وأيد هذا العمل من خلال منحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (HL068915 إلى DBC)، وجائزة الباحث جديد من صندوق البحوث الدراسه (لCAP)، منحة في والمساعدات من جمعية القلب الأمريكية (12GRNT11910008 إلى DBC) ، منحة بحثية من مؤسسة القلب للأطفال (لDBC)، والتبرعات لمستشفى صندوق الأطفال في بوسطن القلب التوصيل، والوقف ريان الأسرة، وديفيد بولمان.

هنا سوف علينا أن نظهر عزلة COL1 من الجلد الضأن. كما هو مكتوب، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لعزل بنجاح COL1 من الأرانب وجلد الإنسان. 1. إعداد الجلدية عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن جميع الكواشف إلى 4 درجة مئوية قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العينة الجلدي (25-50 غ) في DH الجليد الباردة 2 O وإزالة أي الصوف والفراء، أو الشعر مع كريم مزيل الشعر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة حلاقة واحدة الحافة لكشط نظيفة عينة من النسيج الضام والدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العينة في الجليد الباردة درهم 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة عينة الجلد إلى 1 سم × 1 سم قطع مع شفرة حلاقة واحدة الحافة. </li></ol> 2. إزالة المواد غير كولاجيني Solubilized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 5 غرام من العينة في أنبوب 50 مل المخروطية وإضافة 30 مل من الجليد الباردة M 0.5 خلات الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط الأنابيب لمدة 1 دقيقة في 6 إعداد م / ثانية باستخدام محول أنبوب 50 مل في الخالط مقعد بين كبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل سوبernatant وتكرار لما مجموعه 7 الصوديوم خلات دورات الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العينة في DH الجليد الباردة 2 O وتخلط مرة واحدة لإزالة خلات الصوديوم المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة لضغط العينة ضد الجانب من الأنبوب لإزالة السائل الزائد، ثم نقل إلى أنبوب 50 مل المخروطية الطازجة. </li></ol> 3. النوع الأول الكولاجين استخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينة مرتين في 2 مل / ز 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات لمدة 1 دقيقة في 6 متر / ثانية في الخالط مقعد بين كبار ضغط العينة والتخلص من طاف بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة جديدة 2 مل / ز قسامة من 0.075 M الصوديوم العازلة سترات للعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ 6 متتابعة 1 دقيقة، 6 م / ثانية دورات مقعد بين كبار مزيج من الانفعالات الخالط دون إزالة المنطقة العازلة بين كل دورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل، طاف واضحة سميكة إلى أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مبلغ إضافي 1 مل / ز 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات إلى عينة واحدة وأداء النهائي مقعد بين كبار الخالط agitaدورة نشوئها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة هذا طاف النهائي إلى أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب جمع 3،200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف إلى المقصورة العلوي من 100،000 الوزن الجزيئي قطع جهاز تصفية الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 3،200 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل COL1 تنقيته من المقصورة العلوية لأنبوب مخروطي نظيفة وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).</li><li>Pacak, C. A., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+myogenic+engineered+tissue+constructs.">Fabrication of myogenic engineered tissue constructs.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li><li>Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+characterization+of+collagen+with+or+without+telopeptides+from+chicken+skin.">Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin.</a> Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).</li><li>Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+soluble+collagens.">Preparation and properties of soluble collagens.</a> Methods in Enzymology. , (1963).</li><li>Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+purification+of+collagen+type+I+for+tissue+engineering+applications.">Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).</li><li>Ohan, M. P., Dunn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stabilizes+collagen+sterilized+with+gamma+irradiation.">Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).</li><li>Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+the+sterilization+effect+of+gamma+ray+irradiation+of+immobilized+collagen+polypropylene+nonwoven+fabric+surfaces.">The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).</li><li>Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+on+patterned+collagen+films:+an+in+vitro+study.">Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study.</a> Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).</li><li>Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+femtosecond+laser+patterning+of+collagen+for+directed+cell+attachment.">3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment.</a> Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتنافس في الكشف عنها.

وثمة عنصر حاسم لهذا الأسلوب هو ضغط كفاءة المتكررة من العينة عن طريق الجلد لإزالة السائل الزائد. فمن الأهمية بمكان لإزالة أكبر قدر ممكن خلات الصوديوم في الخطوة 2.5 عن طريق ضغط العينة. نستخدم ملعقة ضغط الجلد ضد الجانب من الأنبوب، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا القماش القطني، على الرغم من أن هذا يستلزم إزالة عينة من الأنبوب وزيادة الوقت اللازم لتنفيذ هذه الخطوات. وبالمثل، فإنه من المهم لضغط العينة في الخطوة 3.1 بحيث حجم سيترات الصوديوم دقيقة في الخطوات اللاحقة استخراج. وفشل لإزالة السائل كاف من العينة في أي من هذه الخطوات يكون لها تأثير ضار على العائد COL1 النهائي. آخر عنصرا رئيسيا لهذا البروتوكول هو للحفاظ على جميع الكواشف في 4 درجات مئوية. وهذا يضمن استخراج كفاءة COL1 solubilized الحامض ويمنع تصلب الكولاجين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ الإجراء باستخدام جميعالكواشف معقمة في بيئة معقمة. وهذا سيكون له أهمية خاصة بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في توظيف هذا الأسلوب لعزل COL1 لاستخدامها في البشر. العديد من المصادر التجارية من COL1 تم تعقيمها بشكل فعال من خلال التشعيع بأشعة غاما. للأسف، فإن هذه الممارسة يقلل إلى حد كبير قدرته على تشكيل المواد الهلامية بسبب تفتت البروتين وتمسخ 9،10. ويمثل هذا الإجراء الظروف المثلى لاستخراج COL1 كما هو محدد من العديد من التجارب أجريت لتحديد النسبة المثالية من عينة الجلد لتخفيف حدة التخزين. ويقترح إضافة المزيد من أنابيب عندما يرغب المحقق لتوظيف هذا الإجراء لعينات الجلد أكبر. بناء على خبرتنا، فإنه ليس من المستحسن لإضافة المزيد من عينة أو المخزن المؤقت مما هو مذكور لكل أنبوب. فمن الجدير بالذكر أيضا أن حبات تتكون من السيليكا، والسيراميك، والعقيق، وأكسيد الألمنيوم، وكربيد السيليكون، أو أكسيد الزركونيوم، والتي تستخدم عادة بالاشتراك مع بench أعلى المجانسة، وحذفت من الإجراء لدينا. في 6 دورات متتابعة 1 دقيقة التحريض هو موضح في الخطوة 3.3 ضرورية بسبب وجود قيود التي تفرضها أجهزة الانفعالات لدينا. يمكننا أن تستنهض الهمم سوى عينة لما مجموعه 60 ثانية في كل مرة، وبعد ذلك يتطلب الجهاز توقف. إذا كان أحد لديه المعدات التي يمكن تعيينها لمدة 6 دقائق على التوالي، فإنه من المحتمل أن يكون على ما يرام للتبديل إلى واحد، ودورة لمدة ست دقائق. نحن لا، ومع ذلك، تشير الالتزام الصارم لوزن وحجم العينة العازلة وصفها. وقد وجدنا هذا الأسلوب إعداد يعزل بكفاءة ذوبان COL1 من الضأن، الأرانب، وعينات الجلد الإنسان 8. من ناحية أخرى، وكان هذا البروتوكول لم تنجح في تنقية COL1 من عينات الجلد الخنازير. حتى مع تعديلات واسعة النطاق لطريقة، أنتجت الأدمة الخنزير مبلغ باهظ من زبد لأن الدهون المتبقية والدهون مما يؤدي إلى استخراج COL1 غير فعالة. على العكس، COL1 يمكن تنقيته من ذيول الفئران كلهأو معزولة الفئران الأوتار الذيل باستخدام إعداد معدلة بشكل طفيف يتضمن lysing حبات مصفوفة. وقد سبق وصف ذلك بالتفصيل 8. للعلماء البحوث، والاستخدامات المحتملة للحمض solubilized النهائي COL1 المنتجات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة ما يلي: أ) توفير الركيزة لاصقة لوحات الثقافة لدعم مرفق الخلية والانتشار، ب) الصغيرة الزخرفة من السطوح لمدة 2 - 3 أو - الأبعاد (2 - أو 3-D) خلية ثقافة، وج) إنشاء السقالات 3-D لتطبيقات هندسة الأنسجة. في حين أن بعض كمية صغيرة من تقلب الكثير إلى الكثير هو متوقع من أي طريقة تنقية، وجدنا أن هذه الاستعدادات COL1 السائل هي دائما قادرة على أن تكون جنبا إلى جنب مع السكان الخلية المختلفة وصبها في قوالب. بعد تحييد الحموضة والاحتباس الحراري، والنتيجة هي الأنسجة المهندسة وطدت بناء مع الخلايا الموجهة مكانيا توزع بالتساوي في جميع أنحاء المصفوفة. اعتمادا على شكلالعفن، وهذه التركيبات التي يمكن إدخالها في أي شكل وحجم تقريبا 3،4،11-14. باختصار، فمن رأينا أن السبب الأكثر إلحاحا للاستفادة من هذا الأسلوب هو أنه يقلل بشكل كبير من الوقت والجهد اللازمين لعزل عالية نقية، قابل للذوبان COL1 من مصدر الأنسجة ذاتي مثل خزعات الجلد الصغيرة. ويستند هذا الأسلوب على الإجراءات المعمول بها منذ فترة طويلة وتنتج المنتجات التي تلبي أو تتجاوز نوعية الاستعدادات تجارية باهظة الثمن فيما يتعلق نقاء COL1 والقدرة على تكوين الأنسجة مستقرة 3-D. في نفس الوقت، وهذه الطريقة المبسطة يسمح للعزلة فعالة وسريعة من COL1 المستمدة autologously التي يمكن استخدامها بأمان لعدد وافر من التطبيقات السريرية.

على مدى عقود، وقد عزل الباحثون والباعة التجارية solubilized COL1 من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك الجلد والأنسجة وتر استخدام بعض الاختلاف من بروتوكول استخلاص الحمض بسيطة تليها تحييد، مما يؤدي الى إعادة تعليق من مصفوفة من الألياف COL1 المنظمة التي يمكن استخدامها لعدد وافر من التطبيقات الطبية الحيوية 1-4. في حين أن هناك العديد من الأمثلة على التطبيقات السريرية لCOL1، عدد قليل من هذه توظف COL1 المستمدة autologously لأن إعداد هذا البروتين يتطلب قلع مطولة مع الأخذ أيام أو أسابيع لأداء 5-7. ونتيجة لذلك، والمحققين البحوث والأطباء عموما استخدام، المستحضرات التجارية باهظة الثمن من COL1 التي يتم إعدادها باستخدام الأنسجة غير البشرية مثل الفئران والأبقار، أو أدمة الخنازير أو باستخدام إزالة الجثث من الجلد أو بعد ختان الذكور. للتطبيقات التجدد، وكثير من هذه المنتجات المعرض التباين فيما يتعلق قدرتها على تشكيل الصلبةمصفوفات أو يبني الأنسجة قادرة على دعم مرفق الخلية والنمو. وبالتالي، هناك حاجة واضحة لطريقة موحدة جديدة مصممة لاستخراج بسرعة COL1 من مصادر الأنسجة ذاتي الوصول إليها وفيرة. أن مثل هذا الأسلوب توفير الوقت والمال في إعداد البحوث التي يمكن استخراجها COL1 من نموذج حيواني من الفائدة وتستخدم لاختبار قبل السريرية الأنسجة المهندسة وتجميعها على السقالات القائمة على الكولاجين. في الوقت نفسه، فإن وجود خيار استخدام معزولة بسرعة، COL1 المستمدة autologously في العيادة زيادة السلامة العامة للمرضى من شأنها أن تلقي خلاف ذلك خيفي أو مستحضرات أعضاء غير بشرية. للمرضى الذين يتلقون استعدادا ذاتي المنشأ، فإن هذا الأسلوب مبسطة يقلل كثيرا من الفاصل الزمني بين جمع خزعة وتطبيق الكولاجين. لهذه الأسباب، سعينا لتحسين بناء على COL1 العزلة وتنقية الأسلوب الراسخة باستخدام عالية السرعة AGitation والحجم الاستبعاد الطرد المركزي. هذه طريقة بسيطة لأداء باستخدام مخازن القياسية والمعدات الموجودة في العديد من المختبرات. من خلال توظيف عالية السرعة والإثارة، لدينا بروتوكول يقلل من الوقت اللازم لعزل القابلة للذوبان، الجلد COL1 من ما يقرب من 10 يوما إلى أقل من 3 ساعة 8. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها بسهولة في الإعداد السريرية من أجل إعداد COL1 المستمدة autologously للاستخدام في المرضى خلال مجموعة واحدة من الإجراءات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

ويستخدم نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) على نطاق واسع باعتبارها الركيزة لاصقة لمزارع الخلايا وكما سقالة الخلوية للتطبيقات التجدد. سريريا، ويستخدم على نطاق واسع هذا البروتين للجراحة التجميلية، والحقن الجلدية، تطعيم العظام، والجراحة الترميمية. مصادر COL1 لهذه الإجراءات هي غير البشرية عادة، مما يزيد من احتمال التهاب والرفض وكذلك انتقال المرض أجنبي بيولوجيا. في ضوء ذلك، فإن الأسلوب بكفاءة وبسرعة تنقية COL1 من كميات محدودة من أنسجة مستمدة autologously-تحايل العديد من هذه القضايا، ولكن العزلة البروتوكولات القياسية هي طويلة وتتطلب كميات كبيرة من الأنسجة كولاجيني كثير من الأحيان. هنا، علينا أن نظهر طريقة استخراج COL1 فعالة أن يقلل من الوقت اللازم لعزل وتنقية هذا البروتين من حوالي 10 أيام إلى أقل من 3 في الساعة. اخترنا الأدمة كمصدر الأنسجة لدينا بسبب توافره خلال العديد من الإجراءات الجراحية. Tيستخدم طريقته مخازن استخراج التقليدية جنبا إلى جنب مع الانفعالات قوية والترشيح الطرد المركزي للحصول على درجة عالية من محض، قابل للذوبان COL1 من كميات صغيرة من أدمة. لفترة وجيزة، يتم غسلها الخزعات الجلدية تماما في DH الجليد الباردة 2 O بعد إزالة الدهون، والنسيج الضام، والشعر. يتم تجريد عينات الجلد من البروتينات والسكريات غير كولاجيني باستخدام 0.5 M خلات الصوديوم وسرعة عالية مقعد بين كبار الخالط. يتم استخراج الكولاجين من المواد الصلبة المتبقية في وقت لاحق مع 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات باستخدام الخالط. يتم تنقية هذه المقتطفات باستخدام 100،000 ميغاواط وقف انتاج المواد الانشطارية مرشحات الطرد المركزي التي تحقق الاستعدادات COL1 من نوعية مماثلة أو متفوقة على المنتجات التجارية أو تلك التي تم الحصول عليها باستخدام إجراءات التقليدية. نتوقع أن هذه الطريقة تسهل استخدام المستمدة autologously-COL1 للعديد من البحوث والتطبيقات السريرية.

هذا البروتوكول العزلة COL1 يتطلب حوالي 2 ساعة و 15 دقيقة لإكمال. ويبين الشكل 1 رسما تخطيطيا يحدد الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء. إعداد العينة وتنفيذ 7 دورات من الثورات عالية السرعة ويشطف مع خلات الصوديوم يستغرق حوالي 35 دقيقة (أرقام 1A-C). أداء التحريض واحدة وشطف دورة مع DH 2 O يستغرق حوالي 5 دقائق (أرقام 1D و1E). مضيفا سيترات الصوديوم وإخضاع العينة إلى التحريض واحدة وشطف دورة تليها 6 دورات من الهياج يستغرق حوالي 45 دقيقة (أرقام 1F و1G). الطرد المركزي في المواد الصلبة المتبقية من استخراج السائل يستغرق 15 دقيقة (الشكل 1H). أخيرا، ونقل العينة إلى جهاز التصفية وتنفيذ الخطوة الطرد المركزي أخرى لتركيز المنقى، COL1 solubilized وإزالة البروتينات الصغيرةيستغرق 30 دقيقة (أرقام 1I و1J). المنتج النهائي هو المركزة، وإعداد عالية نقية من ذوبان COL1 التي يمكن بلمرة بإضافة مزيد من نا 2 HCO 3 واحتضان عند 37 درجة مئوية. النقيض من المرحلة المجهري الصور من هذا المنتج تكشف عزز الألياف COL1 التي يمكن أن تكون بمثابة ركيزة لمرفق الخلية إلى لوحات زراعة الأنسجة أو استخدامها بوصفها سقالة ل3-D تطبيقات هندسة الأنسجة (أرقام 2A و 2B). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51011/51011fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51011/51011fig1.jpg" /> الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي لتحسين طريقة عزل COL1. أ) يتم إضافة شرائح الأدمة إلى 50 مل أنبوب مخروطي. ب) يضاف 0.5 M خلات الصوديوم إلى عينة. ج)تخضع العينة إلى 7 دورات الانفعالات مع العازلة خلات الصوديوم استبدالها بعد كل دورة. D) DH 2 O يضاف إلى عينة الجلد. E) يخضع إعداد دورة إلى 1 من الانفعالات وDH 2 O يسكب قبالة. F) يضاف 0.075 سيترات الصوديوم M للعينة. G) يخضع العينة إلى 6 دورات من الانفعالات. H) يتم طرد عينة لإزالة المواد الصلبة الكبيرة. الأول) يتم نقل طاف ل100،000 الوزن الجزيئي بقطع حدة تصفية الطرد المركزي في أنبوب مخروطي. J) يتم طرد هذه الوحدة ويتم جمع السائل اللزج الذي يبقى في المقصورة العليا. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51011/51011fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51011/51011fig2.jpg" /> الشكل 2. العزلة السريع جيئة وذهابام الأدمة لانتاج COL1 بلمرة إلى الألياف. تم تحييد القابلة للذوبان COL1 بإضافة نا 2 HCO 3 ثم حضنت في 37 درجة مئوية. صورة النقيض من المرحلة (أ) وصورة مجهرية انتقال الإلكترون (تبين الحفاظ د النطاقات) (ب) من الألياف COL1 إنشاؤها باستخدام أسلوب العزلة السريع لدينا. أشرطة النطاق = 10 ميكرون و 500 نانومتر (على التوالي). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51011/51011fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

تتطلب الإجراءات التقليدية لعزل نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) حوالي 10 يوما من البداية الى النهاية بسبب حضانات عازلة طويلة وشاقة resuspensions من الألياف. هنا، نحن تصف وسيلة لتنقية COL1 الخزعات الجلدية الصغيرة في أقل من 3 دقائق.

طريقة محسنة لإعداد النوع الأول الكولاجين من الجلد

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

an-improved-method-for-the-preparation-of-type-i-collagen-from-skin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K Views.  Boston Children's Hospital.  تتطلب الإجراءات التقليدية لعزل نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) حوالي 10 يوما من البداية الى النهاية بسبب حضانات عازلة طويلة وشاقة resuspensions من الألياف. هنا، نحن تصف وسيلة لتنقية COL1 الخزعات الجلدية الصغيرة في أقل من 3 دقائق. 

Video: An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي : أداة لدراسة بشرة العادية والتقدم الميلانوما

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

عضوي النمط I الكولاجين الفحص: A منهاج طيع لتقييم سلوك الخلية في سياق الأبعاد 3-

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

بناء هيدروجيل الكولاجين لتسليم الشيتوزان الجذعية المجهرية الخلية محملة

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

ثابت الطريقة النتوء الضغط التي تسيطر عليها لإعداد الحويصلات الدهن نانو الحجم

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

التصوير مبدل طبيعة الكولاجين السواحل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; و<em&gt; خارج الحي</em&gt; عن طريق التهجين أثار صور من المحاكاة محبوس الكولاجين الببتيدات

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a nano-scale. As such, traditional methods of describing implant surfaces -&#160;namely numerical determinants of surface roughness -&#160;are inadequate for predicting in vivo performance. Biomechanical testing provides an accurate and comparative platform to analyze the performance of biomaterial surfaces. An improved mechanical testing method to test the anchorage of bone to candidate implant surfaces is presented. The method is applicable to both early and later stages of healing and can be employed for any range of chemically or mechanically modified surfaces -&#160;but not smooth surfaces. Custom rectangular implants are placed bilaterally in the distal femora of male Wistar rats and collected with the surrounding bone. Test specimens are prepared and potted using a novel breakaway mold and the disruption test is conducted using a mechanical testing machine. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate and reproducible means for isolating an exact peri-implant region for testing.

An improved method to mechanically test bone anchorage to candidate implant surfaces is presented. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate means to direct the disruption forces to an exact peri-implant region.

لتحسين طرق الاختبارات الميكانيكية لتقييم العظم زرع مرسى

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

الأنسجة المفروم في المضغوط الكولاجين: وBiotransplant التي تحتوي على خلية لإصلاح الترميمية نظموا وحيد

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...