Ringraziamo Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paolo Grippo e Satyanarayana Rachagani per i loro utili commenti, suggerimenti e condivisione delle loro protocolli. Questo lavoro è stato sostenuto da U01CA111294 sovvenzione e un premio di sviluppo dell&#39;idea del programma di ricerca intramurale Ohio State University.

1. Preparazione Le seguenti pratiche aderiscono ai criteri impostati da cura degli animali ed uso commissione dell&#39;Istituzione (IACUC). <ol><li> Si raccomanda di isolare non più di 6 pancreas di topo in un dato giorno. Hanno tutti gli strumenti chirurgici puliti e sterilizzati in autoclave, un set per ogni animale. </li><li> Etichettare tutti i tubi microcentrifuga. Quattro 2 ml provette per animali. </li><li> Mettere 8 ml di reagente di lisi in 50 ml provette da centrifuga su ghiaccio. Nota: Mentre il kit di purificazione viene fornito con un guanidina tiocianato reagente fenolo che è adatto per l&#39;isolamento pancreas, reagente di lisi viene utilizzato a causa dei grandi volumi che sono necessari per l&#39;isolamento. </li><li> Versare circa 10 ml delle seguenti soluzioni in provette da 15 ml per centrifuga per la pulizia di spazzole del omogeneizzatore. Etanolo, 70% (2 tubi), acqua di qualità per HPLC (1 tubo) e acqua di qualità per HPLC contenente circa 200 ml di RNase via o inattivatore ribonucleasi equivalente. </li></ol&gt; 2. Chirurgia, Pancreas Dissection e omogeneizzazione <ol><li> Mettere 1-2 ml di isoflurano in un barattolo contenente garza di cotone o tovaglioli di carta. I topi sono posti su una piattaforma che impedisce loro di raggiungere la fonte del isoflurano. Aggiungi isoflurano fresco al vaso prima di anestetizzare ogni mouse. </li><li> Posizionare delicatamente il mouse nel barattolo contenente il isoflurano. Tappare il vaso e monitorare gli effetti dell&#39;anestesia ruotando delicatamente il barattolo avanti e indietro. L&#39;animale viene anestetizzato una volta che è in grado di stare nel suo &#39;. </li><li> Per la conferma di anestesia, togliere l&#39;animale dal vaso e applicare un pizzico punta ditta. Se il mouse non reagisce al pizzico punta, passare al punto 2.5. </li><li> Se il mouse reagisce pizzico punta, quindi ripetere i passaggi 2,2-2,3. </li><li> Posizionare l&#39;animale anestetizzato sul banco in posizione prona. Dislocare cervice del mouse ermeticamente ponendo la mano sinistra sul collo del mouse. Noizione la mano destra afferrare la coda del topo e tirare verso l&#39;alto ad un angolo di circa 45 ° per dislocare la cervice rapidamente. </li><li> Fissare la carcassa di una superficie (un pezzo livello di polistirolo ricoperto di carta assorbente) da piercing ciascuno dei quattro zampe dell&#39;animale nella superficie piatta usando 25 calibro aghi ipodermici. </li><li> Utilizzando strumenti chirurgici sterili, tagliare la parte mediana del mouse aperta e rapidamente rimuovere il pancreas dal mouse. Utilizzare le pinze per tenere il pancreas e tagliarlo dalla milza e intestino tenue con le forbici a molla. Fare attenzione a non allungare il pancreas durante la cancellazione dal mouse. Turbativa del tessuto potrebbe rilasciare ribonucleasi. Nota: Il tempo necessario per rimuovere il pancreas dal mouse è critica. Un esperto dovrebbe essere in grado di sezionare pancreas di circa 1 minuto o meno. </li><li> Porre l&#39;intero pancreas in una provetta da 50 ml contenente 8 ml di ghiaccio freddo reagente di lisi. Tappare la provetta e brevemente agitare per immergere il tiSSUE nel reagente e procedere alla fase successiva senza indugio. Il rapporto di reagente di lisi di tessuto è critica. Vedere la sezione Risultati per un confronto dell&#39;integrità dell&#39;RNA isolato utilizzando diversi volumi di reagente di lisi. </li><li> Omogeneizzare per 5 sec. È importante premere le lame omogeneizzatore al fondo della provetta da centrifuga per permettere al tessuto di essere tirato nelle lame di omogeneizzazione efficiente. </li></ol> 3. Rimozione di tessuto non digerito Nota: Dopo omogeneizzazione, piccoli frammenti di tessuto rimarranno nel reagente di lisi. E &#39;più importante per la lisi rapidamente il tessuto lasciando un po&#39; di tessuto non digerito, piuttosto che su di omogeneizzazione e il degrado rischio di RNA. <ol><li> Trasferimento di 2 ml di reagente di lisi contenente il pancreas lisati di una provetta 2 ml. Raccogliere due tubi microcentrifuga di omogenato per isolamento. Eliminare l&#39;omogeneizzato rimanente o conservare a -80 ° C per gli studi futuri. </li><li> Centrifuge a 4 ° C, 12000 × g per 5 min a pellet tessuto non digerito. Questo è un passo fondamentale, come riporto di tessuto non digerito nelle successive soluzioni di RNA probabilmente contaminare il campione con ribonucleasi (punto 5.13). </li><li> Trasferire 1 ml del supernatante in una provetta 2 ml. Procedere con l&#39;isolamento subito e memorizzare il tubo replica a -80 ° C per un uso futuro. Posizionare tutte le provette contenenti omogeneizzato sul ghiaccio bagnato mentre si procede alla fase successiva. </li><li> Smaltire il restante reagente di lisi in un apposito contenitore di rifiuti chimici. </li></ol> 4. Pulizia delle Blades Omogeneizzatore <ol><li> Prima di procedere all&#39;isolamento successivo, pulire le lame omogeneizzatore mettendoli in 10 ml di etanolo al 70%. Attivare l&#39;omogeneizzatore per circa 20 sec per rimuovere eventuali pezzi di tessuto che può essere catturato nelle lame. </li><li> Utilizzare una punta di 200 microlitri pipetta per rimuovere eventuali pezzi che rimangono nelle lame omogeneizzatore. </li&gt; <li> Ripetere il punto 4.1 in acqua, generale inattivatore Rnase e il 70% di etanolo. Asciugare l&#39;albero omogeneizzatore con Kim pulito pulire. </li><li> Ripetere il punto 2.1 per l&#39;isolamento pancreas dei rimanenti animali, mantenendo RNA isolato da ogni animale separato piuttosto che mettere in comune l&#39;RNA. </li></ol> 5. Isolamento RNA La sezione seguente è identico al protocollo del kit di purificazione. Il vantaggio del kit di purificazione è che sarà isolare l&#39;RNA totale compreso piccoli RNA. <ol><li> Se si utilizza la soluzione omogeneizzato congelato, scongelare il ghiaccio umido e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio, tappare la provetta e agitare vigorosamente a mano per 15 sec. Lasciate che il tubo di riposare a temperatura ambiente per 2-3 min. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 12.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta. Aggiungere 1,5 volumi di isopropanolo e mescolare accuratamente pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Trasferimento fino a 700 microlitri di campione in una colonna di spin che viene inserito in un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a 8000 xg per 15 secondi a temperatura ambiente. </li><li> Gettare il flow-through. </li><li> Ripetere i passaggi 5,5-5,6, con il resto del campione. </li><li> Aggiungere 700 microlitri Buffer RWT alla colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flow-through. </li><li> Dispensare 500 microlitri Buffer RPE nella colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8000 xg per lavare la colonna. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE alla colonna di spin. Centrifugare per 2 minuti a 8000 xg per asciugare la colonna. </li><li> Trasferire la colonna di selezione per una provetta da 1,5 ml. Dispensare 80 microlitri acqua priva di ribonucleasi direttamente sulla membrana colonna di spin. Centrifugare per 1 min a 8000 xg per eluire l&#39;RNA. </li><li> Aggiungere inibitore RNasi 1 microlitri di soluzione di RNA. Conservare a -80 ° C o procedere alla 5.13. </li><li> Per convalidare l&#39;integrità dell&#39;RNA, prima calcolare il conce RNAntration e 260/280 rapporto utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Diluire una porzione della soluzione di RNA a circa 500 ng / ml con acqua per biologia molecolare. </li><li> Determinare l&#39;RNA Integrity (cioè, RIN) utilizzando l&#39;analisi di elettroforesi capillare. Circa 5 ml di soluzione di RNA è sufficiente per l&#39;analisi. </li><li> Aliquotare la soluzione RNA (vedere Figura 2) e conservare a -80 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).</li><li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease.">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li><li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas.">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li><li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum.">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li><li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases.">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li><li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas.">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA A Laboratory Manual. , (2011).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Isolare RNA da tessuti che sono ribonucleasi ricco rappresenta una grande sfida per esperimenti di biologia molecolare. I vari reagenti e kit sono disponibili in commercio che si basano principalmente sul metodo fenolo guanidina tiocianato di estrazione di RNA. Guanidina tiocianato denatura proteine ​​e quindi riduce l&#39;attività di ribonucleasi. Tuttavia, l&#39;ampiezza delle ribonucleasi nel pancreas richiede ulteriori modifiche ai protocolli standard di isolamento dell&#39;RNA. Un protocollo è riportato qui che si basa sul metodo guanidina tiocianato standard, ancora contiene diverse modifiche critici nonché suggerimenti per successo isolamento di RNA da ribonucleasi ricchi tessuti come il pancreas. Linee guida standard per isolare l&#39;RNA sono da notare. Queste tecniche sono fondamentali per il successo isolamento di RNA, anche da campioni di meno di pancreas-ricco ribonucleasi. Alcuni esempi includono l&#39;utilizzo wa grado di biologia molecolareter, materiali di consumo privi di ribonucleasi e articoli in plastica usa e getta, piuttosto che di vetro. Si raccomanda di cambiare i guanti tra ogni isolamento. Per chi è inesperto con isolamento di RNA, si raccomanda che guadagnano esperienza con isolamento di RNA da campioni ribonucleasi poveri come il fegato o da colture cellulari prima di intraprendere un lavoro che richiede isolare RNA da pancreas. Esistono protocolli eccellenti che offrono una varietà di punti per lavorare con successo con RNA 8. Diversi fattori importanti per isolare RNA con grande integrità da topo pancreas sono riportati qui. Questi includono il volume di reagente di lisi utilizzato durante l&#39;omogeneizzazione e l&#39;inclusione di un inibitore di ribonucleasi alla soluzione RNA. Il metodo di includere l&#39;inibitore della ribonucleasi funziona bene, ma ripetuti cicli di congelamento e scongelamento finiranno per ridurre il RIN, probabilmente a causa denaturazione l&#39;inibitore della ribonucleasi. Va notato che tutte le soluzioni di RNA used in questo studio ha attraversato un disgelo congelare prima della determinazione RIN. Un altro metodo per ridurre la degradazione upon disgelo congelamento è di conservare la soluzione RNA a -20 ° C in una forma precipitato 2. Questo offre alcuni inconvenienti cioè rimozione dell&#39;etanolo e ri-dissoluzione del pellet prima di utilizzare l&#39;RNA. Rispetto alle fenolo / guanidina tiocianato protocolli reagente 2, vantaggi del protocollo riportati qui è la semplicità di lavorare con il reagente di lisi e il kit di purificazione che non richiedono la preparazione di soluzioni specializzate e tamponi. Dovrebbe anche essere notato che questo protocollo è stato usato con successo per isolare piccoli RNA da topo pancreas. Ulteriori suggerimenti includono la velocità di pancreas dissezione e il metodo di anestesia prima dell&#39;eutanasia (isoflurano inalazione è preferito a CO 2 asfissia). Diversi tentativi di praticare la chirurgia del pancreas sono raccomandati prima di anticipare alta Quality RNA. L&#39;adattamento di questo protocollo di tessuti ricchi di ribonucleasi come la milza oi polmoni dovrebbero essere facilmente realizzabile.

È necessario isolamento di RNA con grande integrità per esperimenti di routine di biologia molecolare come Northern blotting 9, qRT-PCR 1 o gene expression profiling 5. La maggior parte dei metodi contemporanei di isolamento dell&#39;RNA si basano sulle modificazioni dei protocolli tiocianato di guanidina 2, 3. Guanidina tiocianato è un forte proteina denaturante e verrà efficacemente interrompere l&#39;attività di ribonucleasi in molte condizioni. Il metodo popolare di Chomczynski e Sacchi 3 combinato fenolo alla soluzione di guanidina tiocianato lisi, riducendo il tempo di isolamento per circa 4 ore. Molti reagenti di estrazione dell&#39;RNA commercialmente disponibili sono basati sul metodo Chomczynski e Sacchi 3. Ribonucleasi ricchi tessuti come umano o il mouse pancreas presenta una sfida aggiuntiva per isolare RNA. Pancreas mouse può contenere fino a 75 mg di ribonucleasi 6, alcune delle quali verrà rilasciato During rottura del tessuto pancreatico conseguente autolisi tessuto. Modifiche dei protocolli guanidina tiocianato sono stati utilizzati con successo per isolare l&#39;RNA da pancreas con alta integrità 2, 4, 7, 10. L&#39;infusione di RNA stabilizzante in topo pancreas facilitato isolamento di RNA con elevata integrità 4, 7, 10, tuttavia infusione di Le soluzioni nel pancreas richiede grande abilità, possono richiedere strumenti specializzati come un microscopio da dissezione e interrompere architettura del tessuto durante la procedura può provocare la lisi cellulare. Perfusione tissutale con reagente stabilizzazione dell&#39;RNA potrebbe interferire con altre applicazioni, tra cui l&#39;isolamento delle proteine ​​e la colorazione istologica. Inoltre, questa tecnica non è adatto per isolare l&#39;RNA da pancreas umano. Altri protocolli richiedono la preparazione di soluzioni specifiche dallo sperimentatore 2. Riportiamo un protocollo per isolare l&#39;RNA con grande integrità di topo pancreas. The protocollo utilizza elementi dei metodi precedentemente pubblicati ed è in gran parte basata su protocolli standard di fenolo / guanidina a base di tiocianato-lisi reagenti. Non richiede la preparazione di soluzioni specializzate né richiede infusione di reagenti nelle pancreas. Passaggi critici per il successo di isolamento di RNA comprendono un elevato fenolo / guanidina-basato lisi reagente rapporto tra tessuto, la rimozione del tessuto non digerito prima fase la separazione e l&#39;inclusione di un inibitore della ribonucleasi alla soluzione RNA risultante. Utilizzando queste e altre modifiche, di solito isolare l&#39;RNA con RIN superiore a 7 da utilizzare per l&#39;analisi di espressione genica di routine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="788">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:360px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Power Gen 500&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-261-03&#160;</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5424R</td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Refrigerated microcentifuge</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15596018</td>
			<td>Lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Vannas spring scissors</td>
			<td style="width:93px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">91500-09&#160;</td>
			<td>use to cut pancreas from attached tissues</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical scissors, 6 inch</td>
			<td style="width:93px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-951-20</td>
			<td>use to cut scin of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt end forceps</td>
			<td style="width:93px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">1381239</td>
			<td>use to hold pancreas while dissecting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane USP</td>
			<td style="width:93px;">Abbott Labs</td>
			<td style="width:119px;">4/8/5210</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase out (40 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10777-019</td>
			<td>Rnase inhbitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">10328-011</td>
			<td>General Rnase inactivator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:93px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">W5-4</td>
			<td>For washing homogenizer blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molecular Biology grade water</td>
			<td style="width:93px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30538.03</td>
			<td>Elution of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">217004</td>
			<td>Purification Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free</td>
			<td style="width:93px;">USA Scientific Plastics</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:93px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100% ethanol</td>
			<td style="width:93px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 ul pipet tips</td>
			<td style="width:93px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">GPL200F</td>
			<td>For cleaning homogenizer blades</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:93px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:93px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">ND-1000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNAlater</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Stabilization Reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNeasy&#160;spin columns&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;spin columns&#160;as a part of the miRNeasy Mini kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mice</td>
			<td style="width:93px;">Chales River</td>
			<td style="width:119px;">strain C57BL/6</td>
			<td style="width:360px;">Their age ranged from 4 to 12 months.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mice&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Jackson Lab</td>
			<td style="width:119px;">strain 129</td>
			<td style="width:360px;">Their age ranged from 4 to 12 months.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from mouse pancreas: a ribonuclease-rich tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

La resa RNA totale da 1 ml di omogenato lisi è 20-40 mg. OD 260/280 rapporti sono in genere circa il 2,0 e il RIN sono costantemente maggiore di 7.0. Se il RIN è ≤ 6, l&#39;isolamento dovrà essere ripetuta. Occasionalmente, un RIN che è superiore a 8,0 si ottiene. I due metodi più comunemente usati di eutanasia topi prima della rimozione del pancreas sono CO 2 asfissia o inalazione di isoflurano. Entrambe le tecniche sono seguiti da dislocazione cervicale. Poiché è possibile che il tempo agente e / o procedimento chimico potrebbe influenzare l&#39;integrità dell&#39;RNA, l&#39;RIN di topo RNA pancreatico isolate utilizzando entrambe le tecniche è stata confrontata. I topi sono stati anestetizzati utilizzando CO 2 asfissia o inalazione isoflurano; entrambe le tecniche sono state seguite per dislocazione cervicale. Il tempo di anestetizzare gli animali prima della dislocazione cervicale è stato di circa 1-2 min più per CO 2 asfissia rispetto al isoflUrane. RNA isolato dopo inalazione di isoflurane prodotto un RIN di 7,5 ± 0,31 a fronte di un RIN di 2,2 ± 0,3 (p &lt;10 -4, media ± SD, triplicare isolamenti) per la CO 2 asfissia. Il metodo di eutanasia ha un impatto drammatico sulla integrità RNA e la tecnica di inalazione isoflurano è preferito a CO 2 asfissia. L&#39;integrità dell&#39;RNA isolato dal pancreas di topo che sono stati omogeneizzati in 2, 4 e 8 ml di reagente di lisi sono stati confrontati. Abbiamo ipotizzato che aumentando il volume di reagente di lisi porterà ad un maggior grado di inattivazione ribonucleasi. Altro che il volume di reagente di lisi, tutte le condizioni erano identici a quelli elencati nel protocollo. C&#39;era una correlazione tra la quantità di reagente di lisi utilizzato nella omogeneizzazione e integrità dell&#39;RNA (Figura 1). Il RIN di RNA isolato usando 2, 4 e 8 ml di reagente di lisi era 4.2, 6.5 e 7.4, rispettivamente (media, triplice copia èolations). Pertanto, 8 ml di reagente di lisi devono essere utilizzati in questo protocollo. Per alcuni esperimenti, potrebbe essere necessario raccogliere sia RNA e proteine ​​dalla stessa pancreas. Ad esempio, l&#39;RNA può essere utilizzato per qRT-PCR e proteina può essere visualizzata utilizzando immunoistochimica. Se questo è il caso, si raccomanda di tagliare il pancreas a metà dalla testa alla coda. Questo è importante in quanto il pancreas si differenzia anatomicamente dalla testa alla coda. Per dimostrare se le eventuali differenze integrità dell&#39;RNA esiste tra RNA isolato da due metà del pancreas, il seguente esperimento è stato fatto. RNA è stato isolato dalla prima metà del pancreas. Il RIN determinato da questo RNA è stata confrontata con quella di RNA isolato dalla seconda metà del pancreas dopo seduto a temperatura ambiente per circa 30 secondi durante l&#39;iter della metà iniziale. Il RIN per metà iniziale del pancreas era 7.4 ± 0.20 rispetto a un RIN di 6,9 ± 0,55 per la successiva metà. Mentre il taglio pancreas diquesto modo non sembra rilasciare ribonucleasi e digestione di RNA, se il pancreas deve essere sezionato, si raccomanda di utilizzare il primo tempo per l&#39;analisi dell&#39;RNA e la seconda metà di proteine. Reagente di lisi interrompe struttura delle proteine ​​e quindi riduce l&#39;attività ribonucleasi. A causa della grande quantità di ribonucleasi che è presente nel pancreas, è possibile che alcune ribonucleasi attiva rimane nella omogenato lisi e questo ribonucleasi sarà equilibrare alla fase acquosa. Qualsiasi ribonucleasi che rimane nella ultima soluzione RNA ostacolerà integrità. Per ovviare a questo, abbiamo aggiunto un inibitore di ribonucleasi alla soluzione acquosa di RNA. L&#39;integrità dell&#39;RNA è stato confrontato da una soluzione di RNA contenente l&#39;inibitore della ribonucleasi a uno che non ha fatto. Su uno disgelo congelamento, il RIN per la soluzione di RNA con inibitore era 7,3 ± 0,15 rispetto a 2,9 ± 0,65 (Figura 2, p &lt;0,001, media ± SD, triplicare isolamenti) per l&#39;soluzione che non conteneva inibitore. Un altro problema è la possibilità che i ripetuti di congelamento scongelamento sarà denaturare il ribonucleasi inibitore rendendola inefficace. Per esaminare questa possibilità, una soluzione di RNA contenente l&#39;inibitore della ribonucleasi è stato più volte congelati e scongelati. Le soluzioni di RNA che sono stati congelati e scongelati fino a 5 volte ancora prodotto un RIN di 7 o superiore, mentre quelle soluzioni che sono stati congelati e scongelati 6 volte o superiore prodotto un RIN inferiore a 7 ​​(Figura 2). Si raccomanda di aliquota della soluzione RNA prima del congelamento e limitare il numero di cicli di congelamento e scongelamento. Per dimostrare l&#39;utilità di questo metodo, abbiamo effettuato qRT-PCR su RNA isolato. La media RIN da isolamenti di RNA triplicato era 7.4 ± 0.20 (media ± SD). Casuale cDNA innescato stato sintetizzato dall&#39;RNA e l&#39;espressione dei tre geni housekeeping è stata misurata mediante qPCR utilizzando tecniche standard. I dati mostrati nella Figura 3 validatesla nostra capacità di usare correttamente il mouse RNA pancreas in una tecnica di biologia molecolare standard. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51779/51779fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Alta lisi reagente rapporto tessuto migliora l&#39;integrità dell&#39;RNA. L&#39;integrità dell&#39;RNA isolato da pancreas di topo che è stato omogeneizzato in 2 (A, D), 4 (B, E) o 8 (C, F) ml di reagente di lisi era rispetto. Altro che il volume di reagente di lisi, tutte le condizioni erano identiche a quelle descritte nel protocollo qui. Esiste una correlazione tra la quantità di reagente di lisi utilizzato nell&#39;integrità omogeneizzazione e RNA. (G) media ± DS, isolamenti in triplicato. p &lt;0.05, ** p &lt;0,001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51779/51779fig1highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande</a>di questa figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51779/51779fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. RNA casualmente degrada dopo ripetute congelamento scongelamento. RNA isolato da topo pancreas è stato più volte congelati e scongelati in presenza o assenza di inibitore della ribonucleasi (RNasi I). Media ± SEM, ** p &lt;0,001. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51779/51779fig3highres.jpg" width="300" /> Figura 3. QRT-PCR di RNA topo pancreatico. RNA è stato isolato da tre pancreas di topo usando il protocollo ottimizzato. L&#39;espressione di 18S rRNA, β-2 microglobulina e snoRNA251 stata determinata utilizzando qRT-PCR (media ± SD).

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RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K Views.  The Ohio State University. We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Video: RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Isolamento dell'RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

Proteine Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Isolamento dell'RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

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Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

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