وأيد هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) التعاونية جائزة الابتكار. وأيد LAM بواسطة الإشارات الخلوية وتنظيم المعهد الوطني للصحة تدريب منحة (T32 GM008759) وروث المعاهد الوطنية للصحة L. كيرشتاين ما قبل الدكتوراه زميل (CA165349-01). نود أن نشكر الأستاذ الدكتور مايكل Stowell (CU بولدر)، والبروفيسور ريس دوغلاس وروب البروفيسور فيليبس (كالتك) للتعليق عليها لا تقدر بثمن.

1. الحويصلية التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد زجاج مل 20 قارورة مع غطاء تفلون مبطنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الأواني الزجاجية وجميع المحاقن مع الكلوروفورم قبل استخدامها لمنع التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من كلوروفورم الصف كاشف للقارورة من الزجاج باستخدام 250 ميكرولتر حقنة زجاجية محكمة الغلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكرولتر من الميثانول الصف كاشف للقارورة من الزجاج نفسه باستخدام 100 ميكرولتر حقنة زجاجية محكمة الغلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد 2 مم 7:1.5:1.5 فسفاتيديل كولين (POPC): فسفاتيديل إيثانولامين (البابا): حل الكولسترول الدهون، نقل 216 ميكرولتر من 10 ملغ / مل POPC، 42 ميكرولتر من ميكرولتر ملغ / مل البابا و20 10 من 11 ملغ / مل الكولسترول الحلول في CHCL 3 إلى 20 قارورة من الزجاج مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر المذيبات العضوية باستخدام بطء تدفق الأرجون أو غاز النيتروجين حتى يتم ملاحظة وجود طبقة رقيقة من الدهون في الجزء السفلي من القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنينة زجاج لم يسبق لهم اللعب في مجفف فراغ لا يقل عن 30 دقيقة لإزالة المذيبات المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TRansfer 2 مل من العازلة، ومرت في السابق من خلال مرشح ميكرون 0.2، إلى قارورة من الزجاج على ترطيب الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذا الخليط في 4 درجات مئوية خلال الليل واستخدم في غضون 48 ساعة. </li></ol> 2. التجميد والذوبان-: لأحجام الحويصلية من 30 - 100 نانومتر فقط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد تعليق الحويصلية في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد تعليق الحويصلية باستخدام كتلة التدفئة في درجة الحرارة 42 درجة مئوية لمدة 3 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.1 و 2.2 ليصبح المجموع 5 دورات. </li></ol> 3. قذف اتبع الإرشادات Avestin لتجميع بشكل صحيح Liposofast LF-50 الطارد، وذلك باستخدام أداة الخطوط العريضة في كتاب مرشدهم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم وضع الدعم ثقب كبير الشاشة (مع فتحات دائرية) في قاعدة دعم مرشح، وذلك طبق في متكلس دائري (بدون ثقوب)، قرص واحد هجرة (25 مليمتر في القطر)، واحد غشاء البولي (25 مليمتر في القطر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صغير، أسوديا الدائري على الجزء العلوي من الغشاء لضمان الحصول عليها على قاعدة دعم مرشح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق الطارد أعلى مرشح من خلال تشديد 4 براغي في ثقوب 4 المقابلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع وحدة الطارد مرشح للبرميل تحت الطارد كبير. إضافة إلى حل الحويصلية برميل الاسطوانة. ضع ما يلي على رأس برميل قذف بالترتيب: دائري كبير يا الدائري، قبعة ضيقة، دائرية كبيرة يا الدائري، قبعة دائرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق منظم الغاز إلى الأعلى برميل الطارد وإغلاق كافة الصمامات لمنع تسرب الهواء، بما في ذلك ضغط صمام. وضع قنينة زجاج 20 مل أو 50 مل دورق مخروطي في إطار وحدة تصفية الطارد. تم توصيل صمام أمان للمنظم وستفرج إذا ضغط يتجاوز 600 رطل. بدوره على غاز النيتروجين وفتح صمام الغاز مرتبطة الطارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة ضغط النيتروجين إلى 25 PSI لالليبوزومات 400 نانومتر، 125 رطل عن الليبوزومات 100 نانومتر، والمبادرة لالليبوزومات 400-500 نانومتر 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاهدة SUSP الحويصليةension كما يقذف في وعاء في حين يتم دفعها من قبل النيتروجين. الحفاظ على تدفق النيتروجين حتى لم تعد مراقبة أي يمر السائل خلال فلتر الطارد في قنينة زجاجية. </li></ol> 4. ديناميكية تشتت الضوء (DLS) تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز 50 ميكرولتر من حل الحويصلية 20 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصدر القوة ومصدر مصباح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج DynaPro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع برنامج لنموذج الخوارزمية MS / X للكشف عن الليبوزومات من 30 نانومتر و 100 و MS800 نموذج خوارزمية للكشف عن&gt; الليبوزومات 100 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصل إلى الأجهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 14 ميكرولتر من عينة الحويصلية في كوفيت الكوارتز وتضاف إلى صاحب الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على بدء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط توقف بعد ~ 20-30 الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل متوسط ​​قمم بقطر الحويصلية المسجلة على الرسم البياني. </li></ol> 5. جسيمات متناهية الصغر تحليل تتبع (NTA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ميكرولتر 500، 0.1 ميكرومتر الحويصليةحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف حجرة العينة مع الماء والايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف مقصورة عينة مع منشفة ورقية خالية من الوبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الليزر مصدر قوة والكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليم 300 ميكروليتر من محلول 0.1 ميكرومتر الحويصلية إلى حجرة العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح السيطرة على درجة الحرارة وتحليل تتبع البرامج جسيمات متناهية الصغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر التقاط لتشغيل الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام التعديلات الأفقية والعمودية لنقل مرحلة وضبط التركيز المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة المطلوبة (20 درجة مئوية)، وتسجيل الوقت (على الأقل 30 ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر سجل لاتخاذ إطارات صور متعددة من الجسيمات الحويصلية لفترة محددة من الزمن. تحليل قمم المقابلة لالاحجام الحويصلية قطرها على الرسم البياني لأنها تتبع حركة كل جسيم. </li></ol> 6. ممثل النتائج وهناك مخطط يحدد طريقة البثق هو عاستياء في الشكل 1. للحصول على أفضل النتائج، وإعداد الليبوزومات بأقطار من 30 نانومتر يتطلب الضغط العالي من المبادرة 500 ~ وبأقطار من 100 نانومتر يتطلب الضغط من 125 رطل لتحقيق معدل سريع مرشح. لبأقطار من 400 نانومتر، ويوصى الضغط المنخفض من المبادرة 25 ~ لتحقيق أبطأ معدل التصفية، والذي يسمح الحويصلات إلى استطال وتشكل أكبر، الليبوزومات متجانس. أجرينا سلسلة من التجارب لتحديد ضغط الأمثل لإنتاج أحجام متناسقة حويصلة الفرعية ميكرون. تباينت نحن الضغط فضلا عن عدد من قذف يمر عبر مرشحات البولي مع أحجام المسام من 30، 100، و 400 نانومتر، واكتشفت الضغط المناسب لكل الحجم المطلوب. لمسام نانومتر 30، وضغط أقل من 500 رطل خفض معدل تدفق، مما تسبب في استطالة وأحجام أكبر وبالتالي حويصلة. لمسام 100 نانومتر، تم التوصل إلى تدفق مستمر في 125 رطل. لمسام 400 نانومتر، وضغط منخفض (25 رطل) يسمح للحويصلات إلى استطال إلى S أكبر حويصلةizes. وبطء تدفق الترشيح الانقطاع عن الحكمة هو الأمثل لخلق أكبر الفرعية ميكرون الحويصلات 13. أجرينا DLS لتحديد أحجام الحويصلية مقذوف من خلال ثلاثة أحجام مختلفة القطر، أي 30 و 100 و 400 نانومتر. DLS هو أسلوب المنشأة التي تقوم بتجميع الضوء المتناثرة لتحديد قطرها جسيم. نحن الليبوزومات رطب مقذوف من 2 ملم من خلال غشاء البولي نانومتر 30 في 500 رطل مع 5 تمريرات من خلال مسام فلتر؛ من 100 نانومتر غشاء البولي عند 125 رطل مع 5 تمريرات من خلال مسام فلتر و400 نانومتر غشاء البولي عند 25 PSI مع 2 يمر عبر فلتر المسام. كانت بأقطار من الليبوزومات وتقاس DLS لمدة 30 أحجام 100 و 400 نانومتر، والمسام 66 ± 28، 138 ± 18 و 360 ± 25 نانومتر (الشكل 2). تم استخدام نظام التعليق من 50 حبات البوليستيرين نانومتر كمعيار المعايرة كما هو موضح في الشكل رقم 2، حيث سجلت قطر من 47 ± 16 نانومتر. في المئة polydispersity يبين أنه لا يوجد تداخل في أحجام الحويصلية. انه يعتبر نموذجا لمراقبة بأقطار أعلى من 30 نانومتر عند استخدام DLS تحليل نظرا لانحياز يعرف هذا الصك لديها نحو الجسيمات الأكبر حجما 12. يتم جمع شدة تبعثر الضوء من الجزيئات الكبيرة والصغيرة في وقت واحد من اكتشاف طريقة واحدة وبالتالي من الصعب حل الليبوزومات في تعليق 12. على الرغم من هذا القيد مفيدة، منحنى المعايرة توضح وجود علاقة خطية القريب. NTA هي التكنولوجيا الجديدة التي يقيس حجم كل جسيم من الرصد المباشر لنشرها في وسيلة السائل، ومستقلة عن معامل الانكسار جسيم أو كثافة. ويمكن استخدام هذه التقنية عالية الدقة لاستكمال قياس الليبوزومات مع دائرة الأراضي والمساحة. سجل NTA بأقطار من 95 ± 48 و 356 ± 51 نانومتر، واثنين من 100 نانومتر و 400 نانومتر حلول البوليسترين كانت تستخدم لمعايرة. وقد لوحظت حلول الدهون من 30 نانومتر و 100 نانومتر لديها أكثر شركات<html> قطر الصالحة للزراعة بالنسبة لدائرة الأراضي والمساحة كما هو مبين في الشكل (3)، وإنتاج أحجام متوسط ​​من 29 ± 14 و 95 ± 17 و 359 ± 73 نانومتر. قد يكون هناك بوادر تقنية توصيف أكثر عمومية لتحديد الجزيئات المجهرية منذ حساسيتها يتيح لها قياس الجسيمات 50 - 1000 نانومتر. منحنى المعايرة ويبين وجود علاقة خطية بين مسام غشاء البولي مقابل القطر NTA المسجلة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الحويصلية مقاسات </td><td> الكشف عن عتبة </td><td> يتوقع حجم الجسيمات الحد الأدنى (نانومتر) </td></tr><tr><td> 30 نانومتر </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 نانومتر </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 نانومتر </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. معلمات Nanosight. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. الرسم البياني لطريقة البثق، واصفا كيف الضغط وتدفق النيتروجين تسيطر على تجانس بأقطار مختلفة الحويصلية. بعد ترطيب الحويصلية، حويصلات unilamellar من أحجام مختلفة تنبثق من خلال مختلف البولي غشاء المسام مرشح على الضغوط المختلفة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> الشكل 2. الديناميكي ضوء التشتت (DLS) بيانات تصف الأحجام الكمية الحويصلية بعد قذف. (أ) وتظهر الرسوم البيانية لوصف بأقطار من العينات 3 الحويصلية. تم استخدام معيار المعايرة من الخرز نانومتر 50 (PS) البوليسترين كمرجع. يشار إلى أن متوسط ​​أقطار الحويصلية فوق العارضة عن كل عينة. المحور س يصف أحجام المسام من الحلول التي كانت تنبثق من خلال. في محور y يصف قطر التي سجلتها دائرة الأراضي والمساحة. على الرغم من أن 30 و 100 نانومتر سجل أحجام نانومترإد قيم أعلى من أحجامها المسام في حين زاد حجم 400 نانومتر سجلت حجم أقل قليلا، ومنحنى المعايرة (ب) تبين وجود علاقة خطية القريب، حيث المحور س يعبر عن مسام غشاء البولي الأحجام، ومحور y يصف سجلت قطر الحويصلية من قبل دائرة الأراضي والمساحة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> شخصية تتبع جسيمات متناهية الصغر 3. تحليل (NTA) بيانات تصف أحجام الحويصلية بعد قذف. (أ) الرسوم البيانية تمثيل قطر كل عينة الحويصلية. المحور س يصف أحجام المسام من الحلول التي كانت تنبثق من خلال. في محور y يصف حجم قطرها التي سجلتها الهيئة الوطنية للمواصلات. وصفت وبأقطار متوسط ​​الحويصلية فوق كل عينة. (ب) منحنى معايرة NTA يبين وجود علاقة خطية أكثر من منحنى المعايرة DLS بين أحجام مسام غشاء مرشح مقابل القطر مسجل. المحور س يصف مسام غشاء أحجام البولي. في محور y يصف قطره مسجل الحويصلية من قبل الإدارة الوطنية للسياحة. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> الشكل 4. السلبية الإلكترون انتقال صمة ​​عار المجهري (تيم) وصور تظهر حجم كل الحويصلية (500 ميكرومتر)، يليه قذف. وقد خرج سلبا الكربون Formvar شبكات سلكية قبل تلطيخ عينة، حيث تم استخدام 1٪ خلات اليورانيل في الماء إلى وصمة عار على العينات قبل عملية التجفيف والتصوير في التكبير × 34000. أحجام 30 و 100، و 400 نانومتر بشكل واضح متميزة عن بعضها البعض. تم تعيين التكبير إلى 25000 ×. شريط مقياس يمثل 0.5 ميكرون. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> الشكل 5. أجريت تجربة للوقت بطبيعة الحال مع ثلاثة أحجام الحويصلية. وقد تم قياس ديناميكية تشتت الضوء (DLS) لكل حل الحويصلية قذف التالية مباشرة. تم تخزين جميع الحلول الحويصلية في 4 درجاتC بين عشية وضحاها. وسجلت قطر من قبل دائرة الأراضي والمساحة بعد حضانة بين عشية وضحاها. وقد لوحظ قليل من دون تغيير بعد فترة حضانة استمرت 16 ساعة.

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

باستخدام Liposofast Avestin LF-50 الطارد، أثبتنا كيف صغيرة الحجم، يتم إعداد الليبوزومات الاصطناعية من خلال نظام الضغط التي تسيطر عليها. من المهم أن نلاحظ أن الحويصلات الصفاحات تشكل عفويا بعد ترطيب الحويصلية، مما قد يؤدي إلى إنتاج أصغر النانوية. وهذه الحويصلات الصغيرة الصفاحات يتدفق حتما من خلال حجم أكبر البولي مسام الغشاء، مما تسبب في عدم التجانس في الحلول من الحويصلات unilamellar المسام التي تنتجها مصفاة كبيرة. ولذلك، فمن المستحسن للحد من ضغط تدفق النيتروجين عند استخدام أحجام المسام الكبيرة (أي 25 رطل لقطرها 400 نانومتر مسام كما هو موضح أعلاه)، وذلك لإعطاء نسبة الدهون وقتا كافيا لصهر واستطال إلى الحويصلات أكبر، وزيادة تجانس الحل. لالليبوزومات بأقطار من 100 نانومتر &lt;، وارتفاع الضغط (أي 400-500 رطل لمدة 30 و 100 نانومتر كما هو موضح أعلاه) بطلب للحصول على قذف السريع لزيادة كفاءة احتباس الدهونوحجم التجانس. ويوصى باتخاذ خطوات قليلة بارزة لضمان، استنساخه دقيق إعداد الحويصلية. فمن الأفضل لتحضير حويصلات مع حجم الحد الأدنى من 3.0 مل من عينة لقذف باستخدام الطريقة الموصوفة. وسوف العينات بتركيزات الدهون فوق 2 مم تتطلب ارتفاع ضغط النيتروجين من المبادرة 500&gt; لأقطار &lt;100 نانومتر، والتي ينبغي أن تتم بحذر بالنظر إلى أن مثل هذا الضغط هو أبعد من الحد الأعلى فعال. وهناك توصية من التمريرات المتكررة (5 ~ 7 reiterations) من خلال مرشح الطارد تحسين تجانس حل حويصلة. وسوف تستخدم قارورة من الزجاج والمحاقن لإعداد عينة منع أي تسرب من أنابيب البولي بروبلين التي يمكن أن تلوث العينة الحويصلية. ومن الأهمية بمكان أيضا لتصفية الليبوزومات الناتجة ممكن لإزالة أي جزيئات الغبار المتبقي. في الطريقة الموصوفة أعلاه، لقد استخدمنا طريقتين لوصف أحجام الحويصلية، ناماعل DLS وNTA. وأظهرت وجود علاقة بين التقنيات قرب خطي بين أحجام المسام مقابل القطر الفعلي الحويصلية المرصودة. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن تضع في اعتبارها أن لوحظ وجود تباين كبير إحصائيا، ولكن لا أساس له من الحويصلات الدهنية باستخدام أساليب توصيف على حد سواء. وباختصار، لقد وصفنا أسلوبا جيدا للرقابة لإنتاج نانو الحجم الليبوزومات الاصطناعية مع الاتساق والكفاءة العالية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الكلوروفورم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 02432-25ML </td><td> 95٪ مثبتات </td></tr><tr><td> الدرجة العالية للميثانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 الطارد </td><td> Avestin، المؤتمر الوطني العراقي. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الفوسفورية </td><td> الدهون أفانتي القطبية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> المسامات البولي </td><td> Avestin، المؤتمر الوطني العراقي. </td><td></td><td> قطره 25 ملم </td></tr><tr><td> استنزاف أقراص PE </td><td> Avestin، المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> 230600 </td><td> قطره 25 ملم </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

يصف هذا بروتوكول طريقة قذف لإعداد الحويصلات الدهون من دون ميكرون الأحجام مع وجود درجة عالية من التجانس. هذا الأسلوب يستخدم نظام الضغط التي تسيطر عليها مع تسيطر عليها معدلات تدفق النيتروجين لإعداد الحويصلية. ودهن إعداد<sup&gt; 1،2</sup&gt;، سيتم تقديم قذف الحويصلية، وتوصيف حجم هنا.

ثابت الطريقة النتوء الضغط التي تسيطر عليها لإعداد الحويصلات الدهن نانو الحجم

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.9K Views.  University of Colorado Boulder. يصف هذا بروتوكول طريقة قذف لإعداد الحويصلات الدهون من دون ميكرون الأحجام مع وجود درجة عالية من التجانس. هذا الأسلوب يستخدم نظام الضغط التي تسيطر عليها مع تسيطر عليها معدلات تدفق النيتروجين لإعداد الحويصلية. ودهن إعداد 1،2، سيتم تقديم قذف الحويصلية، وتو...

Video: Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

طريقة محسنة لإعداد النوع الأول الكولاجين من الجلد

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

أأليسيا إعداد Ganglia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية المفردة

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

الصلبة الدهون النانوية (SLNs) لاستهداف التطبيقات بين الخلايا

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

فيلم بثق<em&gt; كرنب abyssinica</em&gt; / القمح الغلوتين الأخلاط

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.