Method Article
هنا نقدم بروتوكولا يستند إلى نظام دودة الوجبات (Tenebrio molitor) الطعم الذي تم استخدامه لعزل واختيار الفطريات المسببة للأمراض (EPF) من عينات التربة. يتم استخدام صيغة رقم كونيديا فعالة (ECN) لاختيار EPF عالية تحمل الإجهاد على أساس الخصائص الفسيولوجية لمكافحة الآفات الميكروبية في هذا المجال.
الفطريات النتوموباثوجينية (EPF) هي واحدة من عوامل مكافحة الميكروبات للإدارة المتكاملة للآفات. لمكافحة الآفات المحلية أو الغازية، من المهم عزل واختيار الشراكة بين الشعوب الأصلية. لذلك ، تم استخدام طريقة طعم التربة جنبا إلى جنب مع الطعم الحشري (دودة الوجبات ، Tenebrio molitor) في هذه الدراسة مع بعض التعديلات. ثم خضع صندوق المعاشات التقاعدية المعزول لاختبار الفوعة ضد الآفات الزراعية سبودوبتيرا ليتورا. وعلاوة على ذلك، تعرضت سلالات ال EPF المحتملة لتحديدات مورفولوجية جزيئية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء إنتاج كونيديا و المقايسة الحرارية لسلالات EPF واعدة ومقارنتها؛ وقد تم استبدال هذه البيانات كذلك في صيغة رقم كونيديا الفعال (ECN) لتصنيف المختبر. ويمكن تحسين نظام دودة الطعم في التربة وصيغة ال ECN عن طريق استبدال أنواع الحشرات ودمج المزيد من عوامل الإجهاد لتقييم التسويق والتطبيق الميداني. ويوفر هذا البروتوكول نهجا سريعا وفعالا لاختيار الأنظمة الاحيائية، وسيحسن البحوث المتعلقة بعوامل المكافحة البيولوجية.
حاليا، الفطريات المسببة للأمراض (EPF) تستخدم على نطاق واسع في مكافحة الميكروبات من الآفات الزراعية والغابات والبستانية. ومزايا صندوق الالشراكة الاقتصادية هي نطاقات مضيفه الواسعة، وقدرته الجيدة على التكيف البيئي، وطبيعته الصديقة للبيئة، وأنه يمكن استخدامه مع مواد كيميائية أخرى لإظهار الأثر التآزري للإدارة المتكاملة للآفات(1)،2. للتطبيق كعامل لمكافحة الآفات ، من الضروري عزل عدد كبير من EPF إما عن الحشرات المريضة أو البيئة الطبيعية.
وتساعد عينات هذه الكائنات الحية من مضيفيهم في فهم التوزيع الجغرافي ومعدل انتشار الكائنات الحية الكهربائية في التجمعات الطبيعية 3,4,5. ومع ذلك ، فإن جمع الحشرات الفطرية المصابة عادة ما تكون محدودة بسبب العوامل البيئية ومجموعات الحشرات في الميدان4. وبالنظر إلى أن مضيفي الحشرات سيموتون بعد عدوى ال EPF ثم يسقطون في التربة، فإن عزل صندوق المعاشات التقاعدية عن عينات التربة قد يكون موردا مستقرا3,6. على سبيل المثال، من المعروف أن saprophytes تستخدم المضيف الميت كمورد للنمو. وقد استخدم الطعم التربة والنظم المتوسطة الانتقائية على نطاق واسع للكشف عن الأنظمة EPF وعزلها عن التربة3,4,7,8,9,10.
في الطريقة المتوسطة الانتقائية ، يتم طلاء محلول التربة المخفف على وسيط يحتوي على مضادات حيوية واسعة الطيف (على سبيل المثال ، الكلورامفينيكول ، التتراسيكلين ، أو ستريبتومايسين) لمنع نمو البكتيريا2،3،9،11. ومع ذلك، فقد أفيد بأن هذه الطريقة قد تشوه تنوع السلالة وكثافتها ويمكن أن تسبب تقديرا مفرطا أو أقل من التقدير للعديد من المجتمعات الميكروبية(6). وعلاوة على ذلك، فإن السلالات المعزولة أقل إمراضا وتتنافس مع الصابورفيت أثناء العزلة. من الصعب عزل EPF عن محلول التربة المخفف3. وبدلا من استخدام وسيلة انتقائية، تعزل طريقة طعم التربة ال EPF عن الحشرات الميتة المصابة، والتي يمكن تخزينها لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، مما يوفر طريقة فصل أكثر كفاءة ومعيارا للقوة EPF3,4,7,6. لأن الطريقة سهلة التشغيل ، يمكن للمرء عزل مجموعة متنوعة من السلالات المسببة للأمراض بتكلفة منخفضة4. لذلك، يتم استخدامه على نطاق واسع من قبل العديد من الباحثين.
عند مقارنة الأنواع المختلفة من أنظمة الطعم الحشري ، فإن Beauveria bassiana و Metarhizium anisopliae هي أكثر أنواع EPF شيوعا الموجودة في الحشرات التي تنتمي إلى Hemiptera و Lepidoptera و Blattella و Coleoptera6 و 12 و 13 و 14. من بين هذه الطعوم الحشرية ، تظهر جاليريا ميلونيلا (طلب Lepidoptera) و Tenebrio molitor (أمر Coleoptera) معدلات استرداد أعلى من Beauveria و Metarhizium spp. ، بالمقارنة مع الحشرات الأخرى. لذلك ، يتم استخدام G. mellonella و T. molitor عادة لاصطياد الحشرات. على مر السنين، أنشأت وزارة الزراعة في الولايات المتحدة مكتبة EPF (مجموعة خدمات البحوث الزراعية لثقافات EPF، ARSEF) التي تحتوي على مجموعة واسعة من الأنواع، بما في ذلك 4081 نوعا من بوفيريا spp.، 18 نوعا من كلونوستاشيس spp.، 878 نوعا من كورديسيبس spp.، 2473 نوعا من Metarhizium spp.، 226 نوعا من بوربوريوسيليوم spp.، و 13 نوعا من Pochonia spp. من بين أمور أخرى15. تم بناء مكتبة أخرى من EPF من قبل مختبر أبحاث علم الحشرات (ERL) من جامعة فيرمونت في الولايات المتحدة لمدة 30 عاما. ويشمل 1345 سلالة من EPF من الولايات المتحدة وأوروبا وآسيا وأفريقيا والشرق الأوسط16.
10- لمكافحة الآفات المحلية أو الغزوية في تايوان، يلزم عزل واختيار قوات حماية البيئة الأصلية. لذلك ، في هذا البروتوكول ، قمنا بتعديل ووصف إجراء طريقة طعم التربة ودمجها مع الطعم الحشري (دودة الوجبات ، Tenebrio molitor) system17. وبناء على هذا البروتوكول، أنشئت مكتبة للقوة الك000. وأجريت جولتان من الفحص (تحديد كمي للتلقيح) لعزلات EPF الأولية. أظهرت عزلات EPF إمراضية للحشرات. وقد خضعت السلالات المحتملة لتحديدات مورفولوجية جزيئية وخضعت لمزيد من التحليل من خلال فحص الحرارة والإنتاج المخروطي. وعلاوة على ذلك، اقترح أيضا مفهوم رقم كونيديا فعال. وباستخدام صيغة ECN وتحليل المكونات الرئيسية (PCA)، تم تحليل السلالات المحتملة تحت ضغط بيئي محاكاة لإكمال عملية إنشاء مكتبة EPF وفحصها. وفي وقت لاحق، تم اختبار الإمراض من سلالات EPF الواعدة للآفات المستهدفة (مثل Spodoptera litura). ويدمج البروتوكول الحالي بيانات ثيرموتوليرانس والإنتاج الموحد في صيغة ECN وتحليل PCA، والتي يمكن استخدامها كنظام تصنيف قياسي للبحوث ذات الصلة ب EPF.
ملاحظة: يظهر المخطط الانسيابي بالكامل في الشكل 1.
1. عزل واختيار الفطريات الإنتوموباتية المحتملة (EPF)
2. التعريف الجزيئي لEPF
3. تحديد شكلي لEPF
4. التحقيق في الإنتاجية الزوجية والتولير الحراري
5. رقم كونيديا الفعال (ECN) الترتيب
عزل واختيار الفطريات الإنتوموباتشيكية المحتملة (EPF)
وباستخدام طريقة بناء مكتبة تينبريو موليتور بوساطة الفطريات الإنتوموباتشيكية ، سيتم استبعاد عدد الفطريات التي لا تحتوي على نشاط لقتل الحشرات ؛ وبالتالي، يمكن زيادة كفاءة اختيار صندوق المعاشات التقاعدية واختياره بشكل كبير. وأثناء تطبيق هذه الطريقة، سجلت معلومات عن مواقع أخذ العينات وعينات التربة ومعدلات الإنبات الفطري (الجدول 2). واستنادا إلى بياناتنا السابقة، تم الحصول على ما مجموعه 101 عزل فطري من 172 عينة من التربة، مما يشير إلى كفاءة عزل عالية بنسبة 64٪. من بين 101 عزل فطري ، أظهرت 26 عزلة نشاطا مبيدا للحشرات ضد T. molitor (وفيات 100٪ ) بعد فحص الإمراض الأول ، وبالتالي كان القضاء على العزل الفطري 26/101 = 25.7٪. في اختبار الفوعة الثاني ، تم إثبات الفوعة العالية للعزلات الفطرية ال 26 ضد T. molitor ، وأظهرت 12 منها درجة عالية من الإمراض ضد يرقات T. molitor (100٪ وفيات في 5 أيام بعد التطعيم) (الشكل 2A). وقد استخدمت هذه لتقييم اختبار الفوعة ضد الآفة الزراعية. استنادا إلى بيانات وفيات اختبار الفوعة الثالثة وLT50، ما مجموعه ستة عزلات فطرية (NCHU-9، 11 و64 و69 و95 و113) كشف عن نشاط سريع لقتل الحشرات ضد سبودوبتيرا ليتورا (LT50 = 2.94 و2.22 و2.84 و2.57 و2.96 و1.13) ، تم تقييمه باستخدام المقايسة الفسيولوجية ورقم كونيديا الفعال (ECN) (الشكل 2B).
التعريف الجزيئي ل EPF
لفهم أفضل لمواقع التصنيف الفطرية ، تم إخضاع 26 عزلة من فحص الإمراض الأول للتحليل الجزيئي استنادا إلى منطقة ITS (الشكل 3A). وأظهرت النتيجة أن هذه العزلات الفطرية يمكن تقسيمها بوضوح إلى سبعة أجناس، بما في ذلك بوفيريا، كلونوستاشيس، فوساريوم، كورديسيبس، البنسليوم، بوربوريوسيليوم، وميتاريزيوم (الشكل 3A). واستنادا إلى منطقة ITS1-5.8S-ITS2، تم التأكد بدقة من تصنيف جنس EPF، في حين أن مستوى الأنواع لا يزال لا يمكن تمييزه. لذلك ، يتم استخدام تسلسل منطقة tef لتصنيف مستوى الأنواع بوضوح ل 12 عزلة واعدة ل EPF من اختبار الفوعة ضد الآفة الزراعية. وأظهر التحديد الجزيئي للعزلات الاثنتي عشرة أن 11 عزلة تنتمي إلى الميترايزيوم وتحتوي على أربعة أنواع، بما في ذلك M. ليبيديوتاي (NCHU-9، NCHU-102)، م. بينغهاينسي (NCHU-10، NCHU-11، NCHU-30، NCHU-32، NCHU-64)، م. برونيوم (NCHU-27، NCHU-29)، و M. anisopliae (NCHU-69، NCHU-95). أما العزل المتبقي فقد عرف بأنه ب. أوستراليس (NCHU-113) (الشكل 3B، جيم). وفقا للنتيجة المذكورة أعلاه ، يمكن لمنطقة تسلسل tef التمييز بشكل فعال بين جنس Metarhizium على مستوى الأنواع ، في حين تحتاج الأنواع الأخرى إلى العثور على مناطق تسلسل أخرى كعلامات جزيئية لتمييز الأنواع.
التعريف المورفولوجي ل EPF
من خلال طريقة التنظيف (الخطوة 3.2.3) من الملاحظات المورفولوجية الفطريات ، يمكن رؤية هياكل conidiophores بوضوح مع محلول Tween 80 بنسبة 0.1٪ (الشكل 4A) ، ويمكن أن تكون هذه الملاحظات بمثابة معيار لقياس حجم الهيكل وأخذ سجل صور. يمكن رؤية لون وشكل وترتيب كونيديا من خلال الملاحظات المجهرية للمستعمرة كونيديا (الشكل 4B، C). وبعد الملاحظة، يمكن قياس حجم شكلي كونيديا وكونيديفور أكثر ومقارنتنا إحصائيا (الجدول 3).
التحقيق في الإنتاجية الزوجية، thermotoleranceand ECN الترتيب
ويمكن أن تساعد صيغة ال ECN، التي اقترحها التقرير السابق21، في اختيار طابع فسيولوجي عالي التسامح مع الإجهاد. تجمع ECN بين بيانات إنتاج كونيديا وتولير الحرارة لكل EPF (الشكل 5A، B)، مما يعني قابلية عالية لقابلية السلالة الفطرية عند ارتفاع قيمة ECN (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، استخدم تصور تحليل المكونات الرئيسية للتحقق من نتائج صيغة ECN. وكشفت النتيجة عن وجود تنسيق كبير بين الفينول الخماسي الكلور والكون، مما يشير إلى إمكانية استخدام صيغة ECN لتقييم التسلسل الهرمي للمعلمات ذات الصلة بقابلية البقاء وإمكانات تطوير الفطريات للتطبيق الميداني وزيادة التسويق (الشكل 5C، دال).
الشكل 1: رسم توضيحي لبناء مكتبة تينبريو موليتور بوساطة الفطريات الإنتوموباتية (EPF). الجزء 1: العزل الفطري من عينة التربة. الجزء 2: الإمراض والفحص القائم على الفوعة وتحديد الفطريات؛ الجزء الثالث - الأرباح التوصيف الفسيولوجي والترتيب الفطري. ECN = رقم كونيديا فعال؛ و PCA = تحليل المكون الرئيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وفيات ديدان الوجبات وSpodoptera litura لاختيار الفطريات الإنتوموباتيوجينيك الواعدة (EPF) يعزل. (أ) 26 مختارة الفطرية 2nd دودة الوجبة اختبار فحولة; وتظهر mycoses من 12 القتل السريع وعزل الفطرية عالية الفوعة في موازاة ذلك. (ب) تم اختيار 12 عزل الفطرية لاختبار الفوعة ضد S. litura. وتكرر الاختبار على كل سلالة فطرية ثلاث مرات. d.p.i. = أيام ما بعد التطعيم. تعديل الشكل والأسطورة مستنسخة بإذن من Fronteris21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحليل النباتي للسلالات الفطريات النتوموباثوجينية (EPF) على مستوى (أ) جنس على أساس منطقة ITS و (B-C) على مستوى الأنواع على أساس tef. تم بناء التحليل النباتي لمنطقة ITS و tef باستخدام أقصى احتمال (ML) ، والحد الأدنى للتطور (ME) ، وأساليب الانضمام إلى الجيران (NJ). تم إجراء تحليلات Bootstrap لتقييم قوة الفيلوجينيات باستخدام 1000 تكرار ، ويشار إلى نسب bootstrap أكبر من 50٪ فوق الفروع. غامق = سلالات من النوع السابق. يشير السهمان الأحمر والأخضر إلى صندوق الأسهم الواعد. تعديل الشكل والأسطورة مستنسخة بإذن من Fronteris21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الفحص المجهري للفطريات النتوموباثوجينية (EPF) (M. anisopliae) مورفولوجيا. مراقبة المخروطيات (A) بعد الغسيل. (ب) مراقبة شكل كونيديا واللون. (ج) ترتيب كونيديا وحزم من سلاسل بوغ (SS) من M. anisopliae؛ Cp = التجمعات؛ cc = كونيديا أسطوانية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التوصيف الفسيولوجي لستة عزلات محتملة وتحليل رقم كونيديا الفعال (ECN). (ب) فحص ثيرموتوليرانس. (ج) رسم شريط قيم ECN. (د) أظهر تحليل المكونات الرئيسية توزيع كل سلالة. تعديل الشكل والأسطورة مستنسخة بإذن من Fronteris21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
اسم التمهيدي | حجم أمبليكون (bp) | تسلسل(5'-3') | قطر | مرجع | |
ITS1F | 550 | تكغتاججتغاكاتغكغ | ITS | 25 | |
ITS4R | TCCTCCغكاتغاتسغاتسك | ||||
tef-983F | 1000 | جي سي جي جي سي سي جي جيتيتيات | tef | 26, 27, 41, 42 | |
tef-2218R | أغاكاكراكراكراكريغتغ |
الجدول 1: أزواج التمهيدي لتحديد الفطرية.
الجدول 2: وترد أدناه المعلمات المسجلة لطريقة بناء مكتبة صندوق المؤشرات الإرشادية بوساطة تينيبريو موليتور. NIU = حرم جامعة إيلان الوطنية. NCHU = حرم جامعة تشونغ هسنغ الوطنية. جدول معدل وأسطورة مستنسخة بإذن من Fronteris21. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
جنس | وتر | فاياليدس ميكرومتر± SD* | كونيديا ميكرومتر± SD* |
ميتاريزيوم ليبيديوتاي | NCHU-9 | أسطواني، 7.3±0.67b×2.4±0.36a | أسطواني، 6.5±0.45a×2.7±0.13b |
ميتاريزيوم بينغهاينسي | NCHU-11 | أسطواني، 8.6±0.68ab×2.6±0.30a | أسطواني، 6.3±0.41b×2.7±0.16b |
ميتاريزيوم بينغهاينسي | NCHU-64 | أسطواني، 10.5±1.54a×2.4±0.32a | أسطواني، 6.8±0.53a×2.9±0.31a |
ميتاريزيوم أنيسوبرليا | NCHU-69 | أسطواني، 9.4±1.58a×2.7±0.32a | أسطواني، 6.3±0.34b×2.6±0.19b |
ميتاريزيوم أنيسوبرليا | NCHU-95 | أسطواني، 9.6±0.87a×2.6±0.29a | أسطواني، 6.0±0.82b×2.9±0.29a |
بوفيريا أوستراليس | NCHU-113 | الحذف، NA×2.6±0.57 | جلوبوز، 2.3±0.24×2.3±0.24 |
*تم إجراء التحليل الإحصائي استنادا إلى اختبار ANOVA الخاص ب Welch باستخدام استوديو R. | |||
§ جدول معدلة وأسطورة يستنسخ بإذن من الجبهة (23). |
الجدول 3: مثال على الملاحظات المورفولوجية لستة عزلات فطرية واعدة entomopathogenic. تم إجراء التحليل الإحصائي استنادا إلى اختبار ANOVA الخاص ب Welch باستخدام استوديو R. جدول معدل وأسطورة مستنسخة بإذن من Fronteris21.
وقد استخدمت الفطريات Entomopathogenic (EPF) لمكافحة الحشرات. هناك عدة طرق لعزل وتحديد وتعريف EPF30,31,32. وبمقارنة الأنواع المختلفة من أساليب الطعم الحشري، تم العثور على بوفيريا باسيانا وميتاريزيوم أنيسوبرليا عادة في الطعم الحشري6،12،13،14. من بين هذه الطعوم الحشرية ، أظهرت غاليريا ميلونيلا وتينبريو موليتور معدلات انتعاش عالية من Beauveria و Metarhizium spp. وفي واقع الأمر، تبين أن فائدة طريقة الطعم (T. molitor) دودة الوجبات هي طريقة ملائمة لعزل قوة التخطيط الإرشادية عن عينات التربة17,21. ومع ذلك ، فقد أفيد أن الحشرات المستخدمة كطعم من شأنها أن تظهر التحيز لعزل أنواع فطرية محددة333. لذلك ، فإن الجمع بين أنواع الحشرات المختلفة (أي جاليريا ميلونيلا و T. موليتور معا) لاصطياد EPF من عينات التربة قد يزيد من تنوع EPF34.
لتقييم نشاط قتل الحشرات ، هناك جولتان من الفحص عن طريق دودة الوجبات (T. molitor) في البروتوكول الحالي لاختيار السلالات الفطرية الواعدة لمزيد من الدراسة. بعد هذه العملية ، يمكن تقليل عدد العزلات الفطرية ، المعزولة عن عينات التربة ، بشكل كبير واقتصر على العزل الفطري الذي أظهر نشاطا كبيرا لمبيدات الحشرات بعد الفحص الأول والثاني. انخفاض كبير من عزل الفطرية للجولة القادمة من الفحص توفير تكلفة الوقت وتستغرق وقتا طويلا. ويمكن أيضا ملاحظة أن العزلات الفطرية المختارة أظهرت اتجاهات مماثلة للتسبب في الإمراض بين دودة الوجبات (T. molitor) ودودة التبغ cutworm (Spodoptera litura) ، مما يدل على اختبار ثابت لإمراض أنواع الحشرات المختلفة ويمكن توسيع نطاقه ليشمل الآفات المحصولية الأخرى21. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حساب ال ECN على أساس الاختبارات الفسيولوجية يمكن أن يسهل اختيار السلالات الفطرية المحتملة لاستخدامها في حقول المحاصيل. وذكرت تقارير أخرى أساليب انتقائية مماثلة، في حين لم تدرج عوامل مثل الخصائص اللاأحيائية وخصائص السلالة 37 36 35 31 8 12.8. ولذلك، قد تتأثر هذه السلالات بالعوامل البيئية مما يؤدي إلى تأثير على أداء الإنبات الفطري وبالتالي صعوبة تسويقها. وهذه النتيجة هي أيضا السبب الرئيسي لعدم قابلية السلالات المختبرية للتطبيق في الميدان38.
من تحديد مورفولوجية، ينبغي توجيه المزيد من الجهود نحو إيجاد بنية واضحة من conidiophore ومراقبة الخصائص المختلفة لكل سلالة فطرية. يمكن أن تشمل الدراسات أساليب مختلفة لحل تحديد الهوية المورفولوجية الصعبة39. ومع ذلك، فإن تحديد مورفولوجية فشل في التمييز بين الأنواع الفطرية ذات الصلة الوثيقة. لذلك ، من الضروري دمج بيانات تحديد الهوية الجزيئية. وأظهرت منطقة المتباعد الداخلي المنسوخ التمييز على مستوى الجنس، في حين أن هناك حاجة إلى علامات جزيئية أخرى (أي tef for Metarhizium، كتلة لبوفيريا) لتحديد مستوى الأنواع26,40,41.
في التوصيف الفسيولوجي ، للحد من الانحراف المعياري للتجارب ، يقترح إما الجهاز أو الدوامة اليدوية لمدة 10 دقائق على الأقل في الحد الأقصى للدر في الدقيقة21. ومن شأن تعليق كونيديا مختلطة تماما زيادة اتساق نتائج فحص الحرارة و المقايسة الإنتاج conidial. من ناحية أخرى ، في مقايسة الإنتاج المخروطية ، أثار رقم كونيديا المحتسب تحت منطقة ثابتة (كتلة 5 مم في الجزء الأوسط من المستعمرة الفطرية في هذه الدراسة) على اللوحة المستزرعة في وقت مختلف مشكلة أن الأنواع الفطرية المختلفة وحتى السلالات المختلفة كشفت عن أداء مختلف لإحكام النمو في الهيفا ، مما قد يؤدي إلى عدم تمثيل العينة. لذلك ، يمكن لطريقة اختبار صارمة لإنتاج كونيديا تحسين المشكلة ، مثل عد عدد كونيديا بدقة من مستعمرة فطرية كاملة وتطبيع مع منطقة النمو42.
تم تصميم صيغة رقم كونيديا الفعالة (ECN) على أساس تأثير الإجهاد البيئي ضد EPF conidia ، أي محاكاة كونيديا تحت حالة البيئة البرية لاختيار السلالات الفطرية الواعدة للتسويق21. في هذا البروتوكول، تم استخدام بيانات إنتاج كونيديا والعلاج الحراري لحساب القيمة الإجمالية ECN لكل سلالة فطرية واعدة، بعد الدراسة السابقة21. علاوة على ذلك ، في ظل بيئة طبيعية ، باستثناء درجة الحرارة ، يمكن أن يؤثر الإجهاد البيئي الآخر ، مثل الرطوبة والأشعة فوق البنفسجية (UV) والمضيف على انبات كونيديا. خاصة، الإجهاد الأشعة فوق البنفسجية هو عامل رئيسي يؤثر على انبات كونيديا لأن الجذور الحرة عالية الطاقة (مثل البيروكسيدات، مجموعات الهيدروكسيل، والأوكسجين المفرد) التي تولدها الأشعة فوق البنفسجية قد تقلل من الإمراض واستمرار المبيدات الميكروبية43. وبالتالي، يمكن زيادة إدراج الإجهاد فوق البنفسجي في صيغة ECN في المستقبل. لتجنب إجهاد الأشعة فوق البنفسجية ، يجب أن تحتوي الصيغة على زيت أو ألمجينات الصوديوم لزيادة تحمل الأشعة فوق البنفسجية ل conidia44،45،46 ، مما يؤكد أن السلالات المحتملة لها فائدة عملية لمكافحة الآفات47.
10- وفر هذا البروتوكول طريقة لعزل سلالات EPF المحتملة بسرعة ودقة لبناء مكتبة EPF بوساطة T. molitor. وهذا هو الأساس اللازم لتطوير بحوث المكافحة البيولوجية. وعلاوة على ذلك، يمكن تحسين صيغة ال ECN بمرونة لمساعدة الباحثين على إدراك إمكانات صندوق الالشراكة الاقتصادية وتطويره ليصبح سلعة للاستخدام في النظم الزراعية.
يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح في هذا العمل.
تم دعم هذا البحث من قبل غرانت 109-2313-B-005 -048 -MY3 من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
-20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved