نشكر سانتياغو سواريز لقراءة نقدية للمخطوطة وبيتي Cowgill للحصول على مساعدات في التصوير الفوتوغرافي. كما نشكر المراجعين المجهول لملاحظاتهم حرجة. ويدعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث جامعة ولاية ديلاوير.

1. إعداد بروتامين سلفات (PS) المغلفة أطباق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول 1٪ من سلفات بروتامين (PS) وذلك بإضافة 0.5 غرام من PS إلى 50 مل من منزوع الأيونات والماء المقطر (DDH 2 O) في أنبوب 50 مل المخروطية. يهز جيدا بسرعة عالية على شاكر مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة لضمان حل كامل للPS. يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل (تأكد من تذوب تماما مثل هلام راسب قبل كل استعمال) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كم تأخذ من 60 مم × 15 مم البوليسترين أطباق بتري ووضع كل من الأغطية وقيعان على مقاعد البدلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 1٪ محلول PS في كل طبق (سواء قيعان والأغطية يمكن استخدامها) ما يكفي لتغطية السطح، يترك لمدة 2 دقيقة على الأقل. الحل PS بقايا يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة في غضون 3 أشهر عند تخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان الأطباق PS المعاملة في دورق مملوء بالماء المقطر (DH 2 O). ترك الدورق تحت تشغيل DH 2 O على الأقل10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطباق PS المغلفة يمكن استخدامها على الفور أو الهواء الجاف للتخزين. تغطيتها لمنع تراكم الغبار. ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 شهر 3. </li></ol> 2. الحصول على قنفذ البحر الأمشاج وشل البيض على طبق PS المغلفة لحقن مكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قنافذ البحر تفرخ عن طريق هز أو حقن intracoelomic تصل إلى 1 مل من 0.5٪ بوكل للحث على تقلص العضلات الملساء للافراج عن الأمشاج 3 (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الحيوان هو من الذكور، كما يتبين من اللون الأبيض الحيوانات المنوية، وجمع الحيوانات المنوية الجافة من على سطح الأرض من حيوان في أنبوب 1.5 مل. ويمكن تخزين الحيوانات المنوية الجافة في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع دون خسائر كبيرة في الوظيفة البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الحيوان هو الأنثى، كما يتبين من اللون الأصفر بسبب محتوى صفار البيض، وجمع الأمشاج في بغمر gonopores في كوب كامل من الماء البحر. وسوف يتم الافراج عن البيض من gonopores ويستقر بفعل الجاذبية. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد البيض من الحطام مثل أشواك حيوان باستخدام 80 ميكرون نايلون شبكة التصفية. يتم تحقيق أفضل النتائج إذا تم استخدام البيض في غضون 5-7 ساعة بعد وضع البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dejelly البيض: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 مل من ماء البحر الحمضية لحوالي 1 مل من البيض. استخدام 0.5 M حمض الستريك لضبط درجة حموضة مياه البحر من 8.0 درجة الحموضة 5،1-5،2 ل. منخفضة للغاية لدرجة الحموضة ستنخفض الإخصاب وسوف عالية جدا من درجة الحموضة لا تسمح البيض لنعلق على لوحات PS المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البيض (وليس أكثر من 1 مل) لمياه البحر الحمضية والسماح للبيض ليستقر على الجليد لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك، إزالة هلام معطف يمكن أن تيسره يحوم طيف من البيض أثناء فترة العلاج. يمكن للمرء بشكل فعال dejelly S. البيض purpuratus في 3-4 دقيقة بهذه الطريقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب بعناية قبالة مياه البحر الحمضية، إضافة مياه البحر الطازجة وترك البيض يستقر على الجليد مرة أخرى. ويمكن تخزين البيض Dejellied على الجليد لمدة تصل إلى 6 ساعة دون مشاكل الإخصاب </li></ol></لى&gt; </ol> 3. الصف البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 إعداد حل M الاسهم من 3 aminotriazole (3-AT، MW = 84.08) عن طريق إذابة 0.84 غرام من 3-AT في 10 مل من DDH 2 O. يمكن تخزين هذا الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 ملم حل عمل 3-AT بإضافة 50 ميكرولتر من الحل 1 M الأسهم إلى 50 مل من ماء البحر prechilled. الحفاظ على الحل على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفم ماصة (الشكل 3) لمعالجة طيف من البيض: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم سحبها يدويا من غيض ماصة بال micropipettes الزجاج (100 × 1.09 مم OD). عقد micropipette بكلتا يديه على اللهب المكشوف. كما يبدأ في الذوبان الزجاج، وسحب بعناية نهايات ماصة في اتجاهات متعارضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتوصيل أحد سحبت ماصة لأنابيب البلاستيك (ID 1.14 ملم)، وختم ضيق مع parafilm. يجب أن يكون طول الأنبوب حوالي 50-70 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج العقيمة تصفيتها P20 أو P200 تلميح في نهاية العكس أنبوب للأنابيب الزجاج لأن تستخدم قطعة الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقطع نهاية من micropipette الزجاج مع مقص لضبط القطر من طرف. قطر الأمثل يتجاوز بقليل من القطر من البيض (80 ميكرون). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 4 مل من 1 ملم 3-AT مياه البحر في كل طبق PS المغلفة (القاع أو غطاء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ ماصة الفم، وضعت غيض P20/P200 في الفم وضمان الحصول عليها مع الأسنان. لنضح البيض، ونضح أول كمية صغيرة من مياه البحر. من خلال وجود عمود من السائل قبل تحميل البيض، واحد من السيطرة القصوى على تقنية pipetting لالفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف الطرف micropipette بالقرب من البيض ونضح بلطف في عدة مئات من البيض في ماصة. حصر البيض داخل micropipette الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> dejellied الصف البيض في خط مستقيم على طبق من قبل تهب بلطف لهم للخروج من ماصة الفم أثناء نقل معلومات سرية في خط مستقيم. الصف البيض الحق قبل الحقن، لأنه قد تحدث مشاكل الإخصاب بسبب عrolonged التعرض إلى 3-AT مياه البحر 3. علاوة على ذلك، يمكن لاصقة الموجبة مثل PS تكون سامة للبيض، وأنه ليس من المستحسن أن تعرض الأجنة لهذه الكواشف لفترات طويلة، وخاصة إذا تم إزالة المغلفات الإخصاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الصفر على الطبق بالقرب من خط البيض التجديف باستخدام ماصة الزجاج. وهذا الصفر من المهم كسر إبرة الحقن لضبط تدفق الحل حسب الحاجة. بدلا من ذلك، يمكن إجراء الصفر قبل صب مياه البحر 3-AT إلى الطبق. </li></ol> 4. Microinjection من البحر قنفذ بيضات ملقحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل محطة حقن مكروي. نحن هنا وصف استخدام نظام حقن FemtoJet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الشعيرات الدموية الحقن باستخدام مجتذب الإبرة. ويصور مثال على إبرة جيدة في الشكل 4. ملاحظة: للحصول على حقن الحمض النووي الريبي، ينبغي سابقة التجهيز الشعيرات الدموية حقن لتجنب التلوث RNAase 31: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشعيرات الدموية حقن 50 مل المخروطيةأنابيب وإضافة 50 مل من الميثانول تصفيتها / حمض الهيدروكلوريك (9:1). يهز جيدا وتترك طوال الليل لمدة لا تزيد عن 10 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي من الميثانول / حامض الهيدروكلوريك وشطف الشعيرات الدموية 2X مع الميثانول تصفيتها في نفس الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف الميثانول قدر الإمكان ويجفد الشعيرات الدموية بين عشية وضحاها لضمان إزالة كاملة من الميثانول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل بعناية الشعرية إبرة على حامل إبرة التحميل وتحميله مع &lt;0.5 ميكرولتر من محلول العينة باستخدام نصائح microloader. تتضمن حلول العينة عادة 20٪ الجلسرين، اعتمادا على المواد حقن 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق البيض مع التجديف على المسرح المجهر (البيض يجب أن تكون محاذاة عموديا عندما ينظر اليها من خلال العدسات) والتركيز على البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل بعناية الإبرة تحميلها على حامل microinjecting الإبرة وضبط الموقف من الإبرة لقمة مركزة تماما في وسط الميدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضغط على الزر لتطبيق الحد الأقصى للضغط FOص تنظيف الإبرة. الحل يجب أن يخرج من إبرة. ضبط ضغط إذا لزم الأمر: يجب أن يكون ضغط الحقن في نطاق 90-360 HPA، مع ضغط التعويض في ما يقرب من 1/3 من ضغط الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تدفق الحل عن طريق حقن في البويضة غير المخصبة. باستخدام عصا التحكم مياداة مجهرية، وإدارة غيض من إبرة الحقن إلى بيضة غير مخصبة. لتسهيل دخول الإبرة، وإنشاء يرتجف طفيف بواسطة التنصت لطيف من المرحلة مع كائن من الصعب مثل سائق المسمار. وينبغي أن ينظر إلى بلعة حقن تشكيل داخل البويضة (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان بلعة حقن غير مرئية، ورفع قليلا من رأس الإبرة فوق البيض، وتحديد موقع الصفر على طبق وتعديله ليكون وضع في وسط الميدان. بلطف اضغط على طرف الإبرة إلى علامة الصفر لكسر غيض من إبرة الحقن. ضبط الضغوط حقن والتعويض لضمان أن بلعة حقن لا يتجاوز 5/1 رانه القطر من البيض (1-2 مساء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم معايرة بلعة حقن، يخصب البيض بإضافة الحيوانات المنوية المخفف (1:1،000) أو 1-2 ميكرولتر من الحيوانات المنوية. تخلط جيدا بعناية لمنع طرد صف من البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مباشرة بعد الحقن يصبح المغلف الإخصاب مرئية (الشكل 5). التحرك على طول خط البيض التجديف باستخدام وحدة تحكم المرحلة وحقن العديد من بيضات ملقحة ممكن عن طريق بدس لهم الإبرة التي يسيطر عليها عصا التحكم مياداة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10-15 دقيقة، فإن البويضات المخصبة حديثا تصبح تصلب ولا يمكن حقن أي لفترة أطول. إزالة الطبق من مرحلة ونضح بعناية من الحيوانات المنوية في مياه البحر 3-AT باستخدام البلاستيك ماصة باستير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تدع بيضات ملقحة الجافة. بسرعة إضافة مياه البحر prechilled جديدة لتغطية الطبق. احتضان الأجنة في 15 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Delivery+of+DNA+and+Morpholinos+into+Mouse+Preimplantation+Embryos+by+Electroporation.">Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation.</a> Plos One. 7, 13 (2012).</li><li>Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).</li><li>Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+introduction+of+cloned+DNA+into+the+sea+urchin+zygote+nucleus,+and+fate+of+injected+DNA.">Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA.</a> Development. 102, 287-299 (1988).</li><li>Kinsey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+signaling+pathways+in+zebrafish+development+by+microinjection.">Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection.</a> Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).</li><li>Kola, I., Sumarsono, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+in+vitro+transcribed+RNA+and+antisense+oligonucleotides+in+mouse+oocytes+and+early+embryos+to+study+the+gain-+and+loss-of-function+of+genes.">Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes.</a> Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).</li><li>Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+secondary+head-forming+activity+of+microinjected+a+dagger+beta-catenin+mRNA+by+co-injected+spermine+and+spermidine+in+Xenopus+early+embryos.">Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos.</a> Amino Acids. 42, 791-801 (2012).</li><li>O'Meara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+bovine+zygotes:+siRNA+transfection+versus+microinjection.">Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection.</a> Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).</li><li>Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery.">Nonviral gene delivery.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).</li><li>Hiramoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+without+mitotic+apparatus+in+sea+urchin+eggs.">Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs.</a> Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).</li><li>Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 25, (1982).</li><li>Gross, J. M., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Brachyury+(T)+during+gastrulation+movements+in+the+sea+urchin+Lytechinus+variegatus.">The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus.</a> Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).</li><li>Yajima M, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomy+in+specification+of+primordial+germ+cells+and+their+passive+translocation+in+the+sea+urchin.">Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin.</a> Development. 139, 3786-3794 (2012).</li><li>Duboc, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+BMP2/4+pattern+the+mesoderm+and+endoderm+during+development+of+the+sea+urchin+embryo.">Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo.</a> Development. 137, 223-235 (2010).</li><li>Ernst, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offerings+from+an+Urchin.">Offerings from an Urchin.</a> Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).</li><li>McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+sea+urchins.">Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins.</a> Development. 138, 2639-2648 (2011).</li><li>Sodergren, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+article+-+The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li><li>Roux, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+and+proteomic+perspective+of+sea+urchin+calcium+signaling+and+egg+activation.">A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation.</a> Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).</li><li>Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+increases+the+polyphosphoinositide+content+of+sea+urchin+eggs.">Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs.</a> Nature. 310, 414-415 (1984).</li><li>Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B+synthesis+is+required+for+sea+urchin+oocyte+maturation.">Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation.</a> Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+modifications+at+fertilization:+regulation+of+dityrosine+crosslinking+by+transamidation.">Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation.</a> Development. 136, 1835-1847 (2009).</li><li>Shuster, C. B., Burgess, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+regulating+the+timing+of+cytokinesis+in+embryonic+cells.">Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells.</a> Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).</li><li>Morris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytoskeletal+and+motility+proteins+in+the+sea+urchin+genome+assembly.">Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly.</a> Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cell+Geometry+on+Division-Plane+Positioning.">Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning.</a> Cell. 144, 414-426 (2011).</li><li>Davidson, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+regulatory+network+for+development.">A genomic regulatory network for development.</a> Science. 295, 1669-1678 (2002).</li><li>Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulatory+logic+for+specification+of+an+embryonic+cell+lineage.">Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).</li><li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+controlling+the+embryonic+specification+of+endoderm.">A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm.</a> Nature. 474, (2011).</li><li>Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cis-regulatory+genomics+for+systems+biology.">Functional cis-regulatory genomics for systems biology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).</li><li>Showman, R. M., Foerder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+fertilization+membrane+of+sea-urchin+embryos+employing+aminotriazole.">Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole.</a> Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).</li><li>Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+expression+of+the+hatching+enzyme+gene+in+the+sea-urchin+embryo.">Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo.</a> Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).</li><li>Jaffe, L. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+oocytes,+eggs,+and+embryos.">Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos.</a> Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة أو الصراعات الأخرى ذات الاهتمام.

حقن مكروي هي تقنية قوية لتقديم علاجات مختلفة مثل الحمض النووي، ومرنا، والبروتينات المؤتلف، وفقدان وظيفة وربح من الكواشف وظيفة، والأصباغ ومجموعاتها في البيض والأجنة، وخلايا الكائنات الحية المختلفة 1-7. ومع ذلك، يجب أن تبقى العديد من الاعتبارات في الحسبان عند تصميم تجربة حقن مكروي. من الأهمية بمكان أن ينظر في ذوبان علاج تسليمها وحجم الحقن. إذا كان هذا الحل microinjected يميل إلى تشكيل راسب حتى طفيفة، سيتم انسداد الإبرة microinjecting. عموما فمن المستحسن أن أجهزة الطرد المركزي الحل لأكثر من 15 دقيقة قبل تحميلها في الإبرة للتأكد من إزالة أي راسب من الحل 3. النهج الآخر هو لتمرير حل من خلال الأعمدة تدور ميليبور. إذا كان من غير الممكن تجنب انسداد، فإنه قد يكون من الممكن لتنشيط الإبرة التي كتبها طيف كسر غيض مرة أخرى،ولكن يصبح من الصعب السيطرة على تدفق الحل إذا غيض واسعة جدا. كمية كبيرة من الحل حقن يمكن أن تكون سامة إلى الجنين، علاوة على ذلك، وغيض واسعة يدخل اختلافات أكبر بين وحدات التخزين من حل حقنها في أجنة الفردية. من المهم أيضا أن كمية حقن في حجم البويضات المخصبة حديثا وتعديلها. حجم حقن يمكن معايرة عن طريق سحب الإبر على مختلف إعدادات تليها حقن حل في النفط. وهذا يسمح لقياس قطرها (وبالتالي حجم) من الحبرية 32. نجد أن مبلغ مقبول من الحل حقن في البويضة المخصبة حديثا يجب أن لا تتجاوز 1/5 قطر البيضة الملقحة كما هو مبين في الشكل 5. النصيحة الرئيسي هو لتحميل الإبرة الحق قبل الحقن، إلى العمل بسرعة، وكثير من الأحيان إلى استخدام الزر تنظيف ظيفة من حاقن الذي يؤدي تطبيق أقصى قدر من الضغط المتاحة للمخرج فيأجل طرد حقن إبرة المحظورة. في بعض الأحيان قد تسد الإبرة من الخارج، وعندما الحيوانات المنوية والحطام من البيض حقن سابقا التمسك غيض من الإبرة. في هذه الحالة، فإنه من المفيد لرفع الإبرة على طول الطريق حتى من الماء 3-AT في الطبق عن طريق الحقن. عادة ما يكون التوتر الناجم عن واجهة السائل الهواء ما يكفي لازالة الانقاض. بدلا من ذلك، بالفرشاة بلطف إبرة الحقن ضد الصفر على لوحة الحقن قد يساعد أيضا. في الحالة القصوى، فمن الممكن لمسح رأس الإبرة مع Kimwipe الرطب نازف. ومع ذلك، مثل المسح يتطلب الحذر الشديد والممارسة. الأصباغ الفلورية مثل 10،000 ميغاواط تكساس الأحمر يسين اتهم ديكستران (2 ملغ / مل) تنتج إشارة قوية التي يمكن أن يتم الكشف عن وتستخدم لتطبيع موثوقة من الحل حقن. عندما مرنا هو ليتم حقنه، فمن المستحسن أن coinject مع mCherry أو GFP mRNAs وجنبا إلى جنب مع مرنا لفيterest لضمان عدم تدهور مرنا وقعت. في هذه الحالة التصور للإشارة الفلورسنت تعتمد على ترجمة mCherry أو GFP. إذا كان استخدام الأصباغ أو يبني الفلورسنت غير ممكن، فمن المستحسن الصف كمية صغيرة من البيض على كل طبق على حدة للتأكد من أن جميع البويضات المخصبة حديثا على هذا الطبق يتم حقن. في الختام، حقن مكروي هو أداة قيمة للبحوث في مجال علم الوراثة والبيولوجيا الجزيئية والخلوية، والتنموية. باستخدام هذه التقنية، جعلت المجتمع قنفذ البحر مساهمة كبيرة في فهمنا للخلية والبيولوجيا التطورية مثل مواصفات مصير الخلايا، وظيفة الجين، تنظيم الجينات والمسارات البيوكيميائية التطور الجنيني الأساسي 16.

كفاءة وقابلة للتكرار تقديم العلاج هي واحدة من التحديات المنهجية الرئيسية للباحثين. وقد وضعت عدة طرق لتقديم حلول عابر العلاج في البيض والأجنة، والخلايا. وتشمل هذه الأساليب التثقيب الكهربائي (على أساس توليد المسام عابرة في غشاء باستخدام النبضات الكهربائية قصيرة) 1،2، lipofection (تسليم من خلال مزيج من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على العلاج مع الغشاء) 1، وعجلت microparticle القصف 1 (DNA على ميكرون الجسيمات الحجم المعدنية التي تستخدم بعد ذلك لاختراق الخلايا بسرعة عالية)، وتنبيغ (يتم استخدام فيروس كوسيلة إيصال الجينات المحورة). في هذه اللحظة، حقن مكروي هو النهج الوحيد الذي يحمل ميزة تقديم أي حل مع كفاءة 100٪ مع الحد الأدنى من الكواشف. علاوة على ذلك، حل حقنة واحدة يمكن أن تتكون من مزيج معقد من العلاجات. وقد استخدمت هذه التقنية لنجاحmicroinject لاي البيض والأجنة من العديد من الأنواع مثل قنافذ البحر 3،4، حمار وحشي الأسماك 5، 6 الماوس، الضفدع 7، 8 والماشية وكذلك الخلايا واحد في زراعة الأنسجة 9. كما تم إجراء الحقن عن Blastomeres واحد في وقت لاحق من مراحل النمو 10-12. وتستند الأساليب الحالية للإبر دقيقة جدا في طريقة ضغط الحقن التي تم وصفها في البداية من قبل Hiramoto 10، ولكن تم إحراز تقدم كبير نحو تعظيم الاستفادة من هذه العملية. وقد وصفت تقنيات Microinjection ممتازة في أماكن أخرى 11، وهنا نحن تصف إحدى الطرق المحددة التي يتم استخدامها حاليا لmicroinject قنفذ البحر (Strongylocentrotus purpuratus) البويضات المخصبة حديثا. لأكثر من قرن، كانت قنافذ البحر على قيمة تجريبية نموذج 15،16. ترتبط قنافذ البحر تطويريا ارتباطا وثيقا الحبليات (بما في ذلك لنا) وتحليلكشفت الجينوم الخاصة التي تحتوي عليها جميع الأسر الجينات الرئيسية مثل 17 الإنسان. أنها تنتج عدد كبير من الأجنة النامية بشكل متزامن الشفافة التي يمكن التلاعب بها بسهولة. باستخدام قنفذ البحر باعتباره النموذج الحي، وقد ساهم المجتمع قنفذ البحر في فهمنا لعملية الإخصاب 18-21، 22-24 خلية العمليات البيولوجية، والشبكات التنظيمية الجينات (GRNs) 25-28. حقن مكروي إلى بيضات ملقحة قنفذ البحر يتطلب عدة خطوات. أولا، تحتاج البيض إلى أن يجمد قبل الحقن (موضح أدناه). والمغلفة أطباق حقن مكروي مع بروتامين سلفات (PS)، مما يخلق سطح موجبة الشحنة، التي يمكن أن البيض سالبة الشحنة الالتزام 3. وdejellied البيض قبل الحضانة في مياه البحر الحمضية (الرقم الهيدروجيني 5.15) لمدة 10 دقيقة، تليها اثنين يغسل في مياه البحر الطبيعية أو مياه البحر الاصطناعي (درجة الحموضة 8.0). والتجديف بعناية البيض dejellied في خط مستقيمفي منتصف الطبق PS المغلفة في وجود 1 ملم 3 aminotriazole (3-AT)، وهو مطلوب لتمنع نشاط ovoperoxidase الذي يفرز من حبيبات القشرية من البيض نتيجة للإخصاب 29. هذه الخطوة مهمة لمنع تصلب المغلف الإخصاب وتسهيل دخول إبرة حقن مكروي. كبديل ل1 ملم 3-AT، 10 ملم حمض البارامينوبنزويك (PABA) يمكن استخدامها. يتم تحميل الحل في حقن إبرة حقن مكروي باستخدام المتخصصة microloading ماصة غيض وتركيبه على حامل تعلق على مياداة مجهرية وحدة الضغط (الشكل 1). كل إبرة يمكن استخدامها لmicroinject بيضات ملقحة الفردية في تجارب متعددة في أيام منفصلة. حقن مكروي لا يمكن أن يؤديها لمدة 10-15 دقيقة حتى تتصلب بيضات ملقحة. ثم يتم غسلها بيضات ملقحة مع مياه البحر ومثقف في 15 درجة مئوية. عندما تصل الأجنة الفقس الأريمة المرحلة، التي يطلقون الانزيم الذي يساعد على هضم الفقس مكونات فرtilization المغلف 30 والسماح لهم لفصل بطبيعة الحال من الطبق PS المغلفة. إذا لزم الأمر، ويمكن فصل الأجنة برفق من الطبق باستخدام ماصة باستور ماصة الفم أو عن طريق النفخ بلطف مياه البحر على الأجنة. الطريقة الموصوفة تمكن حقن مكروي فعالة وموثوق بها من 100-400 البويضات المخصبة حديثا على طبق واحد، وتوفير وسيلة الإنتاجية العالية لتحليل المصب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:211px;">14673-043</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope Axiovert 40C</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:211px;">4109431007990000</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:211px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;">Load injection solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nylon filter mesh 80 &#956;m</td>
			<td style="width:200px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:211px;">03-80-37</td>
			<td style="width:167px;">Filter eggs to get rid of debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">02707432 or 02707430</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13 374 12</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:200px;">Intramedic</td>
			<td style="width:211px;">PE-160</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protamine sulfate</td>
			<td style="width:200px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:211px;">194729</td>
			<td style="width:167px;">Attach dejellied eggs to injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea urchins S. purpuratus</td>
			<td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td>
			<td style="width:211px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea water</td>
			<td style="width:200px;">any pet store</td>
			<td style="width:211px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">0875713A</td>
			<td style="width:167px;">Injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9124</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9212</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transfer pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13-711-9AM</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical needle puller </td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">PC-10</td>
			<td>Pull injection needles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput microinjections of sea urchin zygotes

حقن مكروي إلى خلايا الأجنة وهو أسلوب شائع يستخدم لدراسة مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية. في هذه الطريقة يتم تحميل كمية صغيرة من محلول معالجة في إبرة حقن مكروي الذي يستخدم لحقن الخلايا جسديا يجمد الفردية أو الأجنة. على الرغم من الحاجة إلى التدريب الأولي لتنفيذ هذا الإجراء للتسليم الإنتاجية العالية، حقن مكروي يوفر أقصى قدر من الكفاءة والتسليم استنساخه من مجموعة واسعة من حلول معالجة (بما في ذلك مخاليط معقدة من عينات) في الخلايا، والبيض أو الأجنة. وتشمل التطبيقات لإبر دقيقة جدا تسليم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، البروتينات المؤتلف، وزيادة وظيفة، وفقدان وظيفة الكواشف. يتم إضافة صبغة الفلورسنت أو اللونية في حل حقن لتمكين التصور لحظة من التنفيذ الفعال وكذلك أداة للتطبيع موثوق لمبلغ من الحل تسليمها. الطريقة الموصوفة تمكن Microinjection من 100-400 البحر قنفذ ضygotes في غضون 10-15 دقيقة.

كانت GFP mCherry ويبني مراسل في المختبر كتب وmicroinjected في البويضات المخصبة حديثا. وحضنت الأجنة عند 15 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (حتى المرحلة الأريمة) وتصويرها باستخدام مجهر زايس المراقب Z1. لم حقن يبني مراسل لن يؤدي إلى أية عيوب التنموية (الشكل 6). لالكمي للإشارات الفلورسنت، تم إجراء الحصول على الصور في التكبير المنخفض (100X) لالتقاط الحد الأقصى بكسل الفلورسنت (أرقام 6D-F). وتم قياس كمية إشارات الفلورسنت باستخدام Axiovision 4.8.2.0. لم الأخطاء القياسية لكثافة إشارات الفلورية بين السكان من 100-200 الأريمات لا تتجاوز 1.5٪ (لا تظهر البيانات). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig1.jpg" /> الشكل 1. الإعداد حقن مكروي. (A) A دي المغلفة PSيقع ركلات الترجيح مع البيض يجمد على مرحلة (B) مجهر مقلوب. ويرد حقن مكروي الإبرة إلى (C) حامل الإبرة التي يتم توصيلها إلى (D) وحدة الضغط. يتم توجيه الحركة في س، ص، ض، وأبعاد باستخدام (E) ومياداة مجهرية أو (F) مناور الخشنة. (G) ويستخدم سائق المسمار ملفوفة مع المناشف الورقية للاستفادة بلطف المرحلة المجهر للحث يرتجف طفيف لتسهيل دخول الإبرة في البويضة المخصبة حديثا. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig2.jpg" /> الشكل 2. التفريخ من قنافذ البحر. (A) هو فعل قنفذ البحر لتسليط عن طريق الحقن intracoelomic من 0.5٪ بوكل. النقاط الإبرة لغشاء محيط بالفم المحيطة فم الحيوان، الجزء الناعم فقط من الحيوان.(ب) يتم وضع أنثى قنفذ البحر مع gonapores لها مغمورة في مياه البحر في كوب من البلاستيك لجمع البيض الأصفر. (C) يتم تحريرها الحيوانات المنوية الأبيض من gonapores من قنفذ البحر الذكور. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="4.25in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig3.jpg" /> الرقم 3. . ماصة الفم يتكون ماصة الفم من ثلاثة أجزاء: (أ) زجاج micropipette إبرة، (B) أنابيب بلاستيكية، و (C) وP20 تصفية العقيمة أو P200 تلميح. يتم إدراج micropipette الزجاج في أنابيب بلاستيكية والتي يتم توصيلها إلى P20 أو P200 قطعة الفم. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="4.25in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig4.jpg" /> الشكل 4. حقن مكروي إبرة. (A) وإبرة حقن مكروي هو PULأدى باستخدام إبرة ساحبة مع إعداد محددة. الإعداد للساحبة إبرة يحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. باستخدام Narishege PC-10 إبرة ساحبة، ونحن نستخدم 72.8 درجة مئوية للحرارة الضبط 1 و 83.7 ° C لتحديد الحرارة 2. باستخدام الصفر على لوحة نحن كسر رأس الإبرة لتسهيل تدفق الحل. (ب) يجب أن يكون إبرة جيدة بطول 500-600 ميكرون من عرض 50 ميكرون عند الكتف إلى 5 ميكرومتر على الحافة. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="4.25in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig5.jpg" /> الرقم 5. حقن البيض قنفذ البحر المخصبة حديثا. تم جذف البيض Dejellied على طبق المغلفة PS والمخصبة. تم حقن البويضات المخصبة حديثا واحدا تلو الآخر في الوقت الذي يتجه المسرح المجهر على طول خط بيضات ملقحة (من الأعلى إلى الأسفل). (أ) يعتبر حقن البلعة بوضوح إلى أن تشكيل داخل المخصبة حديثاالبيض في رأس الإبرة. (ب) يتم تشكيل مغلف شفاف الإخصاب عند الإخصاب. (C) الحيوانات المنوية تظهر نقاط صغيرة سوداء في الخلفية. شريط النطاق هو 50 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50841/50841fig5highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 6" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig6.jpg" /> الرقم 6. بيضات ملقحة Microinjected تطورت الأريمات دون عيوب التنموية أو المورفولوجية. تم حقن البويضات المخصبة حديثا مع علامات الفلورسنت التي تسمح لهم يمكن تمييزها بوضوح من الأجنة uninjected (كما هو موضح من قبل السهام). (AC) أجنة تصوير في 400X التكبير. يتم تصوير (DF) الأجنة في التكبير 100X لالتقاط معظم إشارات مضان المنبعثة لتقدير موثوق بها. بعد 24 ساعة عالتسميد معاهدة الفضاء الخارجي، تم جمع الأريمات وتعامل مع مياه البحر 2X لمدة 2 دقيقة لشل حركة الأجنة السباحة 3، ثم من 1X غسل مياه البحر. تم الحصول على الصور مع المراقب زايس Z1 المجهر والكاميرا AxioCam monochromic. (A، D) وصور من مدينة دبي للإنترنت الأريمات. (B، E) الصور تراكب من الأجنة في المختبر مع حقن كتب mCherry مضان في مدينة دبي للإنترنت وقنوات. (C، F) تراكب الصور من الأجنة في المختبر مع حقن كتب GFP مضان في مدينة دبي للإنترنت وقنوات. شريط النطاق هو 50 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50841/50841fig6highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes at JoVE.com

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

حقن مكروي هو أسلوب شائع يستخدم لتقديم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير أو العلاجات الأخرى في البيض والأجنة، وخلايا الأنواع المختلفة.

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Views.  University of Delaware.  حقن مكروي هو أسلوب شائع يستخدم لتقديم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير أو العلاجات الأخرى في البيض والأجنة، وخلايا الأنواع المختلفة. 

Video: High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

تدفق الخلوي على أساس تنقية<em&gt; S. خميرة</em&gt; بيضات ملقحة

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

منهج في Microinjection من<em&gt; Patiria minata</em&gt; بيضات ملقحة

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...