتات الدماغية الكاملة على الأقل.
نقل lysate في أنابيب وصفت وpre-chilled مع ما لا يزيد عن ملليلتر واحد من lysate لكل من. للبدء في التحليل النووي، الطرد المركزي الكبد lysate في 2، 000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق، ثم نقل سوبرنات إلى أنبوب جديد متجمد قبل microcentuge على الجليد. إضافة 1/9th من حجم عظمى من 10٪ NP-40 في أنبوب microcentrifuge على الجليد وخلط الحل عن طريق عكس بلطف الأنبوب.
تدور بسرعة أسفل أنابيب microcentrifuge مع جهاز طرد مركزي صغير وإضافة 1/9th من حجم العينة من 10٪ DOC. مزيج عن طريق عكس بلطف أنابيبrifuge microcents وتدور بسرعة أسفل أنابيب microcentrifuge واحتضان على الجليد لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي النووي في 20، 000 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ونقل سوبرانت إلى أنابيب جديدة قبل المبردة microcentuge على الجليد.
لكل أنبوب، أخرج 1٪ من الحجم الإجمالي للمرجح كتحكم قبل المناعي. ضع ضوابط ما قبل المناعي على دوار أنبوب عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. خذ المزيد من الحذر لإعادة تعليق بلطف مصفوفة التقارب عن طريق الأنابيب، ثم إضافة 200 ميكرولترات إلى كل عينة.
احتضان ال ليسات في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع خلط لطيف على دوار أنبوب. لعزل الجيش الملكي النيبالي، تدور بسرعة أسفل الأنابيب التي تحتوي على lysates في جهاز الطرد المركزي مصغرة وجمع الخرز عن طريق وضع على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة على الأقل. جمع المغرور في أنابيب microcentuge إضافية.
إضافة ملليلتر واحد من العازلة الطازجة عالية الملح إلى كل أنبوب، تليها الأنابيب لطيف خمس مرات على الأقل دون إدخال فقاعات. جمع الخرز على موقف مغناطيسي على الجليد لأكثر من دقيقة واحدة وإزالة ناظر. كرر خطوات الغسيل أربع مرات أخرى.
ثم، إزالة أنابيب microcentrifuge من موقف المغناطيسي ومكان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لتسخين. Resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من العازلة تحلل مع 0.7 ميكرولترات من بيتا ميركوبتويثانول لإطلاق سراح الجيش الملكي النيبالي ملزمة من مصفوفة تقارب. دوامة الأنابيب لمدة خمس ثوان على الأقل في أعلى سرعة وتدور بسرعة إلى أسفل.
ثم، احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة على الأقل، ثم جمع افرنح والمضي قدما على الفور لتنظيف RNA وفقا لبروتوكول تنقية RNA في عدة. لتحقيق أقصى جودة للرنا المعزول، قم بتنفيذ جميع الخطوات الاختيارية، بما في ذلك هضم DNase وجميع خطوات الرنا، بما في ذلك التسخين المسبق الموصى به من عازلة elution إلى 60 درجة مئوية.
في هذه الدراسة, GFP-L10A الانصهار وTransgenes FAH تم تسليمها المشتركة داخل ناقلة فخ بلازميد يحتوي على transposon إلى الكبد عن طريق حقن هيدرودينامي. إزالة النيتسينون تسبب إصابة الكبد السامة. وأكد تلطيخ المناعة coexpression من FAH وGFP-L10A البروتين الانصهار و الكبد إعادة إسكان بعد أسبوعين من إعادة السكان الكبد.
أنتجت العينة هادئة أعلى عائد من البروتين الانصهار، منذ جميع الكبد التعبير عن GFP-L10A بعد حقن AAV8-TBG-Cre. وعلى العكس من ذلك، بالكاد كان أي RNA يمكن اكتشافه في الضوابط من النوع البري التي لم يكن لديها transgene GFP-L10A، مما يشير إلى الإجراء TRAP هو محدد للغاية ولديه خلفية منخفضة. عندما تم استخدام TRAP على أنسجة الكبد التي تمر باعادة الاكتظاظ مع GFP-L10A الخلايا الكبدية المستحثة، تم الحصول على RNA وفيرة عالية الجودة.
وعلى النقيض من ذلك، لم يتم الكشف عن أي أثر للرنا عبر Bioanalyzer لعينة التحكم السلبية. تم تحريض تعبير Gsta1 بأكثر من عشرة أضعاف في إعادة اكتظاظ خلايا الكبد مقارنة بال hepatocytes هادئة، في حين تم الكشف عن أي قيم دورة العتبة مع RNA TRAP معزولة من الماوس نوع البرية بسبب عدم وجود RNA الإدخال. عند تجانس الأنسجة ، تأكد من تحريك الآفة ببطء لمنع التهيج.
بعد عزل الحمض النووي الريبي، يمكن إجراء تسلسل عالي الإنتاجية أو qPCR لتحليل التعبير الجيني. مع TRAP-seq، لدينا الآن طريقة لعزل الجيش الملكي النيبالي على وجه التحديد من خلايا الكبد وإعادة اكتظاظ وتحليل التغير في التعبير الجيني أثناء إعادة السكان الكبد. وهذا يسمح لنا بتحديد الجينات التي يتم تغييرها خلال هذه العملية والأهداف العلاجية المحتملة لعلاج إصابات الكبد.
Cycloheximide وDTT ، التي توجد في عدة مخازن ، على حد سواء سامة. وينبغي جمع النفايات والتخلص منها وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
