עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר ממכון הבריאות הלאומי (HL068915 לDBC), פרס חוקר חדש מקרן מחקר Thrasher (לCAP), גרנט-in-Aid מאיגוד הלב האמריקאי (12GRNT11910008 לDBC) , מענק מחקר מהקרן לילדים לב (לDBC), ותרומות לבית החולים לב ההולכה הקרן לילדים בבוסטון, קרן ריאן המשפחתית, ועל ידי דוד פולמן.

להלן נדגים את בידודה של col1 מעור כבש. כפי שנכתב, פרוטוקול זה יכול לשמש גם לבודד בהצלחה col1 מארנב ועור אנושי. 1. היכונו לדוגמא Dermal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את כל חומרים כימיים כדי 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את עורי מדגם (25-50 גר &#39;) ב DH קר כקרח 2 O והסר את כל צמר, פרווה, או שיער עם קרם מקריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין גילוח חד קצה לגרד נקי הדגימה של רקמת שומן וחיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המדגם בקר כקרח DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את דגימת העור ל1 סנטימטר x חתיכות 1 סנטימטר בסכין גילוח חד קצה. </li></ol> 2. הסר Noncollagenous solubilized חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 5 גרם של מדגם בצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהוסיף 30 מיליליטר של 0.5 נתרן אצטט M קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים צינורות 1 דקות ב6 ההגדרה מ &#39;/ השנייה באמצעות מתאם 50 צינור מיליליטר בhomogenizer ספסל העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וחזור על פעולה עבור סכום כולל של 7 מחזורים לשטוף נתרן אצטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המדגם ב DH קר כקרח 2 O ולערבב פעם אחת כדי להסיר נתרן אצטט שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במרית כדי לדחוס את המדגם על הצד של הצינור כדי להסיר נוזל עודף ולאחר מכן להעביר לצינור חרוטי 50 מיליליטר טרי. </li></ol> 3. הקלד אני קולגן הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם פעמיים ב 2 מיליליטר / גרם 0.075 M חיץ ציטרט הנתרן 1 דקות ב6 מ &#39;/ השני בhomogenizer ספסל העליון דחיסת המדגם ושלכת supernatant לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת aliquot 2 מיליליטר / גרם טרי של 0.075 חיץ ציטרט M נתרן לדוגמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 6 דקות 1 רציפה, 6 מחזורי תמהיל homogenizer ספסל העליון מ &#39;/ שנייה של תסיסה מבלי להסיר את החיץ בין כל מחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant העבה, ברור לצינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חיץ ציטרט נוסף 1 מיליליטר / גרם 0.075 M נתרן למדגם ולבצע agita homogenizer אחד סופי ספסל העליוןמחזור tion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת supernatant זה סופי לצינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור האיסוף ב3,200 XG 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לתא העליון של משקל מולקולרי 100,000 נותק מכשיר מסנן צנטריפוגלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 3,200 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר col1 מטוהר מהתא העליון לצינור נקי חרוטי ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).</li><li>Pacak, C. A., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+myogenic+engineered+tissue+constructs.">Fabrication of myogenic engineered tissue constructs.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li><li>Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+characterization+of+collagen+with+or+without+telopeptides+from+chicken+skin.">Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin.</a> Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).</li><li>Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+soluble+collagens.">Preparation and properties of soluble collagens.</a> Methods in Enzymology. , (1963).</li><li>Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+purification+of+collagen+type+I+for+tissue+engineering+applications.">Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).</li><li>Ohan, M. P., Dunn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stabilizes+collagen+sterilized+with+gamma+irradiation.">Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).</li><li>Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+the+sterilization+effect+of+gamma+ray+irradiation+of+immobilized+collagen+polypropylene+nonwoven+fabric+surfaces.">The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).</li><li>Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+on+patterned+collagen+films:+an+in+vitro+study.">Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study.</a> Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).</li><li>Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+femtosecond+laser+patterning+of+collagen+for+directed+cell+attachment.">3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment.</a> Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

מרכיב חיוני בשיטה זו הוא יעילה הדחיסה החוזרת של דגימת עורי להסיר את הנוזל עודף. זה קריטי כדי להסיר כמה שיותר נתרן אצטט ככל האפשר בשלב 2.5 ידי דחיסת המדגם. אנו משתמשים במרית כדי לדחוס את העור מפני הצד של הצינור, אך יכולה לשמש גם גזה, אם כי זה יחייב ההסרה של המדגם מהצינור ולהגדיל את הזמן הנדרש לביצוע פעולות אלה. כמו כן, חשוב כדי לדחוס את המדגם בשלב 3.1 כך שהנפח של ציטרט הנתרן הוא מדויק בצעדי חילוץ שלאחר מכן. אי להסיר כראוי נוזל מהמדגם בכל אחד מהשלבים הבאים תהיה השפעה מזיקה על תשואת col1 הסופית. מרכיב מרכזי נוסף לפרוטוקול זה הוא לשמור על כל ריאגנטים ב 4 ° C. זה מבטיח את המיצוי יעיל של col1 solubilized חומצה ומונע גיבוש של קולגן. בנוסף, ההליך יכול להתבצע באמצעות כלריאגנטים סטרילי בסביבת סטרילית. זה יהיה חשוב במיוחד לכל מי שרוצה להעסיק בשיטה זו כדי לבודד col1 לשימוש בבני אדם. מקורות מסחריים רבים של col1 כבר מעוקרים ביעילות על ידי גמא הקרנה. למרבה הצער, בפועל זה מקטין באופן משמעותי את יכולתו בצורת ג&#39;לים בשל פיצול חלבון ו9,10 denaturation. הליך זה מייצג את התנאים אופטימליים למיצוי col1 כפי שנקבע מניסויים רבים שבוצעו כדי לקבוע את השיעור האידיאלי של דגימת עורי לחיץ עוצמת קול. התוספת של יותר צינורות הוא הציע כאשר החוקר מבקש להפעיל על הליך זה עבור דגימות עור גדולות יותר. בהתבסס על הניסיון שלנו, זה לא מומלץ להוסיף יותר מדגם או חיץ יותר ממצוין לצינור אחד. כמו כן, ראוי לציין כי חרוזים מורכבים מסיליקה, גארנט, תחמוצת אלומיניום, סיליקון קרביד, או תחמוצת קרמיקה, זירקוניום, אשר משמשות בדרך כלל בשיתוף עם בhomogenizers ench העליון, הושמט מההליך שלנו. 6 מחזורי התסיסה 1 דקות רציפים מתוארים בשלב 3.3 נחוצים בשל הגבלה שהוטלה על ידי ציוד התסיסה שלנו. אנחנו יכולים רק להתסיס את המדגם עבור סכום כולל של 60 שניות בכל פעם, לאחר שהמכונה דורשת להפסיק. אם יש ציוד שניתן להגדיר עבור 6 דקות ישר, זה היה צפוי להיות בסדר כדי לעבור לאחד, מחזור של שש דקות. אנחנו, לעומת זאת, מצביעים על הקפדה על הכרכים במשקל וחיץ מדגם מתוארים. מצאנו שיטת הכנה זו ביעילות מבודדת col1 מסיס מכבש, ארנב, ודגימות עור אנושיות 8. מצד השני, בפרוטוקול זה לא היה מוצלח בטיהור col1 מדגימות עור חזיריות. אפילו עם שינויים נרחבים בשיטה, הדרמיס חזירי מיוצר סכום מופקע של קצף בגלל שומני שייר ושומן וכתוצאה ממיצוי col1 לא יעיל. לעומת זאת, יכול להיות מטוהר col1 מזנבות עכברים שלמיםאו מבודד גידי זנב חולדה באמצעות הכנה שונה מעט, הכוללת חרוזים מטריצת lysing. זו תוארה בעבר בפירוט 8. עבור מדעני מחקר, השימושים האפשריים של המוצר הסופי col1 חומצת solubilized שהושג באמצעות שיטה זו כוללים: א) מתן מצע דבק לצלחות תרבות לתמוך מצורף תא ושגשוגם, ב) מיקרו דפוסים של משטחים - 2 או 3 - ממדי (2 - או 3-D) תרבית תאים, וג) יצירת פיגומי 3-D עבור יישומי הנדסת רקמות. בעוד שחלק מכמות קטנה של שונות הרבה להרבה שניתן לצפות מכל שיטת טיהור, מצאנו כי הכנות col1 נוזל אלה הן באופן עקבי יכולים להיות משולב עם אוכלוסיות תאים שונות ונוצק לתוך תבניות. בנטרול החומציות וההתחממות, התוצאה היא רקמה מהונדסת הקרושה לבנות עם תאי מרחבית אוריינטציה מופצים באופן שווה לאורך כל המטריצה. בהתאם לצורה שלעובש, יכול להתבצע המבנים הללו כמעט בכל צורה וגודל 3,4,11-14. לסיכום, להערכתנו הסיבה משכנעת ביותר לנצל בשיטה זו היא שהיא מפחיתה באופן משמעותי את הזמן ומאמץ הדרוש כדי לבודד מאוד טהור col1, מסיס ממקור רקמות עצמי כגון ביופסיות עור קטנות. השיטה מבוססת על נהלים ותיקים ומייצרת מוצר שעומד בדרישות באיכות של תכשירים מסחריים יקרים ביחס לטוהר col1 והיכולת ליצור רקמות 3-D יציבים. במקביל, שיטה פשוטה זו מאפשרת בידוד יעיל ומהיר של col1 autologously נגזר, שניתן להשתמש בבטחה למספר רב של יישומים קליניים.

במשך עשרות שנים, חוקרים וספקים מסחריים יש לבודד col1 solubilized ממגוון של מקורות, כולל רקמת עור וגידים באמצעות גרסה כלשהי של פרוטוקול פשוט הפקת חומצה ואחרי נטרול, שתוצאתה resuspension של מטריצה ​​של סיבי col1 מאורגנים שניתן להשתמש בי עבור מספר רב של יישומים ביו 1-4. אמנם יש דוגמאות רבות של יישומים קליניים לcol1, כמה מהם להעסיק col1 autologously נגזר בגלל הכנה של חלבון זה דורשת עקירות ארוכות לוקחת ימים או שבועות כדי לבצע 5-7. כתוצאה מכך, חוקרי מחקר ורופאים בדרך כלל להשתמש בתכשירים יקרים, מסחריים של col1 שהוכנו באמצעות רקמות אנושיות כגון חולדה, שור, או גלד חזירי או באמצעות עור הוסר מן הגופות או בעקבות מילת גברים. עבור יישומי משובי, רבים של השתנות אלה תערוכת מוצרים ביחס ליכולת שלהם לצורה מוצקהמטריצות או מבני רקמות מסוגלים לתמוך מצורף תא וצמיחה. כתוצאה מכך, יש צורך מובהק לשיטה סטנדרטית חדשה שנועדה לחלץ במהירות col1 ממקורות רקמות עצמיים נגישים ושפע. שיטה כזו תחסוך זמן וכסף במסגרת המחקר שבו col1 אפשר להפיק ממודל החיה של עניין ומשמש לבדיקה קליני של רקמות מהונדסות התאספו על פיגומים מבוססי קולגן. במקביל, יש את האפשרות של שימוש במהירות col1 מבודד, autologously נגזר במרפאת יגדיל את הבטיחות הכוללת של חולים שאמורים היה לקבל אלוגנאית או תכשירי xenogeneic. לחולים שקבלו הכנת autogeneic, שיטה יעילה זה תהיה לצמצם במידה ניכרת את המרווח בין אוסף ביופסיה ויישום קולגן. מסיבות אלה, בקשנו לשפר את שיטת בידוד וטיהור col1 הוקמה ארוך באמצעות AG במהירות גבוההitation וצנטריפוגה בגודל הדרה. שיטה זו היא פשוטה לביצוע באמצעות מאגרים סטנדרטיים וציוד שנמצאו במעבדות רבות. על ידי העסקת תסיסה במהירות גבוהה, הפרוטוקול שלנו מקטין את הזמן הדרוש כדי לבודד מסיס col1, עורי מכ 10 ימים פחות מ 3 שעות 8. חשוב מכך, בשיטה זו ניתן לבצע בקלות בסביבה הקלינית על מנת להכין col1 autologously נגזר לשימוש בחולים בקבוצה אחת של נהלים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

סוג מסיס קולגן 1 (col1) נעשה שימוש נרחב כמצע דבק לתרביות תאים ופיגום סלולארי ליישומי רגנרטיבית. מבחינה קלינית, חלבון זה נמצא בשימוש נרחב עבור ניתוחים קוסמטיים, זריקות עורי, השתלת עצם, וניתוח שחזור. מקורות col1 לנהלים אלה הם בדרך כלל לא אנושיים, דבר המגדיל את הפוטנציאל לדלקת ודחייה, כמו גם העברת מחלות xenobiotic. לאור זאת, בשיטה יעילה ומהיר כדי לטהר col1 מכמויות מוגבלות של רקמות autologously נגזרות תעקוף רבות של בעיות אלה, עם זאת, פרוטוקולי בידוד סטנדרטיים הם ארוכים ולעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של collagenous רקמות. הנה, אנחנו מדגימים שיטת חילוץ col1 יעילה המפחיתה את הזמן הדרוש לבודד ולטהר חלבון זה בערך מ 10 ימים פחות מ 3 שעות. אנחנו בחרנו בדרמיס כמקור לרקמות שלנו בגלל זמינותו בהרבה ניתוחים. Tהשיטה שלו משתמשת במאגרי חילוץ מסורתיים בשילוב עם תסיסה חזקה וסינון צנטריפוגלי להשיג מאוד טהור col1, מסיס מכמויות קטנות של גלד. בקצרה, ביופסיות עורי נשטפות ביסודיות ב DH קר כקרח 2 O לאחר הסרת שומן, רקמת חיבור, ושיער. דגימות העור הופשטו מחלבונים והסוכרים noncollagenous באמצעות נתרן אצטט M 0.5 וhomogenizer ספסל העליון במהירות גבוהה. קולגן ממוצקי שיורי מופק לאחר מכן עם חיץ ציטרט הנתרן 0.075 M באמצעות homogenizer. תמציות אלה הם מטוהרים באמצעות 100,000 מסננים MW חתוכים הצנטריפוגלי שיניבו הכנות col1 באיכות דומה או עדיפה על מוצרים מסחריים או לאלה שהושגו באמצעות נהלים מסורתיים. אנו צופים בשיטה זו תאפשר הניצול של col1 autologously נגזר עבור מספר רב של מחקר ויישומים קליניים.

פרוטוקול בידוד col1 זה דורש כ 2 שעות ו15 דקות כדי להשלים. איור 1 מציג תרשים סכמטי המתאר את השלבים העיקריים בהליך זה. הכנת הדגימה וביצוע 7 המחזורים של הסתה במהירות גבוהה ושטיפות עם נתרן אצטט לוקחת כ 35 דקות (איורים 1 א-C). ביצוע תסיסה אחד ולשטוף מחזור עם DH 2 O לוקח כ 5 דקות (1D דמויות ו1E). הוספת ציטרט הנתרן והכפפת המדגם לתסיסה אחד ולשטוף מחזור ואחרי 6 מחזורים של תסיסה לוקח כ 45 דקות (1F דמויות ו1G). צנטריפוגה המוצקים שנותרו מהתמצית נוזלית לוקחת 15 דקות (איור 1H). לבסוף, העברת הדגימה למכשיר סינון וביצוע שלב צנטריפוגה אחרת להתרכז col1 המטוהרים, solubilized ולהסיר חלבונים קטניםלוקח 30 דקות (איורים 1I ו1J). המוצר הסופי הוא תכשיר מרוכז, מאוד טהור של col1 מסיס שניתן polymerized נוסף על ידי הוספת Na 2 HCO 3 ודוגרים על 37 ° C. תמונות מיקרוסקופ לעומת שלב זה התגבשו מוצר לחשוף סיבי col1 שיכול לשמש כמצע לתא מצורף לצלחות תרבית רקמה או לשמש כפיגום עבור יישומי הנדסת רקמות 3-D (2A דמויות ו2B). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51011/51011fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51011/51011fig1.jpg" /> איור 1. סקירה סכמטי של שיטת בידוד col1 המשופרת. א) הדרמיס פרוס מתווסף 50 מיליליטר צינור חרוטי. B) 0.5 נתרן אצטט M מתווסף למדגם. C)מדגם הוא נתון 7 המחזורים של תסיסה עם חיץ נתרן אצטט מוחלפים אחרי כל מחזור. ד) DH 2 O מתווסף מדגם העור. ה) ההכנה היא נתון המחזור של תסיסה וDH 2 O 1 הוא שפך את. F) 0.075 ציטראט M נתרן מתווסף למדגם. G) מדגם נתונה 6 מחזורים של תסיסה. H) המדגם centrifuged להסיר מוצקים גדולים. אני) supernatant מועבר למשקל מולקולרי 100,000 מנותק יחידת מסנן צנטריפוגלי ב צינור חרוטי. J) יחידה זו centrifuged והנוזל צמיג שנשאר בתא העליון נאסף. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51011/51011fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51011/51011fig2.jpg" /> איור 2. בידוד מהיר הלוך ושובהדרמיס מ &#39;להניב col1 polymerized לתוך סיבים. col1 מסיס נוטרל על ידי הוספת Na 2 HCO 3 ואז טופח על 37 ° C. תמונה בניגוד שלב () ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (המציג את D-banding השתמרות) (B) של סיבי col1 שנוצרו באמצעות שיטת הבידוד המהירה שלנו. ברים סולם = 10 מיקרומטר ו500 ננומטר (בהתאמה). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51011/51011fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

נהלים מסורתיים לבידוד של קולגן סוג מסיס 1 (col1) דורשים על 10 ימים מהתחלה ועד הסוף בגלל incubations חיץ הארוך ומייגע resuspensions של סיבים. כאן, אנו מתארים אמצעים כדי לטהר col1 מביופסיות עורי קטנים בפחות מ 3 שעות.

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

an-improved-method-for-the-preparation-of-type-i-collagen-from-skin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K Views.  Boston Children's Hospital.  נהלים מסורתיים לבידוד של קולגן סוג מסיס 1 (col1) דורשים על 10 ימים מהתחלה ועד הסוף בגלל incubations חיץ הארוך ומייגע resuspensions של סיבים. כאן, אנו מתארים אמצעים כדי לטהר col1 מביופסיות עורי קטנים בפחות מ 3 שעות. 

Video: An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

הדמיה גידים קולגן המפוגל<em&gt; בvivo</em&gt; ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; באמצעות הכלאה-מופעל על תמונה של Caged קולגן כוזב פפטידים

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a nano-scale. As such, traditional methods of describing implant surfaces -&#160;namely numerical determinants of surface roughness -&#160;are inadequate for predicting in vivo performance. Biomechanical testing provides an accurate and comparative platform to analyze the performance of biomaterial surfaces. An improved mechanical testing method to test the anchorage of bone to candidate implant surfaces is presented. The method is applicable to both early and later stages of healing and can be employed for any range of chemically or mechanically modified surfaces -&#160;but not smooth surfaces. Custom rectangular implants are placed bilaterally in the distal femora of male Wistar rats and collected with the surrounding bone. Test specimens are prepared and potted using a novel breakaway mold and the disruption test is conducted using a mechanical testing machine. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate and reproducible means for isolating an exact peri-implant region for testing.

An improved method to mechanically test bone anchorage to candidate implant surfaces is presented. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate means to direct the disruption forces to an exact peri-implant region.

מכונות בדיקת שיטה משופרת להערכת Anchorage עצם השתל

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

רקמות טחונות ב הדחוס קולגן: A Biotransplant המכיל נייד עבור תיקון Reconstructive המבוים יחיד

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...