Method Article
يظهر البروتوكول عمليات جمع متكررة للسائل النخاعي والدم من الفئران المصابة بالصرع بالتوازي مع المراقبة المستمرة لتخطيط كهربية الدماغ بالفيديو (EEG). هذه مفيدة لاستكشاف الروابط المحتملة بين التغيرات في جزيئات سوائل الجسم المختلفة ونشاط النوبات.
نظرا لأن تكوين سوائل الجسم يعكس العديد من الديناميات الفسيولوجية والمرضية ، يتم الحصول على عينات السائل البيولوجي بشكل شائع في العديد من السياقات التجريبية لقياس الجزيئات ذات الأهمية ، مثل الهرمونات أو عوامل النمو أو البروتينات أو الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر. مثال محدد هو أخذ عينات من السوائل البيولوجية في البحث عن المؤشرات الحيوية للصرع. في هذه الدراسات ، من المستحسن مقارنة مستويات الجزيئات في السائل النخاعي (CSF) وفي البلازما ، عن طريق سحب السائل الدماغي الشوكي والبلازما بالتوازي والنظر في المسافة الزمنية لأخذ العينات من وإلى النوبات. يعد الجمع بين CSF وأخذ عينات البلازما ، إلى جانب مراقبة تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو في المصابة بالصرع ، نهجا واعدا للتحقق من صحة المؤشرات الحيوية التشخيصية والتنبؤية المفترضة. هنا ، يتم وصف إجراء انسحاب السائل الدماغي الشوكي المشترك من الصهريج العظيم وأخذ عينات الدم من الوريد الجانبي للذيل في الفئران المصابة بالصرع والتي يتم مراقبتها باستمرار بواسطة تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو. يوفر هذا الإجراء مزايا كبيرة مقارنة بالتقنيات الأخرى شائعة الاستخدام. يسمح بأخذ العينات بسرعة مع الحد الأدنى من الألم أو الغزو ، وتقليل وقت التخدير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه للحصول على عينات CSF والبلازما في كل من الفئران المسجلة EEG المربوطة والقياس عن بعد ، ويمكن استخدامه بشكل متكرر عبر أيام متعددة من التجربة. من خلال تقليل الإجهاد الناتج عن أخذ العينات عن طريق تقصير تخدير الأيزوفلوران ، من المتوقع أن تعكس التدابير بشكل أكثر دقة المستويات الحقيقية للجزيئات التي تم فحصها في السوائل الحيوية. اعتمادا على توافر مقايسة تحليلية مناسبة ، يمكن استخدام هذه التقنية لقياس مستويات جزيئات متعددة ومختلفة أثناء إجراء تسجيل EEG في نفس الوقت.
يعد السائل الدماغي الشوكي (CSF) وأخذ عينات الدم مهمين لتحديد المؤشرات الحيوية للصرع والتحقق من صحتها ، في كل من الأبحاث قبل السريرية والسريرية 1,2. في الوقت الحاضر ، يركز تشخيص الصرع ومعظم الأبحاث حول المؤشرات الحيوية للصرع على EEG والتصوير العصبي3،4،5. غير أن هذه النهج تنطوي على العديد من القيود. بصرف النظر عن قياسات فروة الرأس الروتينية ، في كثير من الحالات ، يتطلب تخطيط كهربية الدماغ تقنيات غازية مثل أقطاب العمق6. تتميز طرق تصوير الدماغ بضعف الدقة الزمنية والمكانية وهي مكلفة نسبيا وتستغرقوقتا طويلا 7,8. ولهذا السبب، فإن تحديد المؤشرات الحيوية غير الغازية والمنخفضة التكلفة والقائمة على السوائل الحيوية من شأنه أن يوفر بديلا جذابا للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج هذه المؤشرات الحيوية للسوائل الحيوية مع مناهج التشخيص المتاحة لشحذ قدرتها على التنبؤ.
يتم تقديم المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بالصرع بشكل روتيني إلى EEG 9,10 وأخذ عينات الدم11,12,13,14 ، والعديد منهم أيضا إلى انسحاب السائل الدماغي النخاعي لاستبعاد الأسباب التي تهدد الحياة (مثل الالتهابات الحادة والتهاب الدماغ المناعي الذاتي)15. يمكن استخدام عينات الدم والسائل الدماغي الشوكي هذه في الأبحاث السريرية التي تهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية للصرع. على سبيل المثال ، وجد هوغ وزملاؤه في العمل أن الزيادة في ثلاث شظايا من الحمض النووي الريبي البلازمي تسبق حدوث النوبات في الصرع البشري14. وبالمثل ، يمكن لمستويات إنترلوكين -1بيتا (IL-1β) في السائل الدماغي النخاعي البشري والمصل ، معبرا عنها كنسبة من مستويات IL-1β في السائل الدماغي النخاعي على المصل ، أن تتنبأ بتطور الصرع بعد الصدمة بعد إصابة الدماغالرضحية 16. تسلط هذه الدراسات الضوء على أهمية أخذ عينات السوائل الحيوية لأبحاث المؤشرات الحيوية للصرع ، لكنها تواجه قيودا متعددة جوهرية للتجارب السريرية ، على سبيل المثال ، العامل التأسيسي للأدوية المضادة للصرع (AEDs) في الدم ، والنقص المتكرر في معلومات المسببات ، وعدم كفاية الضوابط ، وأعداد متواضعة من المرضى ، وغيرهم17،18.
توفر الأبحاث قبل السريرية فرصا أخرى للتحقيق في الجزيئات في السوائل الحيوية كمؤشرات حيوية محتملة للصرع. في الواقع ، من الممكن سحب البلازما و / أو السائل الدماغي الشوكي من أثناء إجراء تسجيلات EEG. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء أخذ العينات بشكل متكرر عبر أيام متعددة من التجربة ، ويمكن استخدام عدد من عناصر التحكم المتطابقة مع العمر والجنس والصرع لتحسين قوة الدراسة. هنا ، يتم وصف تقنية مرنة للحصول على السائل الدماغي الشوكي من cisterna magna مع الانسحاب المتوازي للبلازما من الوريد الذيلي في الفئران التي يراقبها EEG بالتفصيل. التقنية المقدمة لها العديد من المزايا على الطرق البديلة. باستخدام نهج إبرة الفراشة ، من الممكن جمع السائل الدماغي النخاعي عدة مرات دون المساس بوظيفة أقطاب EEG أو غرسات الرأس المماثلة. وهذا يمثل صقلا لإجراءات سحب القسطرة داخل القراب ، والتي ترتبط بخطر مرتفع نسبيا للإصابة بالعدوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نهج إسقاط السقوط الحر المبلغ عنه المستخدم لجمع الدم يتفوق على الأساليب الأخرى لسحب الدم في الوريد الذيل بسبب انخفاض خطر انحلال الدم بشكل كبير ، نظرا لحقيقة أن الدم لا يمر عبر الأنابيب ولا يتم تطبيق ضغط فراغ. إذا تم إجراؤها في ظل ظروف صارمة خالية من الجراثيم ، فهناك خطر منخفض بشكل خاص للإصابة بالحيوانات. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال بدء سحب الدم في نهاية ذيول ، يمكن تكرار أخذ العينات عدة مرات. من السهل إتقان هذه التقنيات ويمكن تطبيقها في العديد من الدراسات قبل السريرية لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي.
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة فيرارا ووزارة الصحة الإيطالية (الترخيص: D.M. 603/2022-PR) وفقا للمبادئ التوجيهية الموضحة في توجيه مجلس المجتمعات الأوروبية المؤرخ 24 نوفمبر 1986 (86/609 / EEC) بشأن حماية المستخدمة لأغراض تجريبية وعلمية أخرى. تم تعديل هذا البروتوكول خصيصا لمزيد من تحليلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sncRNAs) في السائل الدماغي الشوكي للفئران والبلازما التي تم الحصول عليها تحت سيطرة EEG في المصابة بالصرع. حسب اختياره ، يرجى الاطلاع على فيديو JoVE ذي الصلة لفهم أفضل وتحسينات الجراحة19،20،21.
1. إعداد للزرع الجراحي للأقطاب الكهربائية أو أجهزة القياس عن بعد
ملاحظة: تختلف تقنية الجراحة التجسيمية وفقا لنظام تخطيط كهربية الدماغ المستخدم. يوفر قسم الطريقة التالي وصفا للخطوات المشتركة بين نوعي العمليات الجراحية.
2. الزرع الجراحي للأقطاب المربوطة
ملاحظة: قبل إنشاء إجراء سحب السائل الدماغي الشوكي لهذا البروتوكول (انظر الخطوة 9 للحصول على التفاصيل) ، تم إجراء عمليات سحب متكررة من السائل الدماغي الشوكي عبر قنية إرشادية في عدد قليل من الفئران غير المخدرة التي تتحرك بحرية. تم استخدام ذات القنية المزروعة بأقطاب كهربائية مربوطة من أجل تقييم تأثير الغرسات ذات الرأس المزدوج على تسجيل EEG على المدى الطويل إلى جانب أخذ عينات متعددة من السائل الدماغي النخاعي. في هذه التجارب المحددة ، تم زرع الفئران بقنية إرشادية وهمية موضوعة في الصهريج العظيم ، تم إدخال طرفها 7 مم فيه بشكل مجسم ، وفقا للبروتوكولاتالمنشورة سابقا 22. كانت مناهج جراحة الزرع المزدوج مماثلة لتلك التي اعتمدها بعض العمال في الماضي لدليل غسيل الكلى وزرع القطب المربوط23,24.
3. الزرع الجراحي لأجهزة القياس عن بعد
ملاحظة: استخدم أجهزة قياس التحكم عن بعد المعقمة فقط. إذا تم إعادة استخدام أجهزة القياس عن بعد ، فقم بتنظيفها وتعقيمها قبل الجراحة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام مقاييس تليمتر دولية لعلوم البيانات (DSI) لتسجيل EEG.
4. رعاية ما بعد الجراحة
5. حالة تحريض الصرع في الفئران
ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل لتحريض حالة الصرع (SE) اللازم لإعادة إنتاج صرع الفص الصدغي المتوسط (mTLE) في الفئران ، راجع Guarino et al.25.
6. ربط الفيديو EEG في الفئران الصرع وتحليل نشاط النوبات
ملاحظة: يصف هذا القسم الإجراء التجريبي لتسجيل إشارات EEG في الفئران ذات المنزل الواحد والتي تتحرك بحرية في ظل الظروف القياسية. يجب ألا يحتوي القفص على أشياء يمكن أن يعلق فيها أو كابل التسجيل. اعتمادا على السؤال العلمي الذي يجب معالجته ، يمكن تحليل العديد من المعلمات. في حالة أبحاث الصرع ، يتم فحص آثار EEG للتعرف على النوبات الكهربائية والحركية. المعلمات الأكثر شيوعا المستخدمة لتحديد النوبة هي سعة وتواتر ومدة النشاط الكهربائي الانتيابي.
7. القياس عن بعد بالفيديو-EEG في الفئران المصابة بالصرع وتحليل نشاط النوبات
ملاحظة: يصف هذا القسم الإجراء التجريبي لتسجيل إشارات EEG للقياس الراديوي عن بعد في الفئران ذات المنزل الواحد والتي تتحرك بحرية في ظل الظروف القياسية. يعتمد البروتوكول على نظام القياس عن بعد المتاح تجاريا. ومع ذلك ، تختلف العديد من أنظمة القياس عن بعد اختلافا طفيفا في مواصفاتها الوظيفية والفنية. يجب اختيار النظام وفقا لمتطلبات المختبر وأهداف البحث.
8. إجراء جمع الدم من الوريد الذيل
ملاحظه. يتكون نظام جمع الدم الفراغي من إبرة فراشة (23 جم × 3/4 × 12 (0.8 مم × 19 مم × 305 مم). يمكن إجراء تقنية جمع الدم بسهولة بواسطة مشغل واحد وتستغرق العملية حوالي 5 دقائق.
9. إجراءات جمع السائل الدماغي النخاعي
ملاحظه. يمكن تنفيذ هذه التقنية بسهولة بواسطة مشغل واحد ، ويتطلب الإجراء حوالي 2-4 دقائق. المواد المستخدمة في جمع السائل الدماغي النخاعي هي إبر فراشة مفرغة منخفضة التكلفة تستخدم مرة واحدة وأنابيب استخراج. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام مجموعة ضخ مجنحة فراشة متصلة بحقنة معقمة من أجل إنشاء الفراغ (الشكل 2 أ).
10. تحليل القياس الطيفي لجودة العينة
ملاحظة: بعد الجمع الصحيح لعينات السائل الدماغي الشوكي والبلازما ، تكون العينات جاهزة لتحليل مقياس الطيف الضوئي ولا تتطلب أي معالجة محددة. قياس امتصاص الهيموجلوبين عن طريق قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية عند 414 نانومتر لتقييم خطر انحلال الدم في العينات. استخدم قيمة امتصاص قطع تبلغ 0.25 في عينات الفئران. قد يعتمد اختيار هذا الحد على تحليل qPCR اللاحق ومتطلباته المحددة للقياس الكمي ل sncRNAs.
تم الإبلاغ عن نتائج إجراءات CSF وسحب الدم المختلفة التي أجريت في 9 فئران تحكم و 18 فأرا مزمنا مصابا بالصرع ، وكلها مزروعة بأقطاب كهربائية في شهر واحد بعد SE ، من حيث معدل النجاح. بعد الزرع ، تمت مراقبة جميع الفئران بالفيديو EEG لمدة شهر واحد ، تم خلالها سحب السائل الدماغي الشوكي بالإضافة إلى الدم 5x كل 3 أيام خلال الأسبوعين الأخيرين من التجربة (أي في الأيام 52 و 55 و 58 و 61 و 64 بعد SE ؛ dpSE). تم استخدام البيانات من عمليات سحب متعددة في مختلفة لمقارنة معدل نجاح جمع السائل الدماغي الشوكي في الفئران ذات الرأسين المزروعات (المقنية لسحب السائل الدماغي النخاعي) مع معدل نجاح جمع السائل الدماغي الشوكي (الذي يتم بواسطة ثقب cisterna magna) في المزروعة بأقطاب كهربائية مربوطة أو عن بعد فقط (الجدول 1). في المختلفة ، تم تقييم تأثير جمع الدم الفراغي أو حلب الذيل على جودة عينات البلازما (الجدول 2). لهذا الغرض ، تم استخدام تحليل قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية عند 414 نانومتر للكشف عن الهيموغلوبين الحر. بالنسبة للتحليلات الإحصائية ، تم استخدام البرامج التجارية ، وتم استخدام Kruskal-Wallis أو ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبارات المقارنة المتعددة اللاحقة ل Tukey (p<0.05 تعتبر ذات دلالة إحصائية). يتم التعبير عن البيانات كوسيط ± SEM.
معدل نجاح أخذ عينات متعددة من السائل الدماغي الشوكي في الفئران المقننة والمثقوبة
تم أخذ عينات من السائل الدماغي الشوكي 5x في غضون 2 أسابيع في 3 مجموعات من الفئران: (i) الفئران المزروعة بالقطب المقنية والمربوطة (مجموعة CT من) ؛ في هذه ، تم إجراء سحب السائل الدماغي الشوكي عبر قنية توجيه وهمية ومفصل أنابيب PTFE إلى حقنة 1 مل عندما كانت غير مخدرة وتتحرك بحرية تحت فيديو EEG ؛ '2' الفئران المثقوبة (الخطوة 9) والجرذان المزروعة بقطب كهربائي مربوط (مجموعة PT)؛ (iii) الفئران المزروعة بالقطب الكهربائي المثقوب والقياس عن بعد (مجموعة PTe). تم استخدام ما مجموعه 9 لكل مجموعة (6 فئران صرع و 3 فئران ضابطة). تم تقييم عدد المجموعات الناجحة أكثر من 5 مرات. كان معدل النجاح مشابها في الفئران المثقوبة: 86.7٪ ± 5.8٪ في المربوطة و 88.9٪ ± 4.8٪ في المزروعة بأقطاب القياس عن بعد. بدلا من ذلك ، في الفئران المقنية ، انخفض المعدل حتى لو لم يكن مختلفا بشكل كبير (71.1 ٪ ± 8.9 ٪ ، الجدول 1). تشير هذه النتائج إلى أن القنية الموجودة على رؤوس قد تتداخل مع أخذ عينات السائل الدماغي الشوكي المتكررة وتعرض الدراسات الطولية للخطر. تقنية البزل أكثر ملاءمة لعمليات سحب السائل الدماغي الشوكي المتعددة في المزروعة بالأقطاب الكهربائية.
تأثير الفراغ وحلب الذيل على طريقة جمع البلازما
تم جمع الدم 5 مرات من 9 فئران (6 فئران صرع و 3 فئران ضابطة) في الأيام 52 و 55 و 58 و 61 و 64 بعد SE وتم تقييم جودة البلازما لانحلال الدم بصريا وقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية عند 414 نانومتر. للحصول على العينة الأولى في كل فأر ، تم استخدام سحب الفراغ عبر إبرة فراشة 21G متصلة بحقنة 1 مل. مع العينة الثانية ، تم استخدام سحب السقوط ونظام إبرة الفراشة 21G عند حلب الذيل في وقت واحد. للحصول على العينة 3-5 ، تم استخدام إجراء سحب السقوط دون حلب الذيل (الموصوف في الخطوة 9).
عند استخدام فراغ ، كانت البلازما وردية اللون تحت الفحص البصري ، وكان متوسط قيمة الامتصاص لعينات 9 فئران 0.647 ± 0.067 (الجدول 2 ، الشكل 3). تم الحصول على نتائج مماثلة في حالة استخدام حلب الذيل أثناء العملية: بلازما وردية اللون مع 0.620 ± 0.043 متوسط امتصاص (الجدول 2 ، الشكل 3). في المقابل ، مع سحب السقوط المدعوم بالجاذبية ونظام إبرة الفراشة 21G ، تم تخفيض متوسط قيم امتصاص البلازما بشكل كبير (0.226 ± 0.017 عند 58 نقطة في SE ؛ 0.223 ± -0.09 عند 61 نقطة في SE ؛ 0.226 ± 0.018 عند 64 نقطة في SE ؛ الجدول 2 ، الشكل 3) فيما يتعلق بطريقة الحلب بالفراغ أو الذيل. علاوة على ذلك ، كانت عينات البلازما المتساقطة شفافة بشكل أساسي. ترتبط قيم الامتصاص الأعلى (52 و 55 dpSE) باللون الوردي للعينات (البيانات غير معروضة). قد تشير هذه النتائج إلى أن الطريقة الأخيرة هي الأفضل للحصول على عينات ذات جودة عالية جدا للتحليل.
الشكل 1: الخطوات الرئيسية لسير عمل أخذ عينات البلازما. (أ) المواد اللازمة لسحب الدم والفئران في الإطار التجسيمي ، جاهزة للتجميع ؛ (ب، ج) تكبير الذيل بإبرة فراشة 21G يتم إدخالها في وريد الذيل الجانبي وتسقط قطرة الدم على جدران أنبوب التجميع بمضاد للتخثر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخطوات الرئيسية لسير عمل أخذ عينات السائل الدماغي الشوكي (CSF). (أ) المواد اللازمة لسحب السائل الدماغي الشوكي والجرذان في الإطار التجسيمي ، قبل وقت قصير من الجمع ؛ (ب) تحضير إبرة الفراشة 23G عن طريق قطع حماية الغلاف البلاستيكي بحيث يتم كشف نهاية الإبرة العارية لمدة 7 مم لضمان الاختراق الصحيح في الصهريج العظيم ؛ (ج) يميل رأس الجرذ لأسفل بمقدار 45 درجة أثناء الانسحاب. د: التكبير في الموقع المعيني بإدخال إبرة فراشة في الصهريج الكبير. لاحظ السائل الدماغي النخاعي الذي يرتفع في الأنبوب ، ويشار إليه بطرف العلامة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم جودة عينات البلازما. تم قياس درجة انحلال الدم عند 414 نانومتر للهيموجلوبين الحر بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية في عينات البلازما ل 9 في 5 نقاط زمنية (52 و 55 و 58 و 61 و 64 يوما بعد حالة الصرع ، dpSE) باستخدام طرق مختلفة: اليوم 52 - تقنية الفراغ. اليوم 55 - حلب الذيل. أيام 58-64 تم استخدام تقنيات الإسقاط. كان الانخفاض في الهيموجلوبين الحر في البلازما التي تم الحصول عليها بتقنية السقوط مقارنة بطرق الحلب الفراغي والذيل كبيرا (* p <0.05 وفقا لاختبار ANOVA أحادي الاتجاه واختبار المقارنة المتعددة ل Tukey بعد التخصيص). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: معدلات نجاح عمليات سحب CSF. مقارنة معدلات نجاح الانسحاب المتكرر ل CSF في ثلاث مجموعات تجريبية من معبرا عنها كنسبة مئوية من الانسحابات الناجحة خلال 5 أيام. تم تعيين القيمة 1 للسحب الناجح لما > 100 ميكرولتر من السائل الدماغي النخاعي الصافي ؛ تم تعيين القيمة الصفرية لعمليات السحب < 100 ميكرولتر و / أو CSF غير واضح. الاختصارات: N / A - عدم وجود مجموعة بسبب فقدان القنية أثناء إجراء أخذ العينات (التصوير المقطعي فقط) ؛ CT - مربوط مقنن ؛ PT - ثقب مربوط ؛ PTe - أقطاب القياس عن بعد المثقوبة المزروعة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: تقييم انحلال الدم في عينات البلازما. نتائج قياسات انحلال الدم في 5 نقاط زمنية باستخدام ثلاث طرق مختلفة لأخذ عينات الدم: اليوم 52 - تقنية الفراغ. اليوم 55 - حلب الذيل. أيام 58-64 تقنيات الإسقاط. ترتبط قيم >0.3 من الامتصاص باللون الوردي للعينات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
يوضح هذا العمل تقنية سهلة الإتقان ل CSF وجمع الدم في الفئران ، والتي قد تكون مفيدة ليس فقط للدراسات في نماذج الصرع ولكن أيضا للحالات أو الأمراض العصبية الأخرى مثل مرض الزهايمر أو باركنسون أو التصلب المتعدد. في أبحاث الصرع ، تعتبر كل من إجراءات أخذ العينات إلى جانب تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو مثالية عند متابعة العلاقة بين مستويات الجزيئات المختلفة القابلة للذوبان ونشاط النوبات. لهذا السبب المحدد ، تم استخدام تسجيل مستمر لتخطيط كهربية الدماغ بالفيديو: i) من أجل تشخيص الصرع بشكل صحيح أو ii) لمراقبة المراحل المختلفة لتطور المرض ، و / أو iii) لربط أخذ العينات بحدوث نوبات عفوية. يمكن إجراء تقنيات أخذ العينات هذه في الفئران المخدرة ، مما يسبب الحد الأدنى من الإجهاد.
الخطوات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها وقيود الأسلوب
يحتوي البروتوكول على بعض الخطوات الفنية الهامة. أولا ، قد يكون من الصعب العثور على المكان الصحيح لجمع CSF في المحاولة الأولى. إذا غاب المشغل عن الصهريج العظيم في المحاولة الأولى ، فإن أي تجربة لاحقة ستكون ملوثة بالدم ، حيث سينزف من جرح الإبرة. من وجهة النظر هذه ، يعتمد النجاح في المجموعة بشكل كبير على مهارة المشغل. ثانيا ، تحتاج بعض خطوات سحب الدم إلى عناية خاصة. على وجه الخصوص ، هناك خطر كبير من انحلال الدم إذا قام المشغل بفرك الذيل بقوة شديدة بالإيثانول ، أو إذا كانت درجة حرارة الماء المستخدم في توسع أوعية الوريد الذيل أعلى من 42 درجة مئوية ، أو إذا تم خلط الدم في أنبوب التجميع مع مضادات التخثر بقوة كبيرة. خصوصية أخرى لجمع الدم في الصرع المزمن هي تأثير بطء القلب على معدل سقوط الدم من الوريد الذيل33. إذا كان هذا بطيئا جدا ، فقد يتخثر الدم على جدران أنبوب التجميع. لتجنب هذه المشكلة ، يتمثل أحد الخيارات في تقسيم العينات إلى أنبوبين للتجميع ، مما يقلل من حجم الدم / الأنبوب. أخيرا ، هناك مأزق واحد جوهري لدراسات الصرع. قد يؤدي الإجهاد الناجم عن التلاعب بالحيوانات قبل أخذ العينات إلى حدوث نوبات ، والتي بدورها قد تتداخل مع مستويات الجزيئات قيد التحقيق34. كلما كان ذلك ممكنا ، ضع غرفة تحريض التخدير في قفص المنزل واسمح للحيوان بدخوله تلقائيا. كتعديل للبروتوكول المقترح ، يمكن استخدام المقيد لإجراء سحب الدم دون تخدير إيزوفلوران. ومع ذلك ، يمكن القيام بذلك في القياس عن بعد ، ولكن ليس في المربوطة ، لأن الفئران المربوطة قد تفقد غرسات رأسها أثناء هذا الإجراء.
وجود مشغل مدرب جيدا وبذل أقصى جهد لتجنب الإجهاد ، فإن القيد الوحيد للبروتوكول الحالي هو الحد الأقصى للحجم الذي يمكن سحبه دون المساس بصحة. وفقا للمعايير الحالية ، يوصى بجمع 100 ميكرولتر كحد أقصى من السائل الدماغي الشوكي لمدة 4 مرات على مدار 15 يوما فيواحد 32. وبالمثل ، يقترح جمع أقل من 10٪ من إجمالي حجم الجسم في عينة واحدة وأقل من 15٪ من إجمالي حجم جسم الدم في 28 يوما30,31.
مقارنة الطريقة مع التقنيات الأخرى
وللنهج المقترحة لأخذ عينات السائل الدماغي النخاعي والبلازما التي تم حلها زمنيا العديد من المزايا فيما يتعلق بالطرق البديلة الموجودة. أولا ، ثقب الصهريج الكبير المستخدم لأخذ عينات من السائل الدماغي النخاعي في الفئران المصابة بالصرع لديه خطر أقل لفقدان زرع الرأس مقارنة بالنظام المقن إذا اقترن بمخطط كهربية الدماغ المربوط. على عكس إجراءات البزل ، فإن القنية المتصلة بالقطب بواسطة الأسمنت السني (ضخمة وثقيلة لرؤوس) ، في حين يتم طلبها من خلال المرفقات / الانفصالات المتكررة لعمليات سحب السائل الدماغي الشوكي ، فهي أكثر عرضة للضياع على مدار عدة أيام من أخذ العينات. في الواقع ، تظهر نتائج معدل النجاح كيف أن بعض المقننة (N / A) لا تصل إلى النقاط الزمنية المتقدمة لأخذ العينات ، وبالتالي تفقد العينات الخاصة بها (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن طريقة البزل تتفوق على النهج المقنوي من حيث العقم الأفضل وتقليل التفاعل السحائي مع زيادة محدودة في محتوى الخلايا والألبومين في السائل الدماغي الشوكي ، كما تم توثيقه سابقا من قبل22،35،36 أخرى. قد تكون درجة الكريات البيض CSF وتلوث الألبومين مهمة لصحة الطرق المستخدمة لقياس المؤشرات الحيوية للصرع35. ثانيا ، طريقة إسقاط السقوط الحر لأخذ عينات بلازما الدم المستخدمة للمقاييس المتكررة تتفوق على أي طريقة انسحاب أخرى لأنها ليست نهائية (عدم التعافي) ، على عكس قطع الرأس أو ثقب القلب أو الأوعية الدموية البطنية / الصدرية أو الانسحاب خلف الحجاج وتسمح بأخذ عينات دم متعددة. إنه أبسط من العديد من تقنيات سحب فراغ الدم في الوريد الذيل ، لأنه لا يتطلب أنابيب28,37 وينتج عينات بلازما خالية من انحلال الدم ذات جودة عالية لمزيد من تحليلات sncRNA التي تركز على تحديد المؤشرات الحيوية المفترضة لتكوين الصرع38. تم تأكيد عدم وجود الهيموجلوبين الحر في العينات ، عند استخدام تقنية أخذ العينات بالسقوط أو تجنب حلب الذيل ، من خلال نتائج امتصاص منخفضة لعينات البلازما (الجدول 2) بما يتماشى مع الإجراءات المنشورة سابقا المناسبة لتقييم محتوى بلازما sncRNA39,40.
التطبيقات والتوجهات المستقبلية
يمكن تطبيق الطرق الموصوفة أعلاه لقياس الجزيئات القابلة للذوبان ذات الأهمية في أي نموذج للأمراض العصبية. مثال محدد هو أخذ عينات من السوائل البيولوجية لتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة / المفترضة للصرع. هناك حاجة طبية ملحة لم تتم تلبيتها لاكتشاف هذه المؤشرات الحيوية للأشخاص المصابين بالصرع ، وخاصة المؤشرات الحيوية للتنبؤ والحساسية / المخاطر ، لأنها غير موجودة بعد.
في الختام ، فإن البروتوكول الحالي ممكن في الفئران ، بما في ذلك الفئران المصابة بالصرع ، ويسهل تشغيله للأفراد المدربين. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بأخذ عينات متعددة عالية الجودة في الدراسات الطولية وفقا لمبدأ 3Rs (أي الاستبدال والتخفيض والصقل)41.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذه الدراسة بمنحة من برنامج عمل أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (اتصل ب H2020-FETOPEN-2018-2020) بموجب اتفاقية المنحة 964712 (PRIME ؛ إلى M. Simonato).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL | Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved