وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية وIOS IOS 0844948 1024811

<ol>
	<li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens,+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes.">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li><li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes.">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li><li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization.">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li><li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development.">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li><li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning.">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li><li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms.">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17 (2012).</li><li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star.">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68 (2013).</li><li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae.">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li><li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin.">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li><li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species.">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li><li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential.">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li><li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).</li><li>Dor&#233;e, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+meiosis:+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes.">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution.">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+evolutionary+act:+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins.">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li><li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos.">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li><li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes.">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li><li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomere+isolation+and+transplantation.">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li><li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

أي تضارب في المصالح أعلنت من قبل المؤلفين.

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة التي من الصعب بالنسبة للمستخدمين المبتدئين لهذه التقنية ولكن لا غنى عنها لخلق أجنة morphant بنجاح. الأول هو اختيار البويضات السليمة التي من شأنها أن تنضج وتسميد بشكل صحيح. نسبة التطور الطبيعي في ثقافة تعتمد على الموسم، وصحة الحيوان، وعدد المرات التي تم حصادها البويضات من فرد واحد. البويضات تميل إلى أن تكون ذات نوعية أفضل من أبريل حتى أكتوبر تشرين الاول. من المهم أن ننظر بعناية في البويضات قبل الشروع في ضمان أن الغالبية تبدو وكأنها الشكل 2A بدلا من الشكل 2B. فإنه يجوز أن يكون عدد قليل من البويضات التي لن تنضج، خاصة إذا كانت صغيرة بما يكفي لتصفية ما تتم معالجة البويضات. في بعض الأحيان، البويضات التي هي متخلفة تكاد تكون كبيرة مثل البويضات كاملة النمو التي هي على استعداد للنضوج. هم تمييزها بواسطة محبب، colorin من البنيز (الشكل 2E). لا تستخدم دفعات من البويضات من هذا النوع لأن الترشيح لا عزل البويضات كاملة النمو من البويضات غير المطورة والتي غالبا ما تؤدي إلى ثقافات الجنين غير الطبيعية التي يرجح أن تظهر العيوب رأينا في الشكل 5. في خطوة حاسمة أخرى هي حجم حقن البلعة. إدخال مبلغ كاشف إقلاق كبير بشكل كاف لممارسة تأثير، ولكن ليست كبيرة بحيث تتسبب في آثار غير محددة. أول مرة يتم استخدام كاشف إقلاق، فمن المفيد إجراء المعايرة التي يتم حاول عدة تركيزات كاشف. أداء microinjections اللاحقة مع أعلى تركيز أن لا يسبب تشوهات النمو التي لا علاقة لها النمط الظاهري المتوقع، أو تطوير تأخير (الشكل 5A). تجنب حقن البلعة أكبر من 30٪ من قطر الجنين لأن هذا قد يعطل التطور الطبيعي. البلعة أحجام صغيرة بشكل مفرط، من خلال التعاونntrast، يصعب تفقد البصر لتحديد حجم ثابت والذي يمكن أن يؤدي إلى مجموعة من الظواهر الاضطراب المفرط عبر مكررات. قد يسبب الكواشف مشوشة تأخر النمو أو الظواهر غير محددة في نطاقات تركيز فعالة. من المهم جدا، لذلك، لحقن ضوابط الأخوة مع كاشف حميدة مثل التحكم القياسية MASO، يبني DNA القياسية، أو رودامين التتبع. الأجنة morphant الفحص فقط إذا أظهرت هذه الضوابط التطور الطبيعي. حقن الأجنة، بما في ذلك الضوابط، تظهر أحيانا النمط الظاهري الأريمة التجاعيد لكنها لن تكون في كثير من الأحيان من خلال المضي قدما بقية تنمية عادة. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان كاشف معين يسبب تأخر النمو باستمرار في الأجنة الناتجة morphant، مقارنة هذه الأجنة لمراقبة الأجنة لتحديد عدد ساعات التأخير التي يمرون بها. هناك عدد قليل من سمات هذه الطريقة التي قد تحد من فائدته في قسيناريوهات تجريبية pecific. واحدة من هذه القضية هو حقيقة أن واحدا يمكن أن يعرض الكواشف في البويضة المخصبة أو المراحل المبكرة الانقسام فقط. وهذه مشكلة خاصة إذا كان الجين أو مسار المصالح أمر بالغ الأهمية خاصة في التنمية في وقت مبكر والأجنة الناتجة morphant وinviable جدا أو غير طبيعي تنمويا للدراسة ذات مغزى. أحيانا يتم حل هذه المشكلة عن طريق حقن نسخ أقل من إقلاق كاشف، مما أدى إلى ألطف، ضربة قاضية ناقصة. في حالة وجود دواء خلايا قابلة للاختراق المناسبة لهذا الجين المستهدف أو مسار، فإنه من المفيد أن نقارن النمط الظاهري للأجنة حقن الكواشف في مرحلة البويضة المخصبة مع الأجنة تعامل مع المخدرات في مرحلة لاحقة، أكثر ملاءمة. لأن حقن MASOs أو من mRNAs يوفر قدر أكبر من الدقة، هو أكثر قوية لاستخدام هذا الأسلوب بالتزامن مع دراسة العلاج من تعاطي المخدرات في مقابل التخلي عن حقن مكروي لصالح العلاج من تعاطي المخدرات. وأخيرا، على الرغم من أن هذا الصغيرطريقة الحقن سوف تنتج كمية كافية من الأجنة لمجموعة واسعة من التطبيقات المصب، سيكون في أفضل إنتاج العديد 100-1000 صحية، حقن الأجنة بنجاح. قد تتطلب بعض التجارب المطلوب أكبر بكثير من هذه المادة. يجوز تعديل الأساليب الأخرى المستخدمة بنجاح في نظام قنفذ البحر إلى خلق عدد أكبر من الأجنة نجمة البحر morphant، مثل الفيروسات القهقرية شمولي التوجه 20، على الرغم من أن هذا الأسلوب هو رواية ولم تكتسب بعد الاستخدام واسع النطاق.

نجم البحر، Patiria miniata، (المعروف باسم نجم الخفافيش) في الظهور كنظام نموذج للاهتمام وتنوعا لمجموعة متنوعة من الخلايا 1- 3، 4،5 التنموية، التطورية 6- 8، والدراسات البيئية 9- 11. الكبار P. وتوزع miniata على طول ساحل المحيط الهادئ من سيتكا، ألاسكا إلى باجا كاليفورنيا 12 ويتم الاحتفاظ بسهولة في الأحواض المائية البحرية. البويضات التي يمكن الحصول عليها على مدار السنة وكل أنثى يمكن إلقاء عشرات الآلاف من البيض. ونضجت بسهولة البويضات المخصبة وخارجيا 13. الأجنة الناتجة شفافة مما يسمح للمراقبة سهلة؛ أن تتطور بشكل متزامن، وتحتاج إلى مياه البحر الوحيد للتنمية. التجمع الجينوم كله وtranscriptomes متعددة متاحة للP. أيضا miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). هذه المزايا تجعل يجعلها مثالية لمجموعة واسعة من البحوثوأغراض التدريس. في السنوات الأخيرة، P. أصبح miniata نظام نموذجي لشبكة تنظيمية الجينات التنموي يحلل 14- 16. والهدف من هذه الدراسات هو تحديد مجاملة كاملة من الجينات التنظيمية وتحديد شبكة من تفاعلاتها. الكثير من هذا العمل ينطوي على التعبير الجيني من خلال إقلاق إدخال أليغنوكليوتيد] العقاقير أو في المختبر توليفها من mRNAs. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التحليلات التنظيمية رابطة الدول المستقلة لتوصيف وظيفة الحمض النووي التنظيمي 15. هذه التحليلات تتطلب إدخال الكواشف اضطراب و / أو مراسل الحمض النووي يبني في الأجنة. وعلاوة على ذلك، لوصف آثار المصب من هذه الاضطرابات، لا بد من مقايسة العديد من الأجنة لإجراء تغييرات في التعبير الجيني من الأهداف المحتملة. تقنيات Microinjection من عدة مئات من بيضات ملقحة هي المركزية لهذا العمل. شوكيات الجلد، بما في ذلك P. miniata </م&gt;، يتطلب عدة أشهر لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي. وبسبب هذا، فهو عموما ليس العملي لتطوير وصيانة خطوط المعدلة وراثيا من هذه الحيوانات للتجريب. لذا، تربية البالغين المعدلة وراثيا لا يمكن بكفاءة خلق الأجنة تعديل. بدلا من ذلك، يجب أن يحدث الاضطراب من جديد من خلال حقن مكروي. يقدم حقن مكروي فرصة لتعديل الأجنة مع الكواشف التي ليست خلية منفذة. يصف بروتوكول التالية طريقة لإدخال DNA، مرنا، استشفاف خلية، وأليغنوكليوتيد] morpholino العقاقير إلى مئات من البويضات المخصبة في واحدة 2-3 ساعة يجلس من خلال حقن مكروي. هذا وتنتج مادة كافية لمجموعة متنوعة من التجارب المصب بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، QPCR، الموقع التهجين، RNA تسلسل، والنشاف الغربي في.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

كانت شوكيات الجلد لفترة طويلة نظام نموذجي المفضل للدراسات الاستنساخ والتنمية، ومؤخرا لدراسة تنظيم الجينات وتطور العمليات التنموية. نجم البحر، Patiria miniata، تكتسب انتشار كنظام نموذج لهذه الأنواع من الدراسات التي أجريت سابقا على وجه الحصر تقريبا في قنافذ البحر، Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus. ميزة هذه الأنظمة النموذج هو سهولة إنتاج أجنة تعديل فيها هو جين معين صعودا أو downregulated، ووضع العلامات مجموعة من الخلايا، أو إدخال الجين المراسل. وهناك طريقة حقن مكروي واحد قادر على خلق مجموعة واسعة من هذه الأجنة تعديل. هنا، فإننا نقدم وسيلة للحصول على الأمشاج من P. miniata، وإنتاج بيضات ملقحة، وإدخال الكواشف مشوشة عبر حقن مكروي. يتم عزل الأجنة morphant صحية في وقت لاحق للدراسات الكمية والنوعية للجنرال الكتريكوظيفة الشرق الأدنى. توافر الجينوم وTranscriptome على البيانات لهذا الكائن الحي ازدادت أنواع الدراسات التي يتم تنفيذها وسهولة تنفيذها.

الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم الكواشف إلى الأجنة. نحن إثبات فعالية البروتوكول عن طريق حقن مراسل بناء الحمض النووي الذي يدفع التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP). حقن الأجنة تعبر عن GFP في بقع نسيلي (الشكل 4A-B) والحمض النووي خلال الانقسام يتضمن المبكر. العديد من الكواشف أن تكون مرغوبة لإدخال الأجنة في سامة بكميات عالية وعلى دفعات دون المستوى الأمثل من الأجنة. كشوف سمية عن طريق تأخير التنمية، اعتقال التنمية في الانقسام المبكر أو في مرحلة البويضة الملقحة، أو من خلال فرض تنمية الشاذة (الشكل 5A-C). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. الحصول على الأمشاج من P. miniata البالغين. أ) إلى استئصال الغدد التناسلية إجراء شق على الجانب الأقرب من الذراعإلى منتصف الحيوان. B) والمواد البني الداكن سحبها من هذا الشق هو نسيج القناة الهضمية. تجنب سحب أنسجة الأمعاء لأنها سوف تصيب الحيوان. C) أنسجة المبيض هي البرتقالي عادة في اللون كما هو موضح هنا، ولكن قد يكون أيضا الأصفر أو البني الفاتح. D) الخصية هي أبيض أو بيج اللون، كما هو مبين. جميع الحانات نطاق دلالة 1 سم. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. نضوج البويضات والإخصاب. A) البويضات السليمة التي هي على استعداد لنضج كبيرة وواضحة مع حويصلة جرثومي مرئية. B) البويضات التي ليست جاهزة للنضوج هي أصغر، والبني، ومحبب في المظهر. C) بويضة التي تم نضجت مع 1-methyladenine . قد كسر الحويصلة الجرثومية أسفل. D) واقحة محاطة FERTilization المغلف. E) تجنب الثقافات مع البويضات الكبيرة التي لا يمكن نضجت لأنه لن يتم إزالة هذه البويضات عن طريق الترشيح. هذه البويضات هي أصغر قليلا من واحد في A. وهي قتامة البني ومحكم محبب. شريط النطاق في ويدل 50 ميكرون، ويمثل مقياس للصور AE. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. جهاز لتجميع. AA &#39;) مرشح شبكة مثبتة على أنبوب مخروطي 50 مل. يتم قطع نهاية مدبب من الأنبوب ووسط غطاء من السماح الثقافات أن تدفقت من خلال أنبوب والتصفية. B) طبق حقن شيدت من غطاء 60 × 15 مم طبق الثقافة البوليسترين. دائرة مرسومة حول مركز وتحدد مجال الرؤية من المجهر الحقن وبمثابة دليل للأجنة التجديف. وسجل خط كثافة العملياتس الطبق مفيد لكسر إبر الحقن. ماصة CC &#39;) الفم انشاء. تناسب لسان حال في واحدة من نهاية عدة القدم أنبوب المطاط طويلة. تناسب الطرف الآخر إلى ماصة باستور، الذي تم تشكيله من قبل لفترة وجيزة ذوبان وسحب نهاية ضيقة من الزجاج. D) تخطيطي مما يدل على التجديف المثالي باستور ماصة الشكل والعرض لتعزيز التصاق دون الإضرار الأجنة. عندما كسر نهاية الخروج من ماصة سحبت، فإنه من المفيد إذا مدبب نهاية بيضات ملقحة لمنع الناشئة من العائمة بعيدا عن الطبق. جميع الحانات على نطاق وتدل 3 سم. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig4highres.jpg" width="400" /> الرقم 4. الكواشف أدخلت بنجاح بواسطة حقن مكروي. A) DIC من مرحلة الجنين الأريمة حقن البلازميد مراسل GFP. الجنين لديه التشكل الطبيعي. B) GFP expression في الجنين هو مبين في A. C) DIC صورة اثنين طبيعية شكليا الأجنة مرحلة الأريمة. D) واحدة من الجنين C تنبعث مضان أحمر من إدخال تكساس الأحمر ديكستران. الجنين الآخر هو برنامج الأمم المتحدة للحقن ويسلك أي مضان. أشرطة النطاق دلالة 50 ميكرون. شريط النطاق في ويمثل مقياس لألف وباء في شريط مقياس C يمثل مقياس C و D. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51913/51913fig5highres.jpg" width="500" /> الشكل 5. Overinjection وكاشف نتيجة سمية في القبض أو تطوير الشاذة. جميع الصور هي من الأجنة 24 ساعة بعد الحقن من نفس حقن دفعة واحدة. AA &#39;) إن اقحة overinjected اعتقل في مرحلة خلية واحدة. BB&#39;) جنين اعتقلت في انشقاق مبكر. وهناك تقسيم الجنين صحي بشكل متناظر، في حين أن هذا الجنين اعتقالبسبب انقسامات الخلية غير طبيعية. CC &#39;) الجنين مع التنمية الشاذة بعنف بسبب سمية. بينما يتشكل هذا الجنين تقريبا مثل الجنين الأريمة (D)، فمن غير متناظرة وغير طبيعي سميكة. DD &#39;) وصحيح النامية حقن الأريمة الجنين المرحلة. شريط النطاق في ويدل 50 ميكرون، ويمثل المقياس لجميع لوحات.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

الأساليب التي تنتج أجنة morphant ضرورية لدراسة آليات تنموية والشبكات التنظيمية الجينات. نجم البحر Patiria miniata هو نظام نموذجي الناشئة عن هذه الدراسات. هنا نقدم بروتوكول للحصول على الأمشاج، وتنتج ثقافات الأجنة، وحقن مكروي السريع للبيضات ملقحة من هذا النوع.

منهج في Microinjection من<em&gt; Patiria minata</em&gt; بيضات ملقحة

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K Views.  Carnegie Mellon University.  الأساليب التي تنتج أجنة morphant ضرورية لدراسة آليات تنموية والشبكات التنظيمية الجينات. نجم البحر Patiria miniata هو نظام نموذجي الناشئة عن هذه الدراسات. هنا نقدم بروتوكول للحصول على الأمشاج، وتنتج ثقافات الأجنة، وحقن مكروي السريع للبيضات ملقح...

Video: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

استخدام Rotorod كأسلوب للتحليل النوعي من المشي في الجرذ

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection الجنين الميداكا لاستخدامها بوصفها كائنا النموذجي الوراثية

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

تدفق الخلوي على أساس تنقية<em&gt; S. خميرة</em&gt; بيضات ملقحة

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.