معالجة القضايا العملية في المسافة البادئة الدقيقة القائمة على مجهر القوة الذرية على نباتات الغضروف المفصلي البشري

نقدم نهجا خطوة بخطوة لتحديد ومعالجة المشكلات الأكثر شيوعا المرتبطة بالمسافات البادئة الدقيقة للقوة الذرية. نحن نمثل المشاكل الناشئة في نباتات الغضاريف المفصلية البشرية الأصلية التي تتميز بدرجات مختلفة من التنكس الناجم عن هشاشة العظام.

لا شك أن مجهر القوة الذرية (AFM) هو حاليا أحد أقوى التقنيات وأكثرها فائدة لتقييم الإشارات الدقيقة وحتى النانوية في المجال البيولوجي. ومع ذلك ، كما هو الحال مع أي نهج مجهري آخر ، يمكن أن تنشأ تحديات منهجية. على وجه الخصوص ، يمكن أن تؤدي خصائص العينة وإعداد العينة ونوع الأداة ومسبار المسافة البادئة إلى قطع أثرية غير مرغوب فيها. في هذا البروتوكول ، نمثل هذه المشكلات الناشئة على نباتات الغضروف المفصلي الصحية وكذلك العظمية. تحقيقا لهذه الغاية ، نعرض أولا من خلال نهج خطوة بخطوة كيفية إنشاء وتصنيف وتصنيف أقراص الغضروف المفصلية خارج الجسم الحي بصريا وفقا لمراحل مختلفة من التنكس عن طريق تصوير مضان الفسيفساء 2D الكبير لنباتات الأنسجة بأكملها. تتمثل القوة الرئيسية للنموذج خارج الجسم الحي في أنه يشتمل على غضروف بشري قديم وأصلي يسمح بالتحقيق في التغيرات المرتبطة بهشاشة العظام من البداية المبكرة إلى التقدم. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا عرض المزالق الشائعة في إعداد الأنسجة ، وكذلك إجراء AFM الفعلي مع تحليل البيانات اللاحق. نوضح كيف يمكن للخطوات الأساسية ولكن الحاسمة مثل إعداد العينات ومعالجتها ، وخصائص العينة الطبوغرافية الناتجة عن الانحطاط المتقدم ، وتفاعل طرف العينة أن تؤثر على الحصول على البيانات. نخضع أيضا للتدقيق المشاكل الأكثر شيوعا في AFM ونصف ، حيثما أمكن ، كيفية التغلب عليها. إن معرفة هذه القيود ذات أهمية قصوى للحصول على البيانات الصحيحة وتفسيرها ، وفي النهاية تضمين النتائج في سياق علمي واسع.

نظرا للحجم المتقلص باستمرار للأجهزة والأنظمة الإلكترونية ، اكتسب التطور السريع للتكنولوجيا والمعدات القائمة على الميكرو والنانو زخما. أحد هذه الأجهزة هو مجهر القوة الذرية (AFM) ، والذي يمكنه مسح الأسطح البيولوجية واسترداد المعلومات الطبوغرافية أو الميكانيكية الحيوية على مقياس نانو وميكرومتر ^1,2. من بين ميزاتها الواسعة ، يمكن تشغيل هذه الأداة كأداة صغيرة وكذلك نانو إندينتر للحصول على معلومات حول الخواص الميكانيكية للأنظمة البيولوجية^{المختلفة 3}،^4،5،6. يتم جمع البيانات عن طريق الاتصال المادي مع السطح من خلال مسبار ميكانيكي ، والذي يمكن أن يكون صغيرا مثل حوالي 1 نانومتر عند طرفه⁷. ثم يتم عرض التشوه الناتج للعينة بناء على عمق المسافة البادئة لطرف الكابولي والقوة المطبقة على العينة⁸.

هشاشة العظام (OA) هو مرض مزمن تنكسي طويل الأمد يتميز بتدهور الغضروف المفصلي في المفاصل والأنسجة المحيطة ، مما قد يؤدي إلى التعرض الكامل لأسطح العظام. عبء الزراعة العضوية كبير. وفي الوقت الراهن، يعاني نصف جميع النساء وثلث جميع الرجال الذين تبلغ أعمارهم 65 عاما أو أكثر من الزراعة العضوية⁹. تحدد الصدمات والسمنة والميكانيكا الحيوية المتغيرة الناتجة عن المفصل¹⁰ تنكس الغضروف المفصلي ، والذي ينظر إليه على أنه نتيجة نهائية شائعة. افترضت الدراسة الرائدة ل Ganz et al. أن الخطوات المبكرة لعملية الزراعة العضوية قد تتضمن الخواص الميكانيكية الحيوية للغضروف¹¹ ، ومنذ ذلك الحين أكد الباحثون هذه الفرضية¹². وبالمثل ، من المقبول عموما أن يتم تنسيق الخصائص الميكانيكية الحيوية للأنسجة وظيفيا من خلال التنظيم الفائق بالإضافة إلى الحديث المتبادل بين الخلايا والخلايا ومصفوفة الخلية. أي تعديلات يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الأداء الميكانيكي الحيوي الكلي للأنسجة¹³. حتى الآن ، يعد تشخيص هشاشة العظام سريريا ويستند إلى التصوير الشعاعي للفيلم العادي¹⁴. هذا النهج ذو وجهين: أولا ، عدم وجود عتبة قطع تنكسية محددة لصياغة تشخيص هشاشة العظام يجعل من الصعب تحديد الحالة ، وثانيا ، تفتقر طرق التصوير إلى الحساسية والتوحيد القياسي ولا يمكنها اكتشاف تلف الغضروف الموضعي¹⁵،^16،17. تحقيقا لهذه الغاية ، فإن تقييم الخواص الميكانيكية للغضروف له ميزة حاسمة أنه يصف المعلمة التي تتغير خلال مسار الزراعة العضوية بغض النظر عن مسببات المرض ولها تأثير مباشر على وظائف الأنسجة في مرحلة مبكرة جدا. تقيس أدوات المسافة البادئة القوة التي يقاوم بها النسيج المسافة البادئة. هذا ، في الواقع ، ليس مفهوما جديدا. تعود أقدم الدراسات إلى ثمانينيات و تسعينيات القرن العشرين. في هذه الفترة ، اقترحت العديد من الدراسات أن أدوات المسافة البادئة المصممة للقياسات بالمنظار للغضروف المفصلي يمكن أن تكون مناسبة تماما للكشف عن التغيرات التنكسية في الغضروف. حتى قبل 30 عاما ، تمكنت بعض الدراسات من إثبات أن أدوات المسافة البادئة كانت قادرة على اكتشاف التغيرات في الجسم الحي في سطح الغضروف أثناء تنكس الأنسجة عن طريق إجراء قياسات صلابة الانضغاط أثناء تنظير المفصل¹⁸،^19،20.

توفر المسافة البادئة AFM (AFM-IT) للغضروف المفصلي معلومات حول خاصية ميكانيكية محورية للأنسجة ، وهي الصلابة. هذه معلمة ميكانيكية تصف العلاقة بين الحمل المطبق غير المدمر والتشوه الناتج لمنطقة الأنسجة البادئة²¹. لقد ثبت أن AFM-IT قادر على تحديد التعديلات المعتمدة على العمر في الصلابة في شبكات الكولاجين غير المتأثرة مجهريا ، وبالتالي التمييز بين التغيرات المرضية المرتبطة ببداية الزراعة العضوية (الدرجة 0 على مقياس Outerbridge في الغضروف المفصلي)²². لقد أظهرنا سابقا أن AFM-ITs ، على أساس تنظيم الخلايا الغضروفية المكانية كمؤشر حيوي قائم على الصور لتنكس الغضروف المبكر ، لا يسمح فقط بالقياس الكمي ولكن أيضا تحديد التغيرات الميكانيكية التنكسية المبكرة. وقد تم تأكيد هذه النتائج بالفعل من قبل الآخرين^23,24. وبالتالي ، يعمل AFM-IT كأداة مثيرة للاهتمام لتشخيص وتحديد التغيرات التنكسية المبكرة. يمكن قياس هذه التغييرات بالفعل على المستوى الخلوي ، وإعادة تشكيل فهم عملية الفيزيولوجيا المرضية OA.

في هذا البروتوكول ، نعرض إجراء تصنيف نسيجي وميكانيكي حيوي كامل لنباتات الغضروف المفصلي ، من تحضير نبات الغضروف الأصلي إلى الحصول على بيانات AFM ومعالجتها. من خلال نهج خطوة بخطوة ، نوضح كيفية إنشاء أنسجة الغضاريف المفصلية وتصنيفها وتصنيفها بصريا وفقا لمراحل مختلفة من التنكس عن طريق تصوير الفسيفساء الكبير 2D ، متبوعا بمسافات بادئة micro-AFM.

على الرغم من أن AFM-IT ، حاليا ، هي واحدة من أكثر الأدوات حساسية لقياس التغيرات الميكانيكية الحيوية في الغضروف⁷ ، مثل أي تقنية مفيدة أخرى ، إلا أن لها قيودا وخصائص عملية²⁵ يمكن أن تؤدي إلى الحصول على بيانات خاطئة. تحقيقا لهذه الغاية ، نخضع للتدقيق المشاكل الأكثر شيوعا التي تنشأ أثناء قياسات AFM لنباتات الغضاريف ونصف ، حيثما أمكن ، كيفية تقليلها أو التغلب عليها. وتشمل هذه الجوانب الطبوغرافية للعينات والصعوبات في تثبيتها في بيئة متوافقة مع AFM ، والخصائص الفيزيائية لسطح الأنسجة ، والصعوبات الناتجة في إجراء قياسات AFM على هذه الأسطح. كما يتم تقديم أمثلة على منحنيات مسافة القوة الخاطئة ، مع التركيز على الظروف التي قد تسببها. كما تمت مناقشة القيود الإضافية المتأصلة في هندسة الطرف الكابولي واستخدام نموذج هيرتز لتحليل البيانات.

تم استخدام اللقمة الفخذية التي تم جمعها من المرضى الذين يخضعون لتقويم مفاصل الركبة الكلي في مستشفى جامعة توبنغن ، ألمانيا. تم تضمين عينات الغضروف المفصلي فقط من المرضى الذين يعانون من أمراض المفاصل التنكسية وما بعد الصدمة في هذه الدراسة. تم الحصول على موافقة اللجنة الأخلاقية الإدارية والمؤسسية والمحلية قبل بدء الدراسة (المشروع رقم 674/2016BO2). تم تلقي موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى قبل المشاركة.

ملاحظة: يرد مخطط انسيابي لخطوات التجربة بترتيبها الزمني في الشكل 1.

1. معالجة الأنسجة وتوليد أقراص الغضاريف

1. تحضير الأنسجة
   1. بعد الاستئصال بعد الجراحة ، ضع عينات الغضروف في وعاء مملوء بوسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 5٪ (v / v) البنسلين والستربتومايسين. تأكد من غمر العينات بالكامل في الوسط. يجب ألا تتجاوز المدة بين الاستئصال الجراحي والمعالجة الإضافية للغضروف 24 ساعة. تأكد من أن العينات مغمورة بالكامل في الوسائط طوال عملية المعالجة بأكملها لتجنب تجفيف العينة.
   2. قطع الغضروف بعيدا عن العظام باستخدام مشرط.
2. توليد القرص الغضروفي
   1. قم بإنشاء أقراص غضروفية بقطر 4 مم باستخدام لكمة خزعة.
      ملاحظة: من المهم تحديد واستئصال مناطق اللقمة حيث يتجاوز سمك طبقة الغضروف 1 مم. قد يكون هذا مشكلة ، خاصة حول المناطق الحاملة ، حيث تفقد طبقة الغضروف عادة سمكها بسبب عمليات البلى أو التنكس.
   2. ضع أقراص الغضروف مقاس 4 مم التي تم إنشاؤها مسبقا على جهاز قطع مصنوع خصيصا وقم بتثبيت أقراص الغضروف وتثبيتها ثابتة عن طريق ملعقة. عند وضع أقراص الغضروف على جهاز القطع ، يجب توخي الحذر. ضع العينات بحيث لا تواجه الطبقة العليا للغضروف (المنطقة السطحية للغضروف المفصلي) الشفرة
   3. قطع أقراص الغضروف بشفرة حلاقة. وبالتالي ، يتم إنشاء عينات غضروفية على شكل قرص من 4 مم × 1 مم. لمنع تجفيف العينة ، قم بإجراء قطع الأنسجة في أسرع وقت ممكن.
   4. اجمع كل قرص بمساعدة ملعقة وضع أقراص الغضاريف المتولدة في أنابيب سعة 1.5 مل تحتوي على 1 مل من DMEM المكمل ب 5٪ (v / v) البنسلين والستربتومايسين. ضع ما يقرب من 15 قرصا في أنبوب واحد.
3. التقسيم البردي لأقراص الغضاريف (للشرائح العمودية)
   ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ، ويمكن استخدامها إذا كان من المطلوب تصور الرؤية الجانبية لتوزيع النمط الخلوي داخل أقراص الغضروف. يمكن استخدامه كطريقة للتحقق حيث أن توزيع النمط الخلوي هو ميزة 3D للغضروف المفصلي²⁶. يمكن أيضا استخدام التقسيم البصري وإعادة بناء 3D لأقراص الغضروف بأكملها باستخدام مجهر متحد البؤر ، وبالتالي إزالة الحاجة إلى تقسيم العينات كما هو موضح في البروتوكول.
   1. قم بتغطية قرص الغضروف بوسط تضمين قابل للذوبان في الماء وضعه على حافته على مقبض cryotome (مع سطح القرص عموديا على سطح المقبض). في جهاز cryotome ، يتجمد وسيط التضمين في درجات حرارة منخفضة.
   2. باستخدام cryotome قياسي ، قسم الأنسجة جانبيا بسمك 60 ميكرومتر حتى يتم الوصول إلى منتصف القرص (أي عندما يصل طول عمليات التقطيع بالتبريد إلى 4 مم) وجمع الشرائح. من خلال تقسيم القرص بشكل عمودي ، يمكن تصور جميع مناطق الغضروف (السطحية والمتوسطة والعميقة).
   3. اجمع الأقسام الموجودة على شريحة زجاجية وقم بإزالة وسط التضمين القابل للذوبان في الماء عن طريق الغسيل ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).

2. فرز قرص الغضروف كدالة للنمط المكاني الخلوي

1. تلطيخ عينات الغضروف على شكل قرص
   1. ضع قرصا غضروفيا واحدا (القسم 1.2) في كل بئر من صفيحة 96 بئرا وأضف 130 ميكرولتر من صبغة مضان نفاذة للخلايا بتخفيف 1: 1000 لكل بئر.
   2. افحص اللوحة بأكملها بصريا وتأكد من وضع قرص واحد فقط في كل بئر. احتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا القياسية عند 37 درجة مئوية.
2. تلطيخ شرائح الغضروف 60 ميكرومتر
   1. ضع أقسام قرص الغضروف برفق (القسم 1.3) على شرائح المجهر الزجاجي بمساعدة الملقط.
   2. قم بتغطية أقسام الغضروف بوسط تثبيت يحتوي على تلطيخ مضاد ل DAPI النووي وضع برفق أغطية مناسبة للفحص المجهري الفلوري.
   3. أغلق حواف كل غطاء بطلاء أظافر شفاف منتظم واتركه يجف لمدة 3 دقائق.
3. فرز وتصوير الغضروف من أعلى إلى أسفل ومن الجانب
   ملاحظة: يجب فحص كل قرص تحت مجهر الفلورسنت. الهدف من هذه الخطوة هو فرز الأقراص بناء على نمطها الخلوي السائد (سلاسل مفردة أو سلاسل مزدوجة أو مجموعات صغيرة أو مجموعات كبيرة أو منتشرة).
   1. ضع لوحة 96 بئرا على حامل لوحة المجهر الفلوري.
   2. حدد مرشح التألق المناسب إما Em 495 nm / Ex 515 nm (للتصوير من أعلى إلى أسفل لأقراص الغضاريف المعدة في القسم 2.1.) أو Em 358 nm / Ex 461 nm (للتصوير الجانبي لأقسام الغضروف المعدة في القسم 2.2) والهدف 10x.
      ملاحظة: يسمح استخدام الهدف 10x بفحص محيط القرص بالكامل ، ويمكن استبعاد العينات ذات التلوين غير المتجانس أو غير المناسب. ومع ذلك ، فإن استخدام العرض من أعلى إلى أسفل فقط قد يؤدي إلى إدراك التغيرات في التنظيم الخلوي نتيجة لتحليل طبقات الأنسجة العميقة التي أصبحت مرئية للمراقبة من أعلى إلى أسفل عن طريق التآكل السطحي. على سبيل المثال ، يمكن اعتبار الخيط الصاعد الذي يتبع أروقة الكولاجين على أنه خلية واحدة أو خلايا مبعثرة (نمط منتشر)²⁶. نتيجة لذلك ، يجب فحص جانبي الأقراص لضمان اختيار النمط الخلوي المناسب.
   3. حدد بصريا النمط الخلوي المعروض في كل قرص غضروف. من غير المحتمل أن يحتوي القرص على نوع واحد فقط من الأنماط الخلوية. بالنسبة لجزء القرص الذي لا يتطابق فيه ترتيب الخلايا الغضروفية مع نمط الاهتمام ، اقبل العينات فقط إذا كان النمط غير المرغوب فيه في المحيط ، حيث لا يتم إجراء قياسات AFM (أي ما يصل إلى 0.5 مم من حدود القرص) ، وتأكد من أن هذا لا يتجاوز 10٪ من إجمالي سطح القرص^{27 ، 28}.
4. الحصول على صورة لأقراص الغضروف بأكملها
   1. حدد الهدف 10x من المجهر وضعه أسفل البئر المحدد مسبقا الذي يحتوي على قرص غضروفي فردي. ركز على القرص لرؤية النمط الخلوي.
   2. حدد وظيفة المستكشف للحصول على نظرة عامة على البئر بالكامل. استخدم زر الماوس الأيسر واسحب للانتقال إلى موضع مرحلة مختلف. باستخدام عجلة الماوس ، قم بالتكبير والتصغير.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن رؤية معاينة البئر مع العينة بأكملها بالنقر المزدوج على كل منطقة اهتمام بالتتابع.
   3. حدد مربعا يشمل منطقة الاهتمام المراد مسحها ضوئيا ؛ في هذه المرحلة ، ستصبح جميع البلاطات الفردية التي تتكون منها الفسيفساء مرئية.
   4. اضبط شدة التعرض / الضوء بحيث يمكن رؤية الخلايا بوضوح من الخلفية. في هذه المرحلة ، تم ضبط سطوع / تباين الصورة لجميع المربعات ولم يعد من الممكن تخصيصها بشكل فردي لكل بلاطة.
      ملاحظة: نظرا لأن الخلايا القريبة من حافة القرص غالبا ما تصدر إشارة مضان أعلى من الخلايا الموجودة في المركز ، يجب تكييف إعدادات التعرض / شدة الضوء.
      1. لتقييم ما إذا كان وقت التعرض مناسبا لقناة معينة ، افحص توزيع الإشارة في الرسم البياني. باستخدام آلية التعرض التلقائي المضمنة في برنامج صورة المجهر ، تصور جميع الخلايا الموجودة داخل القرص.
   5. حدد خيار Focus Map Point الخاص بالبرنامج ، ثم حدد كل بلاطة فردية بالنقر بزر الماوس الأيسر في وسطها.
   6. حدد الخيار خريطة التركيز. يتم عرض نافذة مع جميع التجانبات المحددة مسبقا. انقر نقرا مزدوجا فوق مربع في القائمة لعرضه ووضعه في التركيز المناسب.
   7. انقر فوق تعيين Z لحفظ الخطة البؤرية والمتابعة إلى اللوحة التالية. بعد ضبط الخطة البؤرية لكل لوحة على حدة، ابدأ الحصول على الصور بالضغط على Start Scan.
      1. إذا كان المسح الضوئي يعرض أشرطة أفقية و/أو رأسية أغمق، فقد يرجع ذلك إلى الإضاءة غير الصحيحة وغير المتساوية للإطارات المفردة. حل هذه المشكلة باستخدام خيار التظليل المرتبط المدمج في البرنامج قبل الفحص الفعلي.
   8. حفظ الصور وتصديرها وإضافة تعليقات توضيحية إليها بشكل صحيح.

3. النهج الميكانيكي الحيوي لنباتات الغضاريف

1. تحضير العينة لقياسات AFM
   1. ثبت كل قرص غضروفي محدد مسبقا يحتوي على نمط خلوي (القسم 2) في أطباق بتري عن طريق غراء متوافق حيويا. أضف عينة كافية من الغراء على الجوانب العلوية والسفلية واليسرى واليمنى من القرص.
   2. قم بتغطية الأقراص ب 2.5 مل من وسط L-15 من Leibovitz بدون L-glutamine. أضف وسط Leibowitz برفق إلى العينات لتجنب انفصال العينة عن السطح بسبب الموجات الناتجة عن الوسط.
2. تحميل العينات في AFM
   1. ضع طبق بتري في حامل عينة جهاز AFM وقم بتشغيل سخان أطباق بتري مضبوطا على 37 درجة مئوية. اسمح لطبق زراعة الأنسجة بالوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة. يتم ذلك لاستبعاد القطع الأثرية المحتملة الناجمة عن اختلاف درجة الحرارة.
3. معايرة ناتئ AFM
   1. قم بتهيئة إعداد البرنامج كما هو موضح سابقا بواسطة Danalache et ^al.29.
   2. حدد حامل ناتئ زجاجي مناسب لقياسات السائل وضعه بعناية على رأس AFM. تعمل آلية القفل على تأمين الكتلة الزجاجية في رأس AFM. تأكد من أن السطح العاكس للكتلة الزجاجية مستقيم ومتوازي مع حامل AFM.
   3. ضع الكابولي على سطح حامل الكابولي الزجاجي بعناية. يجب أن يرتكز الكابولي نفسه على المستوى البصري المصقول ، في وسط الكتلة الزجاجية.
   4. ضع بعناية تنورة سيليكون (غشاء سيليكون) على قاعدة حامل الكابولي لمنع التكثيف المتوسط في رأس AFM.
   5. اخفض الكابولي بخطوات 100 ميكرومتر باستخدام وظيفة محرك السائر حتى يتم غمره بالكامل في الوسط.
   6. قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي باستخدام معلمات النهج التي وصفها Danalache et ^al.29. اسحب الكابولي بمقدار 100 ميكرومتر بمجرد الوصول إلى قاع طبق بتري.
   7. قم بمعايرة الكابولي باستخدام الخطوات الدقيقة وقم بتشغيل المعلمات التي وصفها Danalache et ^al.29. في نهاية المعايرة ، يتم حفظ الانحراف الرأسي وعرضه بوحدات نيوتن (N) للقوة بدلا من فولت (V) - وحدة التسجيل الأصلي بواسطة كاشف الصمام الثنائي الضوئي. في التجارب هنا ، نتجت نقطة ضبط 4.47 nN بعد المعايرة.
   8. باستخدام وظيفة محرك السائر ، اسحب الكابولي إلى 1000 ميكرومتر.
4. تحديد موقع قياس الغضروف المطلوب تحت AFM
   ملاحظة: نظرا لسمك أقراص الغضروف 1 مم ، فإن الكابولي غير مرئي في مجال الرؤية أثناء التنقل فوق العينة.
   1. استخدم كاميرا CCD للمجهر لتحديد الكابولي. يجب وضع ناتئ AFM في منطقة خالية من العينات من طبق بتري.
   2. ابدأ نهج الماسح الضوئي باستخدام الكابولي على منطقة نظيفة وخالية من العينات من طبق بتري ، باستخدام نفس المعلمات التي وصفها Danalache et ^al.29.
   3. مزيد من سحب الكابولي 1.5 مم بعيدا عن الجزء السفلي من اللوحة مع التحكم في محرك السائر. هذه الخطوة حاسمة لتجنب التصادم المباشر بين الكابولي والعينة.
   4. قم بالتبديل من عرض برايتفيلد إلى عرض مضان وحدد الجزء العلوي من القرص بصريا.
   5. حرك حامل عينة AFM بالضبط 2 مم باتجاه منتصف القرص. تعتبر هذه النقطة مركز القرص الغضروفي.
   6. قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي ، وبمجرد الوصول إلى سطح قرص الغضروف ، اسحب الكابولي بمقدار 100 ميكرومتر.
5. قياسات منحنى مسافة القوة
   1. ركز على الخلايا الموضوعة في موقع القياس المطلوب. انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء القياسات وتوليد منحنيات مسافة القوة في الموضع المستهدف.
   2. احصل على خمسة منحنيات لمسافة القوة في كل موقع قياس. اسحب الكابولي بمقدار 500 ميكرومتر وانقل الكابولي إلى موقع القياس التالي.
      ملاحظة: يعد تراجع الكابولي خطوة حاسمة ، لأن سطح قرص الغضروف غير متجانس وبه مخالفات. يمكن أن يؤدي التل المرتفع على سطح العينة إلى تصادم دراماتيكي ، مما يؤدي إلى تلف طرف ناتئ / عينة غير مرغوب فيه. نوصي باختيار ما لا يقل عن خمسة مواقع قياس مختلفة منتشرة عبر سطح القرص والحصول على ما لا يقل عن خمسة منحنيات لمسافة القوة في كل موقع.
   3. افحص منحنيات مسافة القوة واحفظها.
6. تقدير وحدات يونغ باستخدام نموذج هيرتز فيت
   1. افتح منحنيات مسافة القوة التي تم إنشاؤها ليتم تحليلها (ملف .jpk) في برنامج تحليل البيانات باستخدام خيار فتح مجموعة من منحنيات التحليل الطيفي .
   2. حدد نموذج ملاءمة هرتز ثم حدد خيار ملاءمة المرونة .
      1. يقوم خيار ملاءمة المرونة تلقائيا بإجراء الحسابات التالية على منحنى مسافة القوة المحدد: يحسب خط الأساس ويطرح من المنحنى بأكمله لإزالة إزاحة خط الأساس (يتم إرجاع خط الأساس إلى الصفر على المحور ص) ؛ يحدد نقطة الاتصال عن طريق اكتشاف النقطة التي يعبر فيها منحنى مسافة القوة خط القوة الصفرية (يتم ضبط نقطة الاتصال على الصفر على المحور السيني) ؛ يحسب فصل عينة الطرف (يتم طرح إشارة ارتفاع بيزو التي تمثل ثني الكابولي) ؛ ويناسب منحنى مسافة القوة تلقائيا مع الطراز المحدد. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أيضا تنفيذ كل خطوة من هذه الخطوات بشكل مستقل.
   3. التكيف باستخدام معلمات الملاءمة التالية: نسبة بواسون 0.5 ونصف قطر طرف الكابولي المناسب.
      ملاحظة: عند استخدام ناتئ بطرف ناتئ كروي ، يجب استخدام نموذج Hertz fit. كان للناتئ المستخدم في هذه الدراسة طرف كروي نصف قطره 5 ميكرومتر. نوصي بتركيب منحنى مسافة القوة حتى يتم الوصول إلى أقصى قوة مطبقة (نقطة الضبط).
   4. تحقق بصريا من ملاءمة منحنى مسافة القوة لضمان صحتها. يجب القيام بهذه الخطوة لكل من منحنيات مسافة القوة التي تم تحليلها.
7. تحديد عمق المسافة البادئة
   ملاحظة: اعتمادا على أداة تحليل البيانات المستخدمة، قد تختلف هذه العملية. يمكن للمجرب قراءة عمق المسافة البادئة بسهولة باتباع سلسلة من الخطوات المضمنة في برنامج تحليل البيانات.
   1. افتح كل من منحنيات مسافة القوة التي تم إنشاؤها في برنامج تحليل البيانات وحدد نموذج Hertz fit كعملية تحليل.
   2. قم بتطبيق خيار طرح إزاحة الخط الأساسي لتصفير محور الانحراف الرأسي (المحور ص) وحدد دالة الإزاحة + الإمالة .
   3. استخدم وظيفة البحث عن نقطة اتصال لتحديد نقطة الاتصال تلقائيا ، والتي يتم إحداثها تلقائيا إلى إحداثي x يساوي صفرا.
   4. اطرح المسافة التي تمثل فقط انحراف الكابولي من ارتفاع بيزو الخام أثناء المسافة البادئة باستخدام وظيفة موضع الطرف الرأسي .
   5. حدد خيار ملاءمة المرونة لعرض منحنى مسافة القوة المعالجة وحدد مساحة الرسم البياني بحيث تصطف مع القيمة الأكثر سالبة على محور موضع الطرف الرأسي (المحور x).
   6. اقرأ المسافة البادئة وقم بتوثيقها من مربع X Min في علامة تبويب المعلمة. احفظ النتائج وقم بتوثيقها.

4. التحليل الإحصائي

1. افتح البرنامج الإحصائي. حدد مجموعة بيانات جديدة من القائمة المنسدلة.
2. افتح علامة التبويب طريقة عرض المتغيرات بعد تحديد ملف DataSet . حدد المتغيرات العددية لكل فئة نمط خلوي: سلاسل مفردة = SS ، سلاسل مزدوجة = DS ، مجموعات صغيرة = SC ، مجموعات كبيرة = BC ، منتشرة ووحدات يونغ.
3. في علامة تبويب عرض البيانات ، أدخل بيانات وحدات Young المقاسة لكل فئة من فئات الأنماط الخلوية المقابلة. قم بتحليل توزيع البيانات عن طريق تحديد تحليل من شريط القوائم، ثم تحليل البيانات الاستكشافية.
4. حدد وحدات يونغ كمتغير تابع والنمط الخلوي كقائمة عوامل. يتم عرض مخطط مربع مستخدم لقسم النتائج بين النتائج في ملف الإخراج.
5. لإجراء تحليل إحصائي، اختر نماذج تابعة في قسم الاختبار اللامعلمي من علامة تبويب شريط قائمة التحليل. حدد وحدات يونغ كحقول اختبار ونمط خلوي كمجموعات ضمن علامة التبويب الحقول. اضغط على تشغيل.
   ملاحظة: يتم عرض النتائج في ملف الإخراج. للتحليل الإحصائي ، يتم إجراء اختبار فريدمان.
6. قم بدمج القيم p للاختبار اللامعلمي في مخطط المربع الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.4. احفظ النتائج بالنقر فوق ملف في شريط القائمة وتحديد حفظ.

باستخدام جهاز قطع عصامي ، تمكنا من زرع وتوليد أقراص غضروفية صغيرة (4 مم × 1 مم) من لقمات بشرية جديدة تحتوي على نمط مكاني خلوي واحد³⁰ من سلاسل مفردة (SS ، الشكل 2A) ، سلاسل مزدوجة (DS) ، مجموعات صغيرة (SC) ، مجموعات كبيرة (BC ؛ الشكل 2 أ) ، ومنتشر (الشكل 2 ب). يوضح الشكل 3 أ غرسا تمثيليا للغضروف. تم اختيار الأقراص التي تعرض نوعا واحدا فقط من الأنماط باستخدام التصوير الفلوري من أعلى إلى أسفل (الشكل 2). تم توضيح التباين الطبوغرافي لقرص سطح الغضروف بشكل أكبر من خلال التصوير الجانبي لمقاطع بسمك 60 ميكرومتر متولدة من أقراص الغضروف (الشكل 2C). على سطح أقراص الغضروف العظمي المفصلي المزروع ، كان الرجفان السطحي وشق المصفوفة موجودين (الشكل 3B ، C). كان هذا ملحوظا بشكل خاص في الأقراص التي تمثل تقدم الزراعة العضوية المتقدم - الذي يمثله وجود BC (الشكل 2 أ). بعد فرز ما بعد التألق ، تم تقييم صلابة الأقراص بواسطة المسافات البادئة الدقيقة AFM. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تثبيت أقراص الغضاريف المتولدة بنجاح في طبق AFM Petri عن طريق الغراء المتوافق حيويا (الشكل 3D) لتجنب انحراف العينة أثناء القياسات (الشكل 3E). يجب تعديل كمية الغراء المستخدمة. ستؤدي كمية غير كافية من الغراء إلى عدم استقرار القرص ، في حين أن إضافة الكثير من الغراء قد يؤدي إلى انتشار غير مرغوب فيه للغراء إما تحت و / أو فوق قرص الغضروف. هذا الأخير يؤدي إلى القطع الأثرية القياس وسوء تحديد القرص تحت المجهر الفلوري. يعد تطبيق الغراء غير الكافي أو الحركات المفاجئة للعينة أثناء التثبيت من المشكلات المتكررة التي تتسبب في انفصال الأنسجة عن طبق بتري ويجب تجنبها.

يتم عرض انخفاض تدريجي تمثيلي في الصلابة جنبا إلى جنب مع ترتيب النمط الخلوي في الشكل 4A. كانت قيم الصلابة أعلى في الأقراص التي تحتوي على SS (متوسط 2.6 كيلو باسكال) - ممثلة لمناطق الغضاريف الصحية غير المعرضة للخطر. مع بداية الزراعة العضوية وتقدمها ، أظهرت قياسات AFM انخفاضا قويا متدرجا في الصلابة بنسبة 42٪ في DS (1.5 كيلو باسكال) ، و 77٪ في SC (0.6 كيلو باسكال) ، وفي النهاية ، 88٪ في المراحل المتقدمة ممثلة ب BC (0.3 كيلو باسكال ؛ الشكل 4 أ). أظهرت الأقراص التي تحتوي على نمط منتشر مرونة عالية مع اختلاف مهم في القيم الفردية لمعامل يونغ. بالنسبة لجميع أقراص الغضاريف ذات تنظيم النمط الخلوي السائد المعين ، وجد أن عمق المسافة البادئة المرتبط بنقطة الضبط المستخدمة (4.477 nN) يتناسب عكسيا مع الصلابة (الشكل 4B). يظهر منحنى مسافة القوة المتولد تمثيليا في الشكل 4C ، ويظهر ملاءمة هرتز بالإضافة إلى تحديد نقطة الاتصال في الشكل 4D.

يعتمد الملاءمة الصحيحة ، من بين عوامل أخرى ، على التحديد الصحيح لخط الأساس. إذا كان الكشف التلقائي عن خط الأساس خاطئا (على سبيل المثال ، بسبب خط أساس مضطرب) ، فيمكن أيضا تحديد الملاءمة يدويا ، ويسمح للمستخدم بتحديد خط أساس أكثر تمثيلا للقياسات. ومع ذلك ، إذا كان منحنى مسافة القوة المتولد لا يسمح بالملاءمة المناسبة ، فيجب التخلص منه. يوضح الشكل 5 أمثلة على منحنيات مسافة القوة غير الصحيحة. قد يكون من الصعب إنشاء منحنيات مناسبة لمسافة القوة على نباتات الغضروف المفصلي العظمي المفصلي بسبب سطح الأنسجة غير المنتظم ، من ناحية (تظهر الأمثلة في الشكل 5 أ ، ب) ، وعدم استقرار العينة الناجم عن تثبيت العينة بشكل غير صحيح (الأمثلة المعروضة في الشكل 5 ج ، د). قد تكون القطع الأثرية ناتجة عن نقاط اتصال متعددة لعينة المسبار (بسبب السطح غير المستوي للغضروف المتدهور) أو حركة الأنسجة غير المرغوب فيها (مرئية من خلال التغييرات في المستوى البؤري). يمكن رؤية هذه القطع الأثرية في منحنيات مسافة القوة المتولدة وهي تدل إما على اتصال دون المستوى الأمثل بين ناتئ AFM وسطح الغضروف أو تثبيت عينة غير صحيح على طبق بتري (انظر الشكل 5A-D).

الشكل 1: مخطط انسيابي للإجراء التجريبي. ملخص الخطوات التجريبية بترتيب زمني ، بدءا من عينات الغضاريف التي تم استئصالها أثناء الجراحة إلى توليد أقراص غضروفية 4 مم × 1 مم ، وتلطيخ الأقراص الفلورية وفرز الأقراص على أساس تنظيم النمط الخلوي عن طريق التصوير من أعلى إلى أسفل والتصوير الجانبي ، وفي النهاية ، تقييم المرونة عن طريق قياسات القوة الذرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التصوير الفلوري لأقراص الغضاريف التمثيلية. (أ) صور 2D من الفسيفساء وحقل نموذجي مكبرة من أقراص الغضاريف الملطخة بصبغة منفذة لغشاء الخلية عند تكبير 100x. يعرض القرص العلوي قرصا تمثيليا أحادي الأوتار ، بينما يمثل القرص السفلي قرص كتلة كبير (أسفل). (B) صورة فسيفسائية لقرص نمط منتشر يرى من السطح (أعلى) ، ونفس القرص المصور من الجانب السفلي (أسفل). (ج) منظر جانبي للتلطيخ النووي لشرائح 60 ميكرومتر من أقراص الغضاريف. يمثل شريط التدرج الأبيض 500 ميكرومتر لصور الفسيفساء (مجال رؤية أكبر ، A [اللوحة اليسرى] ، B ، C) و 100 ميكرومتر للصور المركزة المكبرة (A [اللوحة اليمنى]). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: أقراص الغضروف المفصلي المزروعة. (أ) صورة تمثيلية لقرص غضروفي تم إنشاؤه 4 مم × 1 مم من غضروف مفصلي بشري جديد. يمثل شريط المقياس الموضح باللون الأبيض 2 مم. (B) صورة تمثيلية للغضروف العظمي المفصلي الأصلي حيث يعرض سطح الأنسجة رجيفا سطحيا مرئيا ومشقوقا بشكل مجهري. يمثل شريط المقياس الموضح باللون الأبيض 1000 مم. (ج) تصوير تخطيطي لسطح الغضروف الليفي. (د) قبل قياسات AFM ، تم تثبيت كل من نباتات قرص الغضروف بشكل صحيح عن طريق غراء عينة متوافق حيويا على سطح طبق AFM Petri لتجنب القطع الأثرية بسبب انحراف العينة أثناء قياسات المسافة البادئة الفعلية كما هو موضح في (E). يمثل شريط المقياس الأبيض 4 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: النتائج التمثيلية لقياسات مجهر القوة الذرية لأقراص الغضاريف المفصلية مرتبة على أساس تنظيم النمط الخلوي السائد . (أ) مخطط صندوقي يعرض متوسط معامل يونغ المحسوب المكون من خمسة أقراص ، واحد لكل نمط خلوي ، ينشأ من مريض واحد. تم إجراء ما مجموعه 25 قياسا على كل قرص (خمسة قياسات لخمسة مواقع قياس متميزة). يمثل الخط الأسود داخل المستطيل القيمة المتوسطة ، ويمثل الطرفان السفلي والعلوي للمستطيل الربعين الأول والثالث ، على التوالي ، وتمثل أشرطة الخطأ القيم الأدنى والأعلى لكل مجموعة. (ب) مخطط نقطي يصور 125 نقطة عمق مسافة بادئة لكل نمط خلوي. (ج) منحنيات مسافة القوة النموذجية المكتسبة باستخدام AFM مع معامل يونغ المحسوب البالغ 0.4 كيلو باسكال. (د) تحديد الملاءمة التمثيلية ونقطة التماس بالهرتز لمنحنى مسافة القوة الموضح في (ج). يعرض المحور السيني موضع الطرف الرأسي (وهو المسافة التي يقطعها بيزو ، حيث يمثل الطول الانحناء الكابولي الذي يتم طرحه تلقائيا من جزء التلامس في منحنى مسافة القوة). *ص < 0.05. للتحليل الإحصائي ، تم استخدام اختبار فريدمان. الاختصارات: SS = سلاسل مفردة ؛ DS = سلاسل مزدوجة ؛ SC = مجموعات صغيرة ؛ قبل الميلاد = مجموعات كبيرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: أمثلة على منحنيات مسافة القوة الخاطئة . (أ) يوضح منحنى مسافة القوة انحرافا هائلا يتبعه استرداد بالقرب من مستوى خط الأساس قبل ملاحظة مسافة بادئة مستمرة للسطح. يمكن أن تعزى هذه الظاهرة إلى عائق كبير نسبيا (على سبيل المثال ، شقوق سطحية كبيرة بارزة من الطبقة العليا من الغضروف). (ب) يوضح منحنى مسافة القوة الممتدة عدة قمم صغيرة. يعتقد أن هذه المنحنيات ناتجة عن مخالفات صغيرة الحجم على سطح الغضروف (مثل الرجفان). يعرض كل من (C) و (D) منحنيات مسافة القوة مع دورات ثنائية الطور. يمثل كلا منحنيي مسافة القوة ضعف تثبيت العينة وانجراف العينة. من الشائع أيضا في هذه الحالات رؤية تغيير مفاجئ في المستوى البؤري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كمرض تدريجي ومتعدد العوامل ، يؤدي OA إلى تغييرات هيكلية ووظيفية في الغضروف المفصلي. طوال فترة الزراعة العضوية ، يصاحب ضعف الخواص الميكانيكية تغيرات هيكلية وكيميائية حيوية على سطح الغضروف المفصلي^27,31. الأحداث المرضية المبكرة التي تحدث في الزراعة العضوية هي نضوب البروتيوغليكان إلى جانب اضطراب شبكة الكولاجين³²،^33،34. من الصعب تحديد مثل هذه التغييرات السطحية الدقيقة المبكرة وتحديدها من خلال الاختبار بالجملة ، لأن السلوك الميكانيكي يتم حسابه في المتوسط على عمق الأنسجة بالكامل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن السؤال الذي لم تتم معالجته بعد هو ما إذا كانت التغييرات الوظيفية على مستوى الأعضاء والأنسجة تتعلق بالتغيرات الهيكلية والوظيفية على نطاق صغير أو نانو. تحقيقا لهذه الغاية ، تعتبر AFM واحدة من أكثر الطرق حساسية ، قادرة على اكتشاف أقدم التغيرات الميكانيكية الحيوية التي تحدث مع بداية الزراعة العضوية⁷. يسمح بقياسات الصلابة على كل من المقاييس الدقيقة والنانومترية في العينات الأصلية ، مما يوفر معلومات عن الخواص الميكانيكية للغضروف المفصلي^35,36. في هذا البروتوكول ، باستخدام المسافات البادئة micro-AFM ، قمنا بقياس الخصائص المرنة للنباتات البشرية الغضروفية المفصلية الصحية والعظمية. أظهرت النتائج أن نباتات الغضاريف تمثل بشكل كبير أحداث الزراعة العضوية المحلية المبكرة مع انخفاض تدريجي ملحوظ في الصلابة التي تحدث في نباتات الغضاريف الخاصة بالنمط. علاوة على ذلك ، تتماشى النتائج مع الأبحاث المنشورة السابقة التي أظهرت انخفاضا ملحوظا في الصلابة جنبا إلى جنب مع تنظيم النمط الخلوي²³،^24،27،37.

هناك حاجة حاليا إلى نماذج بشرية أصلية مؤكدة تحاكي جوانب مختلفة من التسبب في هشاشة العظام وتقدمها لمعالجة أوجه القصور في البحث الانتقالي وتحديات ترجمة البيانات في المختبر إلى بيئة سريرية. حتى الآن ، لا يمكن لأي نموذج أن يمثل بدقة حجرة الغضروف البشري الأصلية المعقدة ، ناهيك عن أنسجة المفاصل المرتبطة بالعمر والتي تكون عرضة ل OA استجابة للمحفزات المسببة للأمراض³⁸. كانت النماذج الأكثر استخداما القائمة على النباتات حتى الآن من أصل بقري أو ماشية وطبقت إما علاجا التهابيا قويا للسيتوكين أو تحميلا ميكانيكيا³⁹،^40،41. يوضح هذا البروتوكول ، على الجانب الآخر ، كيفية توليد عينات غضروف بشرية صغيرة (4 مم × 1 مم) مزروعة على شكل قرص ، والتي تشير إلى المراحل الفردية لأحداث الزراعة العضوية المحددة. يتم فرز نباتات الغضاريف وتعيين المرحلة باستخدام التنظيم المكاني الخلوي كعلامة حيوية قائمة على الصور^30,42. نظرا لأنه يمكن بالفعل تحديد التغييرات المبكرة في الخواص الميكانيكية الحيوية وقياسها كميا بمجرد أن تبدأ الأوتار المزدوجة في الظهور ^23,27 ، في مرحلة لا يزال فيها سطح الغضروف يبدو سليما مجهريا²⁶ ، يسمح هذا النموذج القائم على الزرع بالتحقيق في حجرة الغضروف الأصلية المحلية وقد يوفر معلومات ثاقبة عن الزراعة العضوية المبكرة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون نموذج الغضروف هذا مفيدا في التحقيق في استجابة الخلايا والمصفوفة للتغيرات الميكانيكية والالتهابية في موطن محلي أصلي ثلاثي الأبعاد^38,39. نظرا لكونها بسيطة نسبيا وسهلة التوليد ، يمكن أيضا استخدام نباتات الغضاريف هذه لدراسة عدم تجانس الزراعة العضوية ، وهو عامل مقيد في تطوير واختبار عقاقير الزراعة العضوية المعدلة^{للمرض 43}. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن قابلية التوسع والاعتماد على المرضى الذين يخضعون لجراحة استبدال المفاصل هما من أوجه القصور في النموذج.

من المعروف أن الغضروف المفصلي يقدم سلوكا غريبا اعتمادا على مستوى المقياس الذي يتم اختباره. كما أشار Loparic et al. ، على المستوى الجزئي ، يتصرف الغضروف كمادة غير منظمة وموحدة³⁵ ، ومثل هذا النهج يعطي تقريبا لصلابة الغضروف الكلية الموضعية. فيما يتعلق بما إذا كانت المسافات البادئة الدقيقة أو النانوية أكثر ملاءمة ، قارنت دراسة أجراها Stolz et ^al.44 عام 2004 كلا من المسافات البادئة على نطاق صغير ونانوي في تقييم الخصائص الميكانيكية الهيكلية للغضروف المفصلي. أكد المؤلفون أنه بالنسبة للمسافة البادئة الكروية على نطاق صغير للغضروف المفصلي ، فإن المكونات الهيكلية الدقيقة على نطاق النانو (أي ألياف الكولاجين الفردية والبروتيوغليكان) تشترك عادة في مهمة الحاملة. في مثل هذا ، تختلف الخواص الميكانيكية الكلية بشكل ملحوظ عن تلك الخاصة بالمكونات النانوية الفردية. اقترح نفس المؤلفين أنه يمكن استخدام مزيج من المسافات البادئة الدقيقة والنانوية لتقييم ملامح الصلابة المحلية الشاملة للغضروف المفصلي ، وكذلك الصلابة المتعلقة بالمكونات الهيكلية الدقيقة⁴⁴.

استخدمت العديد من تجارب المسافة البادئة المستندة إلى AFM نصائح ناتئة هرمية حادة (نصف القطر = 15-20 نانومتر) ²²،^36،44 لتقييم ميكانيكا الغضروف. على الرغم من أن المسافات البادئة النانوية ذات الكابوليات الحادة تعتبر حاليا أكثر ملاءمة لتقييم أفضل الخواص الميكانيكية ، إلا أن أطراف الكابولي الكروية تنتج نتائج أكثر اتساقا وأسهل في النمذجة والتفسير عند اختبار العينات البيولوجية اللينة^44,45. علاوة على ذلك ، أظهر Stolz et al. أن المسافات البادئة النانوية AFM للغضروف المفصلي المتحلل إنزيميا (أي الإيلاستاز) غير ممكنة لأن الأنسجة تصبح لزجة لدرجة أن التصاق عينة الطرف يهيمن على منحنيات مسافة القوة ، مما يجعل البيانات غير مجدية⁴⁴.

في قياسات AFM الحالية ، تم استخدام ناتئ ذو طرف ناتئ كروي نصف قطره 5 ميكرومتر. كان الدافع وراء اختيار الكابولي هو نية متوسط الخواص الميكانيكية للأنسجة على سطح كبير إلى حد ما مع تقليل الضرر الذي يلحق بسطح الغضروف. تم تركيب العلاقة بين القوة المطبقة على الكابولي والمسافة البادئة للعينة الناتجة مع نموذج ملاءمة هرتز. عند استخدام المسافات البادئة الكروية ، يوصى باستخدام نموذج Hertz fit ، مع إهمال قوى الجذب المؤثرة بين طرف الكابولي وسطح العينة⁴⁶. تظهر معادلات النموذج الهرتزي في Eq.1 و Eq.2.

مكافئ 1

مكافئ 2

حيث F = القوة ؛ E = معامل يونغ ؛ v = نسبة بواسون ؛ δ = المسافة البادئة ؛ أ = نصف قطر دائرة الاتصال ؛ و R_s = نصف قطر الكرة.

يحسب النموذج في النهاية المرونة الخلوية / النسيجية⁴⁷ ، والتي يتم التعبير عنها رسميا على أنها معامل يونغ (E). يأخذ نموذج Hertz fit في الاعتبار العديد من الخصائص مثل شكل الطرف وحجمه والمسافة البادئة وتشوه العينة. إذا لم يتم استيفاء هذه المتطلبات بشكل مثالي ، فقد يوفر النموذج تقديرا غير دقيق لمعامل^{Young 46}.

يفترض نموذج ملاءمة هرتز أن الإجهاد والإجهاد المرن يعتمدان خطيا على معامل المرونة ، مما يعني أن المسافة البادئة في العينة تظل أصغر بكثير من سمك العينة نفسها⁴⁶. تم تحقيق هذا الافتراض بسهولة في هذا الإعداد ، حيث كان سمك نباتات الغضروف 1 مم مقارنة بالمسافات البادئة لبضعة ميكرومترات.

يمكن نمذجة الغضروف المفصلي كمادة لزجة مسامية^{مرنة 48,49}. ينتج السلوك اللزج المرن عن الاحتكاك بين المكونات داخل الخلايا / السيتوبلازم أو المصفوفة مثل الجزيئات والعضيات وشبكة الكولاجين والبروتيوغليكان^50,51. كما يوحي الاسم ، تجمع المواد اللزجة المرنة بين خاصيتين متميزتين: لزجة - تتشوه المادة ببطء عند تعرضها لحمل خارجي - والمرونة - تعود المادة إلى تكوينها الأولي بمجرد إزالة الحمل المطبق^52,53. يتجلى السلوك اللزج المرن على أنه تباطؤ بين النهج (الموسع) ومنحنيات التراجع في منحنيات مسافة القوة ^46,52 ، على غرار تلك التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة (الشكل 4C). علاوة على ذلك ، فإن إحدى خصائص المواد اللزجة المرنة هي أن خواصها الميكانيكية تعتمد على معدل التشوه ، مع زيادة صلابة المادة مع معدل تطبيق التحميل (سرعة المسافة البادئة)⁵⁴. وبالتالي ، من خلال اختيار معدلات تحميل مختلفة ، يتم إنشاء عائلة من منحنيات مسافة القوة ، يمثل كل منها الخواص الميكانيكية للعينة المختبرة عند كل معدل تحميل⁵². لذلك ، عند محاولة مقارنة نتائج الأعمال المختلفة ، من الأهمية بمكان أخذ جميع معلمات المسافة البادئة في الاعتبار. بشكل عام ، عند القياس على مقياس ميكرومتر (كما في هذه الدراسة مع طرف ناتئ كروي 5 ميكرومتر) ، يتصرف الغضروف المفصلي كمادة غير منظمة وموحدة ، مما يولد معامل مرونة تراكمي يتضمن مساهمات مرنة ولزجة في الصلابة بسبب الطبيعة المرنة للأنسجة³⁵.

افتراض آخر للنموذج الهرتزي هو أن عمق المسافة البادئة أقل من نصف قطر الطرف الكابولي الكروي⁵⁵. يمثل عمق المسافة البادئة أقصى إزاحة لطرف الكابولي بعد أول اتصال مع العينة. عند الحمل الأقصى ، يكون الحد الأقصى لعمق المسافة البادئة هو الإزاحة الكلية للعينة وطرف الكابولي. تنص إرشادات Bueckle على عمق مسافة بادئة قصوى تبلغ 10٪ من السماكة الكلية للعينة بنفس الهيكل طوال⁵⁶ ، وإلا فإن النتائج تختلف وفقا لنسبة العمق إلى السماكة. بالنسبة لنصف قطر طرف ناتئ يبلغ 5 ميكرومتر ، تم وضع مسافة بادئة لنباتات الغضروف في هذه الدراسة عند 1.1 ميكرومتر في المتوسط ، مع بضع قمم تبلغ 3 ميكرومتر في حالات قليلة ، خاصة بالنسبة لنباتات الغضاريف شديدة الانحطاط. في هذه الحالة ، تم البحث عن حل وسط ، حيث أنه في البيئة التجريبية ، هناك حاجة إلى قوى عالية نسبيا مرتبطة بالمسافات البادئة الكبيرة لتحييد المخالفات السطحية للغضروف المتدهور. قد تؤدي المسافة البادئة الأكثر اعتدالا إلى فحص الرجفان السطحي وتشقق الكولاجين ، وكلاهما من السمات الشائعة للغضروف شديد الانحطاط⁵⁷.

من الأمور الحاسمة بالنسبة لنموذج Hertz fit أيضا التحديد الصحيح للنقطة التي يتلامس عندها طرف الكابولي مباشرة مع العينة ، والتي يطلق عليها بشكل عام نقطة الاتصال. ومع ذلك ، قد يكون هذا مشكلة عند وضع مسافة بادئة لعينات شديدة اللزوجة أو ناعمة جدا ، حيث قد يؤدي ذلك إلى نقاط اتصال متعددة لعينة المسبار^58,59. في الواقع ، كما أكد A-Hassan et al. بشكل جيد ، بالنسبة للأنسجة البيولوجية الرخوة ، فإن التحديد الدقيق لنقطة الاتصال هو أحد أكثر المشاكل إزعاجا⁶⁰. وقد لوحظ هذا التأثير أيضا في نباتات الغضروف العظمي المفصلي الأصلية ، حيث يفقد سطح الأنسجة خصائصه الميكانيكية الأصلية وغالبا ما يكون غير متساو ، اعتمادا على مرحلة التنكس ، مما يؤدي إلى الرجفان السطحي والشق (الشكل 3B ، C). وقد لوحظت هذه الظاهرة بشكل خاص في نباتات الغضاريف حيث كان النمط الخلوي السائد عبارة عن مجموعات كبيرة (الشكل 2C). قد تؤدي هذه التفاوتات في سطح الغضروف إلى نقاط اتصال متعددة لعينة المسبار ، وبالتالي نتائج خاطئة. وقد لوحظت انحرافات واسعة في بعض الحالات، تلاها انتعاش سريع لخط الأساس قبل الامتداد الأخير لمنحنى مسافة القوة (الشكل 5 أ). يمكن أن يعزى ذلك إلى وجود عائق كبير في مسار طرف الكابولي (على سبيل المثال ، مناطق الرجفان المتقدمة مع الغضروف المهترئ والانقسام). في حالات أخرى ، كان المنحدر النهائي لمنحنى مسافة القوة مبعثرا مع مخالفات أصغر (الشكل 5 ب) ، مما يشير إلى ملامسة عوائق أصغر على التوالي (على سبيل المثال ، الرجفان الدقيق للأنسجة). في مثل هذه الحالات ، يجب إعادة قياس موقع القياس أو حتى تغييره لضمان موثوقية البيانات وإمكانية استنساخها. تحقيقا لهذه الغاية ، من المهم أيضا فحص خرج منحنى مسافة القوة ل AFM بعناية لتحديد نقطة الاتصال بشكل صحيح. هذه نقطة حاسمة يجب أن تكون على دراية بها ، حيث ثبت أن التحديد غير الصحيح لنقطة الاتصال بمقدار 50 نانومتر يؤدي إلى تقدير غير صحيح لقيمة E بترتيب⁶¹. بدأت العديد من الدراسات في استخدام الأساليب الآلية لتحديد نقطة الاتصال لمنحنيات مسافة القوة ، بهدف تجاوز مدخلات المستخدم الذاتية عند تقدير نقطة الاتصال عن طريق الفحص البصري وتحسين الدقة. يصبح هذا أكثر أهمية عند التعامل مع عدد كبير من منحنيات إزاحة القوة ، مثل تلك التي تم إنشاؤها في ميكانيكا الخلية^47,62. على الرغم من اقتراح العديد من الاستراتيجيات لأتمتة تحديد نقطة الاتصال⁴⁷،63،64،⁶⁵ ، فإن الإستراتيجية المثلى تعتمد بشكل كبير على الظروف والعوامل التجريبية مثل النموذج المستخدم لتحليل البيانات ، وشكل المسبار ، والتفاعل الميكانيكي (غير اللاصق) بين طرف الكابولي والعينة ^، وكذلك السلوك (غير) Hertzian للعينة ⁶³.

يعد انحراف العينة مشكلة شائعة أخرى قد تتسبب في حدوث قطع أثرية وتحديد خاطئ لنقطة الاتصال (الشكل 3E). هذا يعني بشكل أساسي أن العينة لم يتم تركيبها بشكل صحيح في حامل العينة (طبق بتري) وأن العينة تتحرك أثناء قياسات AFM. يكون التأثير واضحا بشكل خاص عند نقل ناتئ AFM إلى موقع قياس جديد. يمكن ملاحظة هذا الجانب بسهولة أثناء القياسات الفعلية عن طريق تغيير مفاجئ في المستوى البؤري. عادة ما يكون لمنحنيات مسافة القوة الناتجة منحدر ممتد ثنائي الطور ، مع ارتفاع خفيف في البداية ، يتوافق مع تضييق المساحة الفارغة بين قاع القرص وطبق بتري حيث يتم دفع القرص لأسفل بواسطة الكابولي (انظر الشكل 3E) ، متبوعا بميل أكثر ثباتا في القسم الثاني من المنحدر ، مما يشير إلى أن القرص يتم وضع مسافة بادئة أخرى الآن بعد أن أصبح على اتصال مباشر بقاع طبق بتري (الشكل 5C ، D). للتغلب على التشوهات ، يمكن للمرء محاولة إصلاح العينات بشكل أفضل باستخدام مادة لاصقة مناسبة للعينة (الشكل 3D) ، والحفاظ على درجة الحرارة ثابتة عن طريق إيقاف تشغيل مصادر الحرارة الخارجية (الأضواء) لتجنب الانجراف الحراري ، وإجراء قياسات المسح السريع. في التجارب هنا ، لاحظنا انحراف ناتئ حدث خلال أول 15 دقيقة من غمر الكابولي في الوسائط (بسبب التغيرات المفاجئة في درجة الحرارة). بعد هذا الفاصل الزمني ، عادة ما يكون الانجراف ضئيلا. نتيجة لذلك ، ننصح المجرب بفحص خط الأساس بعناية بعد الغمر الكابولي والبدء في القياس بمجرد استقراره. يمكن أن تختلف مدة هذه العملية اختلافا كبيرا اعتمادا على الكابولي المستخدم.

معلمة أخرى مهمة لأي قياس AFM هي نقطة الضبط ، والتي هي ، ببساطة ، مقياس للقوة التي يطبقها الكابولي على العينة. بالنسبة لوضع التلامس (كما هو مستخدم في هذه الدراسة) ، تمثل نقطة الضبط انحرافا معينا للناتئ. عند إجراء العديد من عمليات المسح أو عدة تكرارات للموقع ، كما هو الحال في البروتوكول هنا ، يمكن للطرف الكابولي امتصاص الجسيمات من سطح العينة ، مما يجعل من الضروري في بعض الأحيان إزالة الكابولي ، وتنظيفه بشكل صحيح⁶⁶ ، ثم إعادة المعايرة قبل متابعة القياسات.

في حين أن المسافات البادئة الدقيقة AFM توفر فرصا جديدة ومثيرة للاهتمام لجمع البيانات ، لا سيما في سياق الغضروف العظمي المفصلي ، فإن اتساق البيانات المنتجة وقابليتها للتكرار يعتمدان بشكل كبير على العديد من المعلمات ، كما هو موضح أعلاه. عند استخدام هذا النهج لتقييم التغيرات الميكانيكية الناجمة عن تنكس أنسجة الغضاريف ، يجب أولا إجراء بعض القياسات التجريبية على أنماط مكانية مختلفة من أجل توسيع نطاق النتائج إلى التصميم التجريبي المحدد. يجب إجراء قياسات AFM التجريبية مع الإجراء الأكثر قابلية للتوحيد مع أخذ عينات كافية (على سبيل المثال ، خمسة أقراص) من نفس النمط لتوفير مؤشر على مدى تباين البيانات. هذا مهم بشكل خاص عند محاولة تحديد وتقييم أقرب تغيرات صلابة الزراعة العضوية ذات الصلة (أي بين السلاسل المفردة والسلاسل المزدوجة ، الشكل 4 أ). في الواقع ، في دراسة سابقة ، باستخدام نهج مماثل ، أظهرنا أن حجم عينة من 30 عينة بشرية كان مطلوبا لتقييم التغيرات الميكانيكية الحيوية في المصفوفة كدالة للتنظيم المكاني للخلايا³⁷.

علاوة على ذلك ، فإن العديد من الخطوات المقدمة في هذا البروتوكول عرضة للخطأ البشري وتعتمد بشكل كبير على خبرة المشغل. بالنظر إلى جميع العوامل التي يمكن أن تؤثر على نتائج AFM الفعلية ، فإن قيم E المطلقة المبلغ عنها في هذه الدراسة غير قابلة للتعميم وهي خاصة بهذا الإعداد التجريبي. ومع ذلك ، فإن العلاقة المعروضة هنا بين مختلف معامل يونغ ونباتات الغضروف القائمة على النمط الخلوي (كلما كان النمط المكاني مرضيا ، انخفض معامل المرونة [EM] للغضروف) لا تتأثر ، حيث تتوافق النتائج مع الدراسات السابقة التي تظهر تغيرات الصلابة كدالة لتنظيم النمط الخلوي^23,37.

بشكل عام ، يوضح هذا البروتوكول خطوة بخطوة وظائف نباتات الغضروف المفصلية الأصلية 3D الموحدة ، والتي لا تمثل فقط أحداث إعادة التنظيم الخلوي المدفوعة بالزراعة العضوية والتي تتراوح من البداية إلى التقدم المتقدم ولكنها ترتبط أيضا بانخفاض تدريجي في الصلابة. قد تعكس النباتات نموذجا موثوقا للمحاكاة الحيوية لدراسة بداية الزراعة العضوية وتطورها ، مما يسمح باختبار وتطوير طرق علاج مختلفة خارج الجسم الحي. يمكن أن يؤدي استخدام مثل هذا النموذج البشري مع التقييم الميكانيكي الحيوي القائم على AFM إلى نقلة نوعية للبحوث الطبية الحيوية وصناعة الأدوية ، مما يمهد الطريق لطرق جديدة لتحديد أدوية الزراعة العضوية الفعالة التي تشتد الحاجة إليها.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

نشكر جراحي العظام من قسم جراحة العظام في مستشفى جامعة توبنغن على تقديم عينات الأنسجة.