Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von den National Institutes of Health (HL068915 zu DBC), einem New Researcher Award von der Thrasher Research Fund (CAP), ein Grant-in-Aid von der American Heart Association (12GRNT11910008 zu DBC) unterstützt ein Forschungsstipendium von der Kinderherzstiftung (DBC) und Spenden an die Kinderklinik Boston Erregungsleitungsfonds, der Ryan Familiengröße, und von David Pullman.

Hier werden wir die Isolierung von COL1 aus Lammfell zu demonstrieren. Wie geschrieben, kann dieses Protokoll auch verwendet, um erfolgreich von Kaninchen und die menschliche Haut zu isolieren COL1 werden. 1. Bereiten Dermal Beispiel <ol><li> Ins Gleichgewicht alle Reagenzien auf 4 ° C vor der Verwendung. </li><li> Spülen Hautprobe (25-50 g) in eiskaltem dH 2 O und entfernen Sie alle Wolle, Fell oder Haare mit Enthaarungscreme. </li><li> Verwenden Sie einen einzelnen Rasierklinge, um die Probe frei von Bindegewebe und Fett zu kratzen. </li><li> Die Probe in eiskaltem dH 2 O spülen </li><li> Schneiden Sie die Hautprobe in 1 cm x 1 cm große Stücke mit einer einzigen Rasierklinge. </li></ol> 2. Entfernen kollagenen Solubilized Werkstoff <ol><li> Wiegen Sie 5 g der Probe pro 50 ml konischen Röhrchen und 30 ml eiskaltem 0,5 M Natriumacetat. </li><li> Mix Röhrchen für 1 min bei 6 m / sec Einstellung mit einem 50-ml-Tube-Adapter in der Tisch-Homogenisator. </li><li> Entsorgen supernatant und wiederholen Sie für insgesamt 7 Natriumacetat Waschzyklen. </li><li> Spülen Sie die Probe in eiskaltem dH 2 O und mischen Sie einmal, um Rest Natriumacetat zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie einen Spachtel, um die Probe gegen die Seite des Rohres zu komprimieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann übertragen auf ein frisches 50 ml konischen Röhrchen. </li></ol> 3. Typ-I-Kollagen-Extraktion <ol><li> Die Probe zweimal Waschen in 2 ml / g 0,075 M Natriumcitrat-Puffer für 1 min bei 6 m / sec in der Tisch-Homogenisator Komprimieren der Probe und Verwerfen des Überstandes nach jeder Wäsche. </li><li> Hinzufügen eines neues 2 ml / g Aliquot von 0,075 M Natriumcitrat-Puffer zu der Probe. </li><li> Führen sequentielle 6 1 min, 6 m / sec Tisch Homogenisator Mix Zyklen der Agitation, ohne den Puffer zwischen jedem Zyklus. </li><li> Übertragen Sie die dicke, klare Überstand in ein Sammelrohr. </li><li> Fügen Sie eine weitere 1 ml / g 0,075 M Natriumcitrat-Puffer auf die Probe und führen einen letzten Tisch-Homogenisator agitation Zyklus. </li><li> In diese letzte Überstand in ein Sammelrohr. </li><li> Das Sammelröhrchen zentrifugiert bei 3200 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand in der oberen Kammer eines Molekulargewicht von 100.000 abgeschnitten Kreiselfiltereinrichtung. </li><li> Zentrifugieren bei 3200 × g für 30 min bei 4 ° C </li><li> Übertragen Sie die gereinigten COL1 aus dem oberen Fach zu einer sauberen konischen Rohr und bei 4 ° C </li></ol>

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	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. 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F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.

Ein wesentlicher Bestandteil dieses Verfahrens ist die wiederholte effiziente Kompression der Hautprobe, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Es ist wichtig, so viel wie möglich Natriumacetat in Schritt 2.5 durch Komprimieren der Probe zu entfernen. Wir verwenden einen Spatel, um die Haut gegen die Seite der Röhre zu verdichten, jedoch könnte Gaze verwendet werden, obwohl dies die Entfernung der Probe aus dem Rohr erforderlich und erhöht die erforderliche Zeit, um diese Schritte durchzuführen. Ebenso ist es wichtig, um die Probe in Schritt 3.1 zu komprimieren, so dass das Volumen Natriumcitrat korrekt in den nachfolgenden Extraktionsschritte. Nicht ausreichend Flüssigkeit aus der Probe in einem dieser Schritte zu entfernen wird eine nachteilige Wirkung auf die endgültige COL1 Ausbeute. Eine weitere wichtige Komponente dieses Protokolls ist es, alle Reagenzien bei 4 º C zu halten, Dies gewährleistet die effiziente Extraktion von säuresolubilisiertem COL1 und verhindert die Verfestigung des Kollagens. Zusätzlich könnte das Verfahren durchgeführt werden unter Verwendung allersterile Reagenzien in einer sterilen Umgebung. Dies wäre für diejenigen, die diese Methode, um COL1 für den Einsatz beim Menschen isolieren beschäftigen besonderer Bedeutung sein. Zahlreiche kommerzielle Quellen für COL1 wurden effektiv durch Gamma-Bestrahlung sterilisiert. Leider ist diese Praxis stark reduziert seine Fähigkeit, Gele durch Protein-Fragmentierung und Denaturierung 9,10 zu bilden. Dieses Verfahren stellt die optimalen Bedingungen für COL1 Extraktion aus vielen Experimenten durchgeführt, um den idealen Anteil des dermalen Probe herzustellen Volumen Puffer bestimmt. Die Zugabe von mehr Rohren wird empfohlen, wenn der Prüfer wünscht, dieses Verfahren für größere Hautproben zu verwenden. Basierend auf unserer Erfahrung, es ist nicht ratsam, mehr Beispiel-Add-oder Puffer als für jedes Rohr angedeutet. Es ist auch erwähnenswert, dass Kügelchen aus Kieselsäure, Keramik, Granat, Aluminiumoxid, Siliziumcarbid oder Zirkoniumoxid, die üblicherweise in Verbindung mit b verwendet werden zusammenench-Top-Homogenisatoren, von unserem Verfahren verzichtet. Die in Schritt 3.3 beschrieben sequentielle 6 1 min Agitation Zyklen aufgrund einer Begrenzung durch unsere Agitation Ausrüstung verhängt erforderlich. Wir können nur die Probe zu rühren für insgesamt 60 Sekunden zu einer Zeit, nach der das Gerät erfordert einen Anschlag. Wenn man Geräte, die für 6 min gerade eingestellt werden kann, hat, würde es wahrscheinlich in Ordnung, zu einem, sechs-Minuten-Takt wechseln. Wir legen jedoch nahe, die strikte Einhaltung der beschriebenen Probengewicht und Puffervolumina. Wir haben gefunden, diese Herstellungsverfahren effizient isoliert löslich COL1 von Lamm, Kaninchen und menschlichen Hautproben 8. Auf der anderen Seite war das Protokoll nicht in die Reinigung COL1 aus Schweinehautproben erfolgreich. Selbst mit umfangreichen Modifikationen der Methode produzierte Schweine Dermis eine exorbitante Menge Schaum, weil der Restfette und Fett was zu einer ineffizienten COL1 Extraktion. Umgekehrt kann COL1 aus ganzen Rattenschwänzen gereinigt werdenoder isolierten Rattenschwanzsehnen mit einem leicht veränderten Vorbereitung, die Lysismatrix Perlen enthält. Dies wurde zuvor detailliert 8 beschrieben. Für Forscher, die Einsatzmöglichkeiten der endgültigen Säure solubilisierten COL1 Produkt unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten werden, umfassen: a) Bereitstellen eines Klebesubstrats für Kulturplatten Zellhaftung und-proliferation zu unterstützen, b) die Mikrostrukturierung von Oberflächen für 2 - oder 3 - dimensionalen (2 - oder 3-D)-Zellkultur, c) Erstellung von 3D-Gerüst für das Tissue Engineering-Anwendungen. Während eine kleine Menge Lot-zu-Lot-Schwankungen ist, von jedem Reinigungsverfahren erwartet werden kann, haben wir festgestellt, dass diese Flüssigkeit COL1 Zubereitungen sind durchweg in der Lage, mit verschiedenen Zellpopulationen kombiniert und in Formen gegossen werden. Nach Neutralisation des pH-Werts und Erwärmen, so ergibt sich ein verfestigter Werkgewebekonstrukt mit raumbezogenen Zellen über die gesamte Matrix gleichmäßig verteilt sind. Je nach der Form derForm, können diese Konstrukte in nahezu jeder Form und Größe 3,4,11-14 werden. Zusammenfassend ist es unsere Auffassung, dass der wichtigste Grund, diese Methode zu nutzen, ist, dass es reduziert die Zeit und Aufwand erforderlich, um hochreine, lösliche COL1 von einer autologen Gewebequelle wie kleine Hautbiopsien zu isolieren. Die Methode basiert auf langjährigen Verfahren auf der Grundlage und erzeugt ein Produkt, erfüllt oder übertrifft die Qualität der teuren kommerziellen Vorbereitungen in Bezug auf COL1 Reinheit und die Fähigkeit, stabile 3-D-Gewebe zu bilden. Zugleich ermöglicht dieses vereinfachte Verfahren das effiziente und schnelle Isolierung von autolog abgeleiteten COL1, die sicher für eine Vielzahl von klinischen Anwendungen verwendet werden können.

Seit Jahrzehnten haben Wissenschaftler und kommerzielle Anbieter solubilisierten COL1 aus einem Sortiment von Gewebequellen, einschließlich Haut und Sehnen mit irgendeiner Variation eines einfachen Säure-Extraktionsprotokolls, gefolgt von Neutralisation, die in einer Resuspendierung aus einer Matrix organisiert COL1 Fibrillen führt, die verwendet werden können, isoliert für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen 1-4. Zwar gibt es viele Beispiele für klinische Anwendungen für COL1, einige von diesen beschäftigen autolog stamm COL1 weil Herstellung dieses Proteins erfordert langwierige Extraktionen unter Tage oder Wochen auf 5-7 durchzuführen. Als Ergebnis der Forschung Forscher und Ärzte verwenden in der Regel teuer, Handelspräparate, die unter Verwendung von COL1 nicht-menschlichen Geweben wie Ratten, Rinder-, Schweine-oder Lederhaut oder über die Haut von Leichen entfernt oder nach der Beschneidung von Männern zubereitet werden. Für regenerative Anwendungen sind viele dieser Produkte zeigen Variabilität in Bezug auf ihre Fähigkeit, feste bildenMatrices oder Gewebe-Konstrukte in der Lage ist die Zellhaftung und Wachstum. Folglich gibt es einen deutlichen Bedarf für eine neue standardisierte Methode entwickelt, um schnell zu extrahieren COL1 aus zugänglich und reichlich autologen Gewebequellen. Ein derartiges Verfahren würde Zeit und Geld in die Forschung, in dem COL1 konnte aus dem Tiermodell von Interesse extrahiert und für die präklinische Prüfung von technischen Geweben auf Kollagenbasis Gerüste montiert werden zu speichern. Gleichzeitig würde mit der Möglichkeit, eine schnell isoliert, autolog stamm COL1 in der Klinik die allgemeine Sicherheit für die Patienten, die sonst erhalten würde allogenen oder xenogenen Vorbereitungen zu erhöhen. Bei Patienten, die eine autogenen Vorbereitung, würde dies die vereinfachte Verfahren stark das Intervall zwischen Biopsie-Sammlung und Kollagen-Anwendung zu reduzieren. Aus diesen Gründen haben wir versucht, auf eine lange etablierte COL1 Isolierung und Reinigung Verfahren unter Verwendung von High-Speed-ag verbessernitation und Größenausschluss-Zentrifugation. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen unter Verwendung von Standardpuffern und in vielen Labors gefunden. Durch den Einsatz von High-Speed-Agitation, reduziert unsere Protokoll die notwendige Zeit, um lösliche, Haut COL1 von etwa 10 Tagen auf weniger als 3 Stunden 8 zu isolieren. Wichtig ist, dass diese Methode kann leicht in der Klinik, um autolog stamm COL1 zur Anwendung bei Patienten während einer einzigen Reihe von Verfahren durchgeführt werden, vorzubereiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

Lösliche Typ-1-Kollagen (COL1) wird weitgehend als Klebstoff Substrat für Zellkulturen sowie als Zellgerüst für regenerative Anwendungen verwendet. Klinisch wird dieses Protein häufig für kosmetische Chirurgie, Hautinjektionen, Knochentransplantation, und rekonstruktive Chirurgie. Die Quellen der COL1 für diese Verfahren sind allgemein nicht-menschlichen, welche das Potential für eine Entzündung und Ablehnung sowie xenobiotischen Krankheitsübertragung erhöht. Im Hinblick darauf wäre ein Verfahren, um schnell und effizient zu reinigen COL1 von begrenzten Mengen von autolog abgeleiteten Gewebe umgehen viele dieser Probleme, jedoch sind Standardisolierungsprotokolle langwierig und erfordern große Mengen an kollagenem Gewebe oft. Hier zeigen wir ein effizientes COL1 Extraktionsmethode, die die benötigte Zeit, um von ungefähr 10 Tage zu isolieren und zu reinigen, dieses Protein auf weniger als 3 h reduziert. Wir wählten die Dermis als unsere Gewebequelle wegen seiner Verfügbarkeit in vielen chirurgischen Verfahren. Tseine Methode verwendet traditionelle Extraktionspuffer kombiniert mit kraftvollen Bewegung und Zentrifugalfiltration zu hochreinem, lösliche COL1 von kleinen Mengen von Lederhaut erhalten. Kurz gesagt, Hautbiopsien werden gründlich in eiskaltem dH 2 O nach Entfernen von Fett, Bindegewebe und Haare gewaschen. Die Hautproben werden von nicht-kollagenen Proteinen und Polysacchariden unter Verwendung von 0,5 M Natriumacetat und eine Hochgeschwindigkeitslabortisch-Homogenisators abgestreift. Kollagen von restlichen Feststoffen wird anschließend mit einer 0,075 M Natriumcitrat-Puffer unter Verwendung eines Homogenisators extrahiert. Diese Extrakte werden mit 100.000 MW Cut-off-Filter, die Kreisel COL1 Zubereitungen der vergleichbare oder überlegene Qualität, kommerzielle Produkte oder solche mit herkömmlichen Verfahren gereinigt, erhalten. Wir erwarten, dieses Verfahren die Verwendung von autologen abgeleiteten COL1 für eine Vielzahl von Forschungs-und klinischen Anwendungen zu erleichtern.

Diese COL1 Isolation Protokoll benötigt etwa 2 Stunden und 15 Minuten in Anspruch. Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm, das die Hauptschritte in diesem Verfahren. Herstellung der Probe und Durchführen der 7 Zyklen von Hochgeschwindigkeits-Agitation und spült mit Natriumacetat dauert etwa 35 min (Fig. 1A-C). Durchführen einer Agitation und spülen Zyklus mit dH 2 O dauert ca. 5 min (1D und 1E). Hinzufügen von Natriumcitrat und Unterwerfen der Probe einem Rühr-und Spülzyklus, gefolgt von 6 Zyklen von Rühren dauert etwa 45 min (Fig. 1F und 1G). Zentrifugieren der verbleibenden Feststoffe aus dem flüssigen Extrakt dauert 15 min (1H). Schließlich Übertragung der Probe auf eine Filtervorrichtung und Ausführen einer weiteren Zentrifugationsschritt, um das gereinigte, solubilisierte COL1 zu konzentrieren und zu entfernen kleine Proteinedauert 30 min (Abb. 1I und 1J). Das Endprodukt ist eine konzentrierte, hochreine Zubereitung von löslichem COL1, die durch Zugabe von Na 2 HCO 3 und Inkubation bei 37 ° C polymerisiert werden können, Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von dieser verfestigte Produkt offenbaren COL1 Fibrillen, die als Substrat für die Zellbindung an Gewebekulturplatten oder als Gerüst für die 3-D-Gewebe-Engineering-Anwendungen (2A und 2B) verwendet werden, dienen könnte. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51011/51011fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51011/51011fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der verbesserten COL1 Isolationsmethode. A) Geschnittene Dermis ist mit einem 50 ml konischen Röhrchen. Zugesetztem B) 0,5 M Natriumacetat wird zu der Probe gegeben. C) DieProbe 7 Zyklen von Rühren mit Natriumacetat-Puffer nach jedem Zyklus ersetzt unterworfen. D) dH 2 O auf der Hautprobe zugegeben. E) Die Zubereitung wird 1 Zyklus von Agitation und dH 2 O unterzogen wird abgegossen. F) 0,075 M Natriumcitrat wird auf die Probe. G) Die Probe wird auf 6 Zyklen der Agitation. H) Die Probe wird zentrifugiert, um große Feststoffe zu entfernen aufgenommen. I) Der Überstand wird zu einem Molekulargewicht von 100.000 aus Zentrifugen-Filtereinheit in schnitten übertragen eine konische Röhre. J) Diese Einheit wird zentrifugiert und die viskose Flüssigkeit, die im oberen Fach bleibt gesammelt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51011/51011fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51011/51011fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schnelle Isolierung herm Dermis COL1 zu Fibrillen polymerisiert ergeben. Lösliche COL1 wurde durch Zugabe von Na 2 HCO 3 neutralisiert und dann bei 37 ° C inkubiert Eine Phase Kontrast Bild (A) und TEM-Aufnahme (Anzeige der erhaltenen d-Banding) (B) von COL1 Fibrillen, die unter Verwendung unserer schnellen Isolationsmethode. Maßstabsbalken = 10 um und 500 nm (bzw.). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51011/51011fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Traditionelle Verfahren zur Isolierung von löslichen Typ-1-Kollagen (COL1) benötigen etwa 10 Tage von Anfang an wegen der langwierigen und mühsamen Puffer Inkubationen Resuspensionen von Fibrillen zu beenden. Hier beschreiben wir ein Mittel, um COL1 von kleinen Hautbiopsien in weniger als 3 Stunden zu reinigen.

Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Typ I-Kollagen aus der Haut

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

an-improved-method-for-the-preparation-of-type-i-collagen-from-skin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K Aufrufe.  Boston Children's Hospital.  Traditionelle Verfahren zur Isolierung von löslichen Typ-1-Kollagen (COL1) benötigen etwa 10 Tage von Anfang an wegen der langwierigen und mühsamen Puffer Inkubationen Resuspensionen von Fibrillen zu beenden. Hier beschreiben wir ein Mittel, um COL1 von kleinen Hautbiopsien in weniger als 3 Stunden zu reinigen. 

Serie: An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Forschung

Biotechnik

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Imaging denaturierten Kollagen-Stränge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Über die Photo-ausgelöst Hybridisierung von Caged Collagen mimetischen Peptiden

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a nano-scale. As such, traditional methods of describing implant surfaces -&#160;namely numerical determinants of surface roughness -&#160;are inadequate for predicting in vivo performance. Biomechanical testing provides an accurate and comparative platform to analyze the performance of biomaterial surfaces. An improved mechanical testing method to test the anchorage of bone to candidate implant surfaces is presented. The method is applicable to both early and later stages of healing and can be employed for any range of chemically or mechanically modified surfaces -&#160;but not smooth surfaces. Custom rectangular implants are placed bilaterally in the distal femora of male Wistar rats and collected with the surrounding bone. Test specimens are prepared and potted using a novel breakaway mold and the disruption test is conducted using a mechanical testing machine. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate and reproducible means for isolating an exact peri-implant region for testing.

An improved method to mechanically test bone anchorage to candidate implant surfaces is presented. This method allows for alignment of the disruption force exactly perpendicular, or parallel, to the plane of the implant surface, and provides an accurate means to direct the disruption forces to an exact peri-implant region.

Eine verbesserte mechanische Testverfahren zu Knochen-Implantat-Anchorage bewerten

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Zerkleinerte Gewebe in komprimierter Collagen: Ein zellhaltigen Biotransplant für einstufige rekonstruktive Reparatur

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...