استخدام التقسيم الثنائي لتقليل الحمض النووي للميتوكوندريا في بويضة البقر

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقليل أعداد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا بشكل كبير في بويضة البقر (P < 0.0001). تستخدم هذه الطريقة الطرد المركزي والتقسيم الثنائي للحد بشكل كبير من الميتوكوندريا البويضية وقد تسمح بزيادة فرصة التطور في أجنة النقل النووي للخلايا الجسدية بين الأنواع المعاد بناؤها.

يمكن استخدام النقل النووي للخلايا الجسدية بين الأنواع (iSCNT) لإنقاذ الأنواع المهددة بالانقراض، ولكن توجد مجموعتان متميزتان من الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) داخل الجنين المعاد بناؤه: واحدة داخل البولازم المتلقي والأخرى داخل الخلية الجسدية المانحة. يمكن أن تؤدي هذه الميتوكوندريا غير المتجانسة إلى مشاكل في النمو في الجنين والجنين. وتشمل بروتوكولات الاستنساخ المصنوعة يدويا الاستئصال الثنائي للبويضة، والتي يمكن استخدامها لتقليل عدد نسخ الحمض النووي MTDNA، مما يقلل من درجة التباين في الميتوكوندريا في الجنين المعاد بناؤه. أنتج الطرد المركزي للبويضات البقرية العارية والناضجة جزءا مرئيا كثيفا من الميتوكوندريا في قطب واحد من البويضات. تمت إزالة البويضات من zonae pellucidae عن طريق التعرض لمحلول pronase. تم إجراء التشريح الثنائي باستخدام شفرة صغيرة لإزالة جزء الميتوكوندريا المرئي. تم استخدام qPCR لقياس كمية mtDNA الموجودة في عينات الحمض النووي المستخرجة من البويضات الكاملة والبلاستيدات المجزأة ، مما يوفر مقارنة بين أرقام نسخ mtDNA قبل وبعد التشريح. تم حساب أرقام النسخ باستخدام قيم عتبة الدورة ، وصيغة خط الانحدار للمنحنى القياسي ، والنسبة التي تضمنت الأحجام الخاصة بمنتجات mtDNA PCR ومنتجات PCR الجينومية. كان لدى إحدى البويضات البقرية متوسط عدد نسخ mtDNA (± الانحراف المعياري) من 137,904 ± 94,768 (n = 38). كان لدى أحد الأوبلاست المستنفدة للميتوكوندريا متوسط عدد نسخ mtDNA يبلغ 8,442 ± 13,806 (n = 33). بلغ متوسط نسخ mtDNA الموجودة في أوبلاست غنية بالميتوكوندريا 79,390 ± 58,526 مليون نسخة من الحمض النووي (n = 28). تشير الاختلافات بين هذه المتوسطات المحسوبة إلى أن الطرد المركزي والتقسيم الثنائي اللاحق يمكن أن يقلل بشكل كبير من أعداد نسخ mtDNA الموجودة في البلاست المستنفد للميتوكوندريا عند مقارنته بالبويضة الأصلية (P < 0.0001 ، التي تحددها ANOVA أحادية الاتجاه). يجب أن يقلل الانخفاض في mtDNA من درجة عدم التغاير الميتوكوندريا في الجنين المعاد بناؤه ، وربما يعزز النمو الجنيني والجنيني القياسي. قد تكون المكملات الغذائية بمستخلص الميتوكوندريا من الخلية المانحة الجسدية ضرورية أيضا لتحقيق نمو جنيني ناجح.

يشمل النقل النووي للخلايا الجسدية (SCNT) اندماج بويضة منزوعة النواة من واحد وخلية جسدية من من نفس النوع. في معظم الحالات ، تنشأ البويضة والخلية الجسدية من نفس النوع ، ومعدلات المواليد الأحياء أقل من 6٪ ¹. تتضمن بعض الأبحاث استخدام SCNT بين الأنواع (iSCNT) ، والذي يتضمن اندماج خلية جسدية وبويضة تنشأ من نوعين مختلفين. في هذه الدراسات ، تكون معدلات المواليد الأحياء أقل مما هي عليه في SCNT - عادة أقل من 1٪ ¹. ومع ذلك ، فإن iSCNT لديه القدرة على استخدامه كوسيلة لإنقاذ الأنواع المهددة بالانقراض ، لأن الخلايا الجسدية من هذه الحيوانات يمكن الوصول إليها أكثر من خلاياها الجرثومية¹. غالبا ما تكون البويضات المتلقية المستخدمة في iSCNT من الأنواع المختبرية المحلية أو الشائعة ، مثل الأبقار والخنازير والفئران. وقد نجحت بعض المحاولات التي بذلت حتى الآن في إنتاج صغار أحياء، على الرغم من أن النسل المنتج كان داخل الجنيسة (كانت أنواع البويضات المتلقية وأنواع الخلايا المانحة أعضاء من نفس الجنس)²،^3،4. النماذج البينية (التي تستخدم خلية بويضية وجسدية من الحيوانات في أجناس مختلفة) لم تنتج بعد حية، وغالبية الأجنة المعاد بناؤها تقبض في مرحلة 8-16 خلية من التطور المختبري ⁵،⁶،^7،8. أحد التفسيرات المحتملة لهذا الاعتقال التنموي الجنيني هو حدوث تباين الميتوكوندريا في الأجنة - وجود أكثر من نوع واحد من الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في خلية واحدة. يمكن أن يؤدي التغايرية إلى مشاكل مثل عدم الكفاءة التنموية أو الفشل في الجنين أو في الحيوان الحي¹. يمكن أن يحدث التسبب أيضا في وقت لاحق من حياة الحيوان⁹. على الرغم من أن هذه المشكلة موجودة أيضا في ذرية SCNT ، إلا أن المكون المشترك بين الأنواع داخل أجنة iSCNT يؤدي إلى تفاقم المشكلة.

عندما يأتي الحمض النووي الجنيني mtDNA من نوعين مختلفين ، فإن الميتوكوندريا البويضة المتلقية ، التي تمثل الأغلبية ، لا تعمل بكفاءة أو فعالية مع نواة الخلية المانحة ^1,10. ومن المرجح أن تؤدي الفجوات التصنيفية الأكبر بين النوعين المستخدمين في نظام iSCNT إلى تفاقم هذه المشكلة؛ وقد تبين أن النسل الحي داخل الجنيسة المنتجة (نسل Bos gaurus و Bos indicus باستخدام بويضات Bos taurus) ، وكذلك النسل المنتج عبر SCNT التقليدي (مثل ذرية Ovis aries باستخدام بويضات Ovis aries) هي أوهمات (mtDNA من شخصين كان موجودا في هذه الحيوانات¹¹،^12،13). ومع ذلك ، فقد طوروا أبعد بكثير من أجنة SCNT بين الجنيسة^14,15. يمكن أن يكون تبادل المعلومات بين الميتوكوندريا البويضة ونواة الخلية المانحة أكثر نجاحا في الجنين داخل الجنيسة منه في الجنين بين الجنيسة¹⁶.

كمية mtDNA في بويضة البقر الناضجة أكبر بحوالي 100 مرة من الكمية الموجودة في خلية جسدية واحدة¹². يمكن أن يؤدي تقليل هذه النسبة إلى تشجيع الميتوكوندريا ذات الخلايا الجسدية على التكاثر داخل الجنين المعاد بناؤه ، مما يسمح بوجود عدد أكبر من الميتوكوندريا المنتجة¹⁶. وهذا بدوره يمكن أن يوفر المزيد من الطاقة لتلبية متطلبات الجنين النامي¹⁵. تشمل المحاولات السابقة التي بذلت لتقليل عدد نسخ mtDNA للبويضة أو الجنين التطبيق الكيميائي ، والتلاعب المجهري ، واستكمال البويضة أو الجنين بالميتوكوندريا الإضافية من أنواع الخلايا المانحة 16،^17،18،^19،20. ومع ذلك ، فإن التطبيق الكيميائي (مثل 2',3'-dideoxycytidine) ليس مثاليا للتطور الجنيني ، وقد قلل من أعداد نسخ mtDNA للبويضة بمقدار النصف تقريبا¹⁸. الحد من mtDNA البويضة السابقة عن طريق المعالجة الدقيقة قد أزال فقط ما معدله 64 ٪ من mtDNA¹⁷ في البويضة. على الرغم من أن مكملات الميتوكوندريا ذات الخلايا المانحة يمكن أن تكون خيارا قابلا للتطبيق ، إلا أن استخدامها لم ينتج بعد حيوانا حيا بين الأنواع في دراسات iSCNT²¹.

لم يتم بعد استخدام التقسيم الثنائي لتقليل عدد نسخ mtDNA للبويضة في الدراسات المنشورة. إن تقسيم البويضات بقصد دمج البلاستيدات مع خلية جسدية هو فرضية الاستنساخ اليدوي (HMC) ، والذي يستخدم عادة التقسيم الثنائي كوسيلة لإزالة الجسم القطبي والصفيحة الفوقية من بويضة الطور الثاني (MII). نجحت مؤسسة حمد الطبية في إنتاج ذرية في عدة أنواع، بما في ذلك الماعز والأبقار والخنازير والأغنام والخيول 22،23،^24،25،^26، ولكنها لا تتضمن عادة خطوة الطرد المركزي قبل التشريح. يسمح دمج الطرد المركزي عالي السرعة للبويضة بعزل الميتوكوندريا (وبالتالي mtDNA) في قطب واحد من البويضة ، والتي يمكن بعد ذلك تقسيمها باستخدام شفرة صغيرة لإزالة تلك الكسور الكثيفة من الميتوكوندريا. ويمكن بعد ذلك دمج اثنين من البلاستيدات المستنفدة للميتوكوندريا مع خلية جسدية، كما هو الحال في مؤسسة حمد الطبية، لتشكيل جنين أعيد بناؤه يحتوي على كمية أقل بكثير من الحمض النووي من أنواع البويضات.

السؤال الذي نحاول الإجابة عليه باستخدام هذا البروتوكول هو كيفية تقليل mtDNA في بويضة البقر من أجل إنتاج جنين قابل للحياة أعيد بناؤه يحتوي على mtDNA أقل غير متجانسة. في هذا البروتوكول ، تم طرد البويضات مركزيا وتقسيمها. تم حساب أرقام نسخ mtDNA للبويضة والبويضة السليمة لتحديد فعالية هذه التقنية في تقليل عدد نسخ mtDNA في بويضة البقر.

يتبع البروتوكول التالي إرشادات رعاية الحيوانات والأخلاقيات التي تقدمها جامعة ولاية يوتا.

1. الإعداد الإعلامي

1. قبل التعامل مع البويضات ، قم بإعداد المحاليل التالية ، كما هو موضح في الجدول 1: 400 ميكرولتر من محلول Hyaluronidase ، و 500 ميكرولتر من وسائط T2 ، و 1020 ميكرولتر من وسائط T20 ، و 800 ميكرولتر من وسائط T10.
2. قسم وسائط T10 إلى بئرين من صفيحة من أربعة آبار ، 400 ميكرولتر لكل بئر. قم بتسمية بئر واحد ب "M" والبئر الثاني ب "MR". ضع في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪ حتى بعد القطع.
3. تحضير 500 ميكرولتر من Cytochalasin B (CB) / السائل البيضاوي الاصطناعي مع HEPES (HSOF). Aliquot 50 ميكرولتر من محلول CB / HSOF في أنبوب طرد مركزي منفصل 1.5 مل.
4. تحضير 40 ميكرولتر من محلول Pronase. جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية على الأقل عند 2,680 × جم. مزيج 20 ميكرولتر من supernatant مع 20 ميكرولتر من T2 إلى أنبوب طرد مركزي جديد ؛ هذا يشكل محلول بروناس مخفف ، 5 ملغ / مل.
5. تحضير 3 مل من HSOF. على لوحة البحث ، قم بإيداع أربع قطرات 400 ميكرولتر بشكل منفصل ؛ ضع هذه اللوحة تحت المجهر المجسم.
6. تحضير 500 ميكرولتر من محلول CB / T20.

2. النضج في المختبر (IVM) من البويضات البقرية

1. IVM: مجمعات الخلايا الركامية البويضية المستنشقة للاستزراع (COCs) عند 38.5 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪ لمدة 21 ساعة في طبق من أربعة آبار من وسائط النضج التي تحتوي على 10٪ FBS و 0.26 وحدة دولية / مل FSH و 100 U / mL البنسلين / الستربتومايسين.
2. نفذ الخطوات التالية لتعرية البويضات.
   1. جمع العدد المطلوب من COCs باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، وإيداعها في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي 1.5 ميكرولتر.
   2. أضف نفس الحجم من 0.6 ملغم / مل هيالورونيداز إلى أنبوب الطرد المركزي مع البويضات (أي ، إذا كان حجم البويضات ووسائط IVM هو 100 ميكرولتر ، أضف 100 ميكرولتر من هيالورونيداز).
   3. ماصة الحل صعودا وهبوطا دون إنشاء فقاعات ، حتى تتم إزالة جميع الخلايا الركامية.
3. تحقق من نضج البويضات.
   1. استخدم الماصة لإضافة 200 ميكرولتر من HSOF من إحدى قطرات HSOF الأربعة على لوحة البحث إلى محلول البويضة / الهيالورونيداز.
   2. انقل البويضات من قطرة هيالورونيداز / HSOF وضعها في 400 ميكرولتر غير مستخدمة من قطرة HSOF. اغسلها بقطرتين إضافيتين من HSOF للمساعدة في إزالة بقايا خلايا الهيالورونيداز والخلايا الركامية.
   3. باستخدام ماصة الفم (أو ماصة وطرف 10 ميكرولتر) والتكبير المجهري العالي ، قم بلف البويضات وتحديدها بناء على وجود الجسم القطبي.
   4. بعد فرز البويضات ، اجمع العدد المطلوب من بويضات MII المراد تقسيمها إلى قسمين ، وضعها في 400 ميكرولتر من قطرة HSOF.
      ملاحظة: إذا كانت البويضات خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة، يمكن وضع البويضات مرة أخرى في بئر من وسائط النضج ووضعها في حاضنة يتم التحكم فيها بواسطة CO₂ للراحة لمدة 30 دقيقة على الأقل. الحد من عدد البويضات المراد تقسيمها إلى كمية يمكن الانتهاء من تقسيمها في حوالي 30 دقيقة لتقليل الوقت خارج الحضانة. إذا كان من المقرر دمج البلاستيدات مع خلية جسدية ، وتنشيطها ، وزراعتها كأجنة ، فيجب استئصال البويضات في هذا الوقت.

3. الطرد المركزي للبويضات

ملاحظة: إذا تم وضع البويضات في الحاضنة في وسائط النضج، فانقلها إلى قطرة HSOF التي تم جمعها منها مؤخرا.

1. باستخدام ماصة الفم ، اجمع البويضات الناضجة المختارة من قطرة HSOF ، وضعها في أنبوب 1.5 مل يحتوي على 50 ميكرولتر من محلول HSOF / CB. الطرد المركزي للبويضات عند 15000 × غرام لمدة 12 دقيقة.
   ملاحظة: ليس من الضار أن تكون الفقاعات موجودة في أنبوب جهاز الطرد المركزي.
2. أثناء طرد البويضات مركزيا ، قم بإعداد لوحة المقطع الثنائي.
   1. اصنع النمط كما هو موضح في الشكل 1 على غطاء طبق بتري 60 مم (20 ميكرولتر لكل قطرة) ، وقم بتغطية القطرات بالكامل بالزيت المعدني.
   2. باستخدام علامة رفيعة الرؤوس ، ضع علامة على الخطوط الموجودة أسفل الطبق ، كما هو موضح في الشكل 2.
      1. ارسم صندوقا حول قطرة البروناس وخطا بين قطرات CB/T20 والصف السفلي من قطرات T20.
   3. قم بتغطية الطبق بغطاء غير شفاف حتى يكتمل الطرد المركزي لمنع تغيرات الأسمولية للقطرات الدقيقة.
3. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، استخدم ماصة 200 ميكرولتر لجمع البويضات داخل المحلول ، ونقلها إلى جزء فارغ من لوحة بحث جديدة مع أربع قطرات HSOF 400 ميكرولتر.
4. جمع وغسل البويضات من خلال قطرات HSOF الأربعة.

الشكل 1: لوحة المقطع الثنائي. جميع القطرات المعروضة لها حجم 20 ميكرولتر. يبلغ قطر اللوحة 60 ملم. تم تغطية قطرات بالكامل بالزيوت المعدنية. سيتم وضع البويضات أولا في الجزء العلوي والأيسر من T2 قطرة (يشار إليها هنا بنجمة). PRO / T2: 10 ميكرولتر من pronase و 10 ميكرولتر من T2 ، مجتمعة قبل إنشاء microdrops. CB / T20: 1 ميكرولتر من السيتوكالاسين B لكل 1 مل من T20 ، مجتمعة قبل إنشاء microdrops. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: لوحة ثنائية المقطع مميزة. يتم رسم الخطوط بعلامة رفيعة الرؤوس في الجزء السفلي من اللوحة ، لتوفير مراجع الموقع للملاحظات وعمليات نقل البويضات والبلاستيدات التي تتم تحت المجهر. سيتم وضع البويضات أولا في الجزء العلوي والأيسر من T2 قطرة (يشار إليها هنا بنجمة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. إعداد البويضة للاستئصال الثنائي

ملاحظة: تتضمن العملية التالية تحضير البويضات للاستئصال الثنائي.

1. قم بتشغيل مرحلة التسخين إلى 37 درجة مئوية.
2. استخدم ماصة الفم لنقل البويضات التي يتم طردها مركزيا من قطرة HSOF إلى أعلى يسار قطرة T2 من الصفيحة ثنائية المقطع ، ثم اغسل البويضات من خلال القطرات الثلاث التالية في الصف العلوي (T2 ، T20 ، T20).
3. قم بإيداع البويضات في واحدة من قطرات pronase ، مما يضمن وجود اتصال ضئيل أو معدوم بينهما.
   ملاحظة: يمكن أن تستغرق إزالة زونا بيلوسيدا كميات متفاوتة من الوقت ، ولكنها تحدث عادة بين 30-120 ثانية باستخدام مرحلة التسخين. عدم وجود مرحلة التدفئة سوف تمتد هذه المرة.
4. راقب البويضات حتى يكون هناك تشوه واضح في zonae pellucidae (انظر الشكل 3).
5. بمجرد أن تصبح منطقة البويضة الواحدة مشوهة ، انقل تلك البويضة إلى قطرة T2 المجاورة. كرر ذلك عندما تصبح البويضات الإضافية مشوهة ، حتى تتم إزالة جميع البويضات من البروناس ووضعها في قطرة T2.
6. راقب البويضات حتى تبقى طبقة رقيقة فقط من منطقة البيلوسيدا.
7. اغسل البويضات من خلال القطرات الثلاث التالية داخل الصف (T2 ، T20 ، T20) ، ثم قم بإيداعها في خطوط رأسية داخل قطرات CB / T20 (انظر الشكل 4).
   1. ابدأ بعدد أقل من البويضات في الخطوط الرأسية وقم بزيادة عدد البويضات لكل قطرة مع تقدم مهارات القطع.

الشكل 3: إزالة زونا بيلوسيدا باستخدام البروناس. (80x) ستبدأ البويضة زونا بيلوسيدا في الظهور مشوهة عندما يؤثر البروناس على زونا بيلوسيدا بما يكفي لنقل البويضة إلى قطرة T2 المجاورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: اتجاه البويضات في قطرات ثنائية القطع. (80x) تترسب البويضات الخالية من زونا في اتجاه شبه رأسي داخل كل قطرة CB / T20 قبل القطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. تقسيم البويضات

1. ركز على أول قطرة CB/T20 (ثنائية القطع) في أقصى اليسار تحتوي على البويضات، واستخدم ماصة الفم لتدوير البويضات، بحيث يكون الجزء الكثيف من الميتوكوندريا من كل بويضة إما متجها نحو ذراع المجهر أو بعيدا عنه.
   ملاحظة: لن يحتوي الجزء الكثيف من الميتوكوندريا على دهون، والتي تظهر كأحلك جزء من البويضة بعد الطرد المركزي.
2. ضع طرف الشفرة الدقيقة على يسار البويضة العلوية ، بما يتماشى مع المساحة الموجودة فوق الجزء الكثيف من الميتوكوندريا مباشرة. الحفاظ على طرف الشفرة في نفس المكان ، قم بخفض الشفرة بعناية لقطع كل الطريق من خلال البويضة.
   1. التأكد من أن البلاست الكثيف بالميتوكوندريا والأوبلاست المختزل بالميتوكوندريا متشابهان في الحجم ؛ يجب أن يقطع التقسيم الثنائي كل بويضة إلى نصفين لإنتاج اثنين من البلاستيدات البيضاء.
      ملاحظة: قد تختلف الأحجام المقارنة للأوبلاستيدات المنتجة من بويضة واحدة بناء على أهداف البحث؛ إذا كان من المقرر دمج البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا مع خلية جسدية ، فيجب أن يكون حجمها أكبر من البلاستيدات الكثيفة بالميتوكوندريا.
   2. تأكد من أن الشفرة تقسم البويضة فوق الجزء الكثيف من الميتوكوندريا وأسفل الجزء الكثيف من الدهون ، في أوضح جزء من بويضة الطرد المركزي.
3. عند رفع الشفرة ، تأكد من الحفاظ على نفس الخط ، وأن طرف الشفرة يبقى في نفس المكان ، ثم ارفع الطرف برفق من اللوحة.
4. كرر خطوات الاستئصال الثنائي لجميع البويضات خلال قطرة المقطع الثنائي الأولى. إذا كانت البويضات موجودة في قطرات إضافية ، فقم بتوجيه البويضات المتبقية وتقسيمها.
5. باستخدام ماصة الفم ، اجمع البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا من أول قطرة مقطعة. ضعها في قطرة T20 اليسرى الموجودة في الصف السفلي من اللوحة. كرر ذلك لجميع قطرات المقطع الثنائي المتبقية.
   ملاحظة: ستحتوي البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا على دهون أغمق لونا من بقية البويضات.
6. باستخدام ماصة الفم ، اجمع البلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا من أول قطرة ثنائية القطع. ضعها في قطرة T20 اليمنى الموجودة في الصف السفلي من اللوحة. كرر ذلك لجميع قطرات المقطع الثنائي المتبقية.
   ملاحظة: سيكون للمناطق كثيفة الميتوكوندريا تكتل مرئي من العضيات التي ستكون رمادية فاتحة في المظهر.
7. استرجع طبق T10 المكون من أربعة آبار من الحاضنة. باستخدام ماصة فم، حرك جميع البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا إلى البلاستيدات المسماة جيدا "MR"، وانقل البلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا إلى البلاستيدات المصنفة جيدا "M".
8. ضع اللوحة ذات الأربعة آبار مرة أخرى في الحاضنة التي يتم التحكم فيها بواسطة CO₂. اسمح للأوبلاستيدات بالراحة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تحديد كمية mtDNA.

6. القياس الكمي للحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين

1. استخدم مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي المصممة لاستخراج المواد من عينة صغيرة لاستخراج الحمض النووي من عينات فردية (بويضات مفردة ، أوبلاستيدات واحدة كثيفة الميتوكوندريا ، أوبلاستيدات واحدة مستنفدة للميتوكوندريا).
2. استخدم طريقة قياس كمية الحمض النووي المختارة لضمان استخراج الحمض النووي بنجاح من كل عينة. إذا لم يكتمل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) في ذلك الوقت ، فقم بتجميد الحمض النووي المستخرج في أنبوب ملصق في ثلاجة -80 درجة مئوية.
3. أداء qPCR
   1. ارجع إلى الجدول 2 لتحديد حجم كل كاشف لإضافته إلى كل أنبوب qPCR ، إلى جانب تسلسلات التمهيدي. تم تصميم هذه الاشعال لتضخيم منطقة 12S من mtDNA البقري.
   2. اضبط وقت تمسخ الأولي لمدة 10 دقائق ، تليها 35 دورة من: 30 ثانية من تمسخ عند 94 درجة مئوية ، و 15 ثانية من التلدين عند 60 درجة مئوية ، و 15 ثانية من التمديد عند 72 درجة مئوية. عند اكتمال التفاعل، سجل قيم عتبة الدورة (C_t).
      ملاحظة: من أجل الحصول على قيم عدد نسخ mtDNA النسبية، يجب إنتاج منحنى قياسي باستخدام عينات تحتوي على كميات معروفة من أرقام نسخ mtDNA، والتي تزداد أضعافا مضاعفة. ثم يجب معالجة قيم عتبة الدورة باستخدام الصيغ التالية لتحديد أرقام نسخ mtDNA النسبية.
   3. احصل على تركيز الحمض النووي باستخدام المعادلة أدناه:
      تركيز الحمض النووي = (10 ^{(Ct-intercept/slope))} × الحجم المختبر
   4. احصل على رقم النسخة باستخدام المعادلة أدناه:
      رقم النسخة =
   5. احصل على رقم النسخة باستخدام المعادلة أدناه:
      رقم النسخ لكل خلية = 2 ×

الشكل 5: منحنى الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين MTDNA للخلايا الجسدية. تم إنشاء هذا المنحنى القياسي من خلال القياس الكمي mtDNA للتركيزات اللوغاريتمية للخلايا الجسدية البقرية باستخدام كواشف qPCR والبرنامج كما هو موضح في خطوة البروتوكول 6.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تستخدم نتائج PCR الكمية (qPCR) لتحديد الكميات النسبية من mtDNA الموجودة في كل ooplast. تم تصميم التفاعل الموصوف لتضخيم منطقة 12S من mtDNA البقري.

إذا نجح التقسيم الثنائي ، فإن العينات من البويضات الكاملة والبلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا سيكون لها قيم C_t مماثلة. سيكون للعينات من البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا قيم C_t أعلى عند مقارنتها بالعينات من المجموعتين الأخريين. يظهر أدناه رسم بياني C_t يوضح نتائج المقطع الثنائي الناجحة. تشير هذه النتائج إلى أن التقسيم الثنائي قد قلل بشكل فعال من محتوى mtDNA في البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا (الشكل 6).

الشكل 6: نتائج qPCR ثنائية المقطع الناجحة. يعرض الرسم البياني الذي يقارن رقم الدورة والتألق قيم عتبة الدورة للبويضات المفردة والبلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا (التي تمثلها الخطوط الأرجوانية) والبلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا. يبلغ متوسط قيم Ct للبويضات المختزلة بالميتوكوندريا 29.931 (الخطوط الأرجوانية) ، في حين أن متوسط قيمة Ct للبويضات المفردة هو 20.802 (الخطوط الحمراء والخضراء) ، ومتوسط قيمة Ct للأوبلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا هو 21.389 (الخطوط الزرقاء والذهبية). تشير زيادة قيم Ct لعينات البلاستاست المختزلة بالميتوكوندريا إلى انخفاض في عدد نسخ mtDNA داخل هذه العينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يظهر الرسم البياني C_t الذي يظهر نتائج المقطع الثنائي غير الناجحة في الشكل 7. تشير هذه النتائج إلى أن الاستئصال الثنائي لم يقلل بشكل فعال من محتوى mtDNA في البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا:

الشكل 7: نتائج qPCR ثنائية المقطع غير الناجحة. يعرض الرسم البياني الخطي الذي يقارن رقم الدورة والتألق قيم عتبة الدورة للبويضات المفردة (الخطوط الخضراء الداكنة والخضراء الفاتحة) ، والبلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا (الخطوط الأرجوانية) ، والبلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا (الخطوط الزرقاء والذهبية) ، وكلها تحتوي على قيم Ct ضمن نطاق 20.232-20.757. وهذا يشير إلى عدم وجود تغيير كبير في عدد نسخ mtDNA في عينات البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد إنتاج منحنى قياسي واستخدام صيغ عدد نسخ mtDNA المقدمة ، تم تحقيق متوسط تخفيض mtDNA للبويضة بنسبة 93.88٪ باستخدام هذا البروتوكول (الشكل 8).

الشكل 8: Boxplot يقارن بين أعداد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا النسبية التي تم الحصول عليها من البويضات الكاملة ، والبلاستيدات المختزلة للميتوكوندريا ، والبلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا. البويضات الكاملة (n = 38) ، ooplasts المخفضة للميتوكوندريا (n = 34) ، و ooplasts كثيفة الميتوكوندريا (n = 29). تحتوي البلاستيدات المختزلة بالميتوكوندريا على عدد نسخ أقل بكثير مقارنة بالمجموعتين الأخريين (P < 0.001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الحلول المطلوبة. يوفر كميات من المذابات والمذيبات لكل حل مطلوب داخل البروتوكول.

الجدول 2: تكوين تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. يوفر تسلسلات تمهيدية أمامية وعكسية وأحجام لجميع الكواشف اللازمة لكل أنبوب PCR كمي.

الطرق المستخدمة سابقا لتقليل أعداد نسخ mtDNA في البويضات لها عيوبها الخاصة. إزالة الميتوكوندريا القائمة على المعالجة الدقيقة من البويضات تقلل من أعداد نسخ mtDNA بمعدل 64٪ ²⁷. تتضمن الطريقة الفريدة ، التي كانت تستخدم سابقا للاستئصال ، استخدام ماصات باستور ذات القطر الصغير وتقسيم بويضة خالية من البيلوسيدا على الحدود بين قطرة صغيرة من الوسائط والزيوت المعدنية المحيطة. جنبا إلى جنب مع استخدام الطرد المركزي للبويضات ، يمكن لهذا النهج إنتاج أوبلاستيدات قابلة للحياة منخفضة الميتوكوندريا²⁸. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ بعد عن مزيج من الطرد المركزي وطريقة تقسيم البويضات هذه لإنتاج الأجنة. طرق الحد من الميتوكوندريا الكيميائية (مثل تعرض البويضات ل 2′,3′-dideoxycytidine (ddC) ، مثبط تخليق mtDNA) قد خفضت أعداد نسخ mtDNA البويضات بنسبة تصل إلى 50٪ وتتطلب تعرض COC للمادة الكيميائية لأكثر من 40 ساعة أثناء النضج في المختبر (IVM) ^16,27. على الرغم من أن احتضان بويضات الخنازير في وسائط مكملة ب ddC لمدة 40 ساعة لم يمثل مشكلات للأجنة المعاد بناؤها¹⁶ ، إلا أنه لا توجد بيانات منشورة بعد بشأن تعرض البويضات البقرية ل ddC خلال 20-22 ساعة IVM أو أي تطور جنيني لاحق. تقلل الطريقة الموصوفة في هذه الورقة من عدد نسخ mtDNA النسبي بنسبة 93.88٪ تقريبا ، من متوسط 45,565 ± 37,169 نسخة (متوسط ± SD) إلى 8,396 ± 13,287.

هناك عدة خطوات ضمن البروتوكول ضرورية للحصول على نتائج مرضية من حيث الحد بشكل فعال من عدد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) من البويضة. سيؤدي الطرد المركزي للبويضات بالسرعة المحسنة (15000 × جم) والوقت (12 دقيقة) إلى إنشاء جزء ميتوكوندريا أكثر تركيزا في قطب واحد من كل بويضة. من المرجح أن يؤدي الحجم الصحيح من Cytochalasin B / Synthetic Oviductal Fluid مع محلول HEPES (CB / HSOF) (50 ميكرولتر) إلى القضاء على تحلل البويضات بسبب الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي ، تتم إزالة zona pellucida (ZP) عن طريق التعرض لمحلول pronase ؛ ستضمن الإزالة الكاملة ل ZP قطعا أكثر دقة ويجب أيضا فصل أي خلايا ركامية متبقية عن البويضات. يعد استخدام مرحلة التسخين على المجهر أثناء إزالة ZP أمرا اختياريا ، ولكنه يسرع إزالة ZP بمقدار 1 دقيقة على الأقل. إن توجيه البويضات الخالية من البيلوسيدا (ZF) في قطرات المقطع أمر بالغ الأهمية لتقسيمها بدقة. يجب أن يكون جزء الميتوكوندريا ، الموجود في قطب واحد من كل بويضة ، مرئيا بوضوح ويقع إما في أعلى أو أسفل البويضة قبل التشريح. سيحتوي القطب المقابل على قطرات دهنية داكنة. بعد التقسيم الثنائي ، يعد اختيار البلاستيدات وتصنيفها الصحيح (ككثيفة الميتوكوندريا أو المستنفدة للميتوكوندريا) أمرا بالغ الأهمية للحصول على تقييم دقيق للمقطع الثنائي. من المهم أيضا اختيار البويضات Metaphase II (MII) التي سيتم تقسيمها إلى قسمين. من المرجح أن يؤدي التأكد من أن البويضات المستخدمة كروية ولها سيتوبلازم متجانس إلى إحداث فرق في أرقام نسخ mtDNA الموجودة داخل كل بويضة و ooplast. عند تصميم وتوليف تفاعلات البوليميراز الكمية الفردية (qPCR) ، فإن ضمان استخدام الاشعال الصحيحة وتركيزات الكواشف في كل تفاعل أمر مهم للحصول على نتائج دقيقة. في حالة إنتاج منحنى قياسي ، يجب إنشاؤه بأكبر قدر ممكن من الدقة ، ويجب إجراء جميع التفاعلات في ثلاثة أضعاف لتحقيق دقة أكبر. يجب أن تظل أوقات ودرجات حرارة كل مرحلة من مراحل qPCR كما هي في كل تشغيل.

قد تنشأ بعض المشكلات أثناء اتباع البروتوكول. عند إضافة الزيت إلى لوحة المقطع ، تأكد من تغطية القطرات فقط ؛ الكثير من الزيت سيجعل استخدام الماصة أقل كفاءة ، في حين أن القليل جدا سيؤدي إلى تبخر القطرات. هذا التبخر من شأنه أن يسبب تغييرا في الأسمولية من المحاليل ، والتي يمكن أن تكون ضارة للبويضات والبلاستيدات البيضاء. إذا كانت البويضات تتحلل بعد هضم ZP ، فمن المحتمل أن يكون هذا بسبب أحد أو كلا مما يلي ، بناء على التجربة الشخصية والملاحظة: لم يتم طرد البويضات مركزيا للوقت والسرعة المحددين ، و / أو تعرضت البويضات للبروناز لفترة طويلة جدا. قد لا تستعيد بعض بويضات ZF شكلا كرويا تماما داخل قطرات المقطع الثنائي. ضع في اعتبارك أنه لن تكون جميع بويضات ZF قادرة على وضعها على النحو الأمثل للتقسيم الثنائي. في هذه الحالة ، هناك ثلاثة خيارات: إعطاء بويضات ZF وقتا إضافيا لاستعادة شكل كروي. عقد البويضات بلطف في وضع أكثر استقامة مع microblade قبل التشريح ؛ لا تقسم البويضات التي لا يمكن وضعها بشكل صحيح. إن تحديد أي أوبلاستيدات كثيفة الميتوكوندريا أو مستنفدة للميتوكوندريا بعد التقسيم الثنائي سيؤثر على نتائج القياس الكمي. إذا كان تصنيف ooplasts صعبا ، فضع البويضات التي سيتم تقسيمها بحيث يتم توجيه جزء الميتوكوندريا دائما نحو أعلى أو أسفل القطرة ، و / أو ابحث عن جزء مظلم من البويضة في أحد أقطابها (تتركز قطرات الدهون هذه في القطب المقابل من جزء الميتوكوندريا). في بعض الأحيان ، يمكن أن تلتصق ooplasts ببعضها البعض و / أو المسافة البادئة التي تصنعها الشفرة الدقيقة في اللوحة. في بعض الأحيان ، فإن تزويد ooplasts بوقت إضافي لاستعادة شكل كروي سيساعد في الفصل. وتشمل الخيارات الأخرى النقر برفق على اللوحة، وامتصاصها برفق داخل وخارج الماصة، و/أو استخدام حافة الماصة لفصل البلاستيدات بلطف عن الأوبلاست.

طريقة تقليل عدد نسخ mtDNA هذه لها حدودها. يعتمد أحدهما على مصدر البويضات ، والآخر يرجع إلى إزالة ZP من البويضة. سيؤثر مصدر البويضة (الحيوان نفسه ، المبيض المحدد ، والجريب المحدد) بشكل كبير على أرقام نسخ mtDNA داخل تلك البويضة المحددة. هناك انحراف معياري كبير حول متوسط عدد نسخ mtDNA لبويضة واحدة ، مما يشير إلى مدى تغير رقم النسخة. هناك حاجة إلى العديد من تفاعلات تحديد كمية البويضة المفردة للحصول على رقم نسخة قياسي قوي من البويضة الواحدة التي ستتم مقارنتها بالبلاستيدات والبويضات الأخرى. كما أن الانحراف المعياري الكبير يجعل مقارنة ooplast بالبويضة أقل مطلقة ، حيث لا يمكن مقارنة رقم نسخة ooplast ببويضة المنشأ.

إن هضم البويضات الزونية يجعل بويضة ZF الناتجة والبلاستيدات أكثر هشاشة مما كانت عليه قبل إزالة البيلوسيداي المناطقية. تؤدي هذه الهشاشة إلى ارتفاع معدلات تحلل البلاستيدات وبويضات ZF نفسها ، خاصة مع استخدام microblade - يجب استخدام قدر كبير من العناية والدقة. إذا تم استخدام ooplasts للاندماج ، فإنها تتطلب الراحة بعد التشريح قبل محاولة الانصهار. خلاف ذلك ، من المرجح أن تتحلل العديد من ooplasts. تميل البلاستيدات المستنفدة من الميتوكوندريا إلى أن تكون أكثر حساسية من نظيراتها كثيفة الميتوكوندريا. تميل الأنابيب الدقيقة للبويضة إلى الهجرة مع الميتوكوندريا إلى نفس القطب من البويضة أثناء الطرد المركزي ، مما يترك البلاستيدات المستنفدة من الميتوكوندريا مع مكونات هيكلية أقل²⁹. هناك حاجة إلى مزيد من البحث والتلطيخ لتحديد ما إذا كانت عضيات البويضات الأخرى تتأثر سلبا بمزيج من الطرد المركزي والتقسيم الثنائي المستخدم لإنتاج البلاستيدات البيضاء في هذا البروتوكول.

ومن شأن انخفاض الميتوكوندريا البويضة أن يقلل من الميتوكوندريا لأنواع البويضات في جنين iSCNT الناتج، وبالتالي يقلل من حدوث الميتوكوندريا غير المتجانسة في ذلك الجنين المعاد بناؤه. ستزداد فرص نمو الجنين نسبيا، ولكن من المرجح أن يتطلب مكملات الميتوكوندريا من أنواع الخلايا المانحة لتلبية متطلبات الطاقة أثناء النمو. حتى الآن ، لم تنتج محاولات iSCNT التي استخدمت الصلبان بين الأنواع ذرية حية. قد يؤدي تقليل التباين في أجنة iSCNT إلى زيادة احتمال نجاح الحمل. iSCNT هي طريقة يمكن أن تساعد في إنقاذ بعض الأنواع البالغ عددها 40000 نوع المصنفة على أنها مهددة بالانقراض³⁰. نظرا لأن الخلايا الجسدية من هذه الأنواع عادة ما تكون أكثر سهولة من خلاياها الجرثومية ، يمكن ل iSCNT استخدام هذه الخلايا الجسدية ، إلى جانب البويضات من الأنواع المحلية. وقد نجحت المحاولات داخل الجنيسة في إنتاج الحيوانات الحية³¹،³²،³³ ، على الرغم من أن النسل عادة ما يكون وهميا ل mtDNA ^، والعثور على مصدر بويضة داخل الجنيسة ليس ممكنا دائما. إن التقسيم الثنائي للبويضات بهدف تقليل أعداد نسخ mtDNA ، يليه اندماج هذه البلاستيدات مع خلية جسدية متعددة الأنواع ، من شأنه أن يقلل من الوهم والتباين في أجنة iSCNT. وبسبب هذه التخفيضات، فإن استخدام الطريقة الموصوفة يسمح بإمكانات أكبر للولادات الحية بين الأنواع واستمرار الأنواع المهددة بالانقراض.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يود المؤلفون أن يشكروا زملائهم في جامعة ولاية يوتا ، وباحثي العلوم الإنجابية في حديقة سان دييغو ، والدكتورة ريبيكا كريشر في Genus PLC.