JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

القوارض غير قادرة على الإبلاغ عن أعراض الصداع النصفي. هنا ، نصف نموذج اختبار يمكن التحكم فيه (فحوصات الضوء / الظلام والمجال المفتوح) لقياس النفور من الضوء ، وهو أحد أكثر الأعراض شيوعا وإزعاجا في المرضى الذين يعانون من الصداع النصفي.

Abstract

الصداع النصفي هو اضطراب عصبي معقد يتميز بالصداع والتشوهات الحسية ، مثل فرط الحساسية للضوء ، والتي لوحظت على أنها رهاب من الضوء. في حين أنه من المستحيل التأكد من أن الفأر يعاني من الصداع النصفي ، يمكن استخدام النفور من الضوء كبديل سلوكي لأعراض الصداع النصفي لرهاب الضوء. لاختبار النفور من الضوء ، نستخدم اختبار الضوء / الظلام لقياس الوقت الذي تختار الفئران إنفاقه بحرية في بيئة فاتحة أو مظلمة. تم تحسين الفحص من خلال إدخال تعديلين حاسمين: التعرض المسبق للغرفة قبل تشغيل إجراء الاختبار وإضاءة الغرفة القابلة للتعديل ، مما يسمح باستخدام مجموعة من شدة الضوء من 55 لوكس إلى 27000 لوكس. نظرا لأن اختيار قضاء المزيد من الوقت في الظلام يدل أيضا على القلق ، فإننا نستخدم أيضا اختبار القلق المستقل عن الضوء ، وهو فحص المجال المفتوح ، للتمييز بين القلق والسلوك الكاره للضوء. هنا ، نصف نموذج اختبار معدل لفحوصات المجال الفاتح / المظلم والمفتوح. يتم وصف تطبيق هذه الفحوصات للحقن داخل الصفاق للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) في سلالتين من الفئران ولدراسات تحفيز الدماغ البصري الوراثي.

Introduction

الصداع النصفي هو مرض عصبي سائد ، يؤثر على ما يقرب من 17٪ من الأمريكيين 1 وهو السبب الرئيسي الثاني للإعاقة على مستوى العالم2,3. يعاني المرضى من الصداع الذي يستمر من 4 إلى 72 ساعة مصحوبا بواحد على الأقل من الأعراض التالية: الغثيان و / أو القيء ، أو رهاب الضوء ورهاب الفونوفوبيا4. بدأت التطورات الحديثة في تطوير الأجسام المضادة للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) والتي تمت الموافقة عليها الآن من إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) حقبة جديدة لعلاج الصداع النصفي5,6,7. هذه الأجسام المضادة تمنع إما CGRP أو مستقبلاته وتمنع أعراض الصداع النصفي في حوالي 50٪ من مرضى الصداع النصفي7. خلال العام الماضي ، تمت الموافقة على اثنين من مضادات الجزيئات الصغيرة لمستقبل CGRP أيضا من إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) للعلاج الفاشل للصداع النصفي ، وهناك اثنان آخران في طور الإعداد8. على الرغم من هذا التقدم العلاجي ، لا تزال الآليات التي تحدث بها نوبات الصداع النصفي بعيدة المنال. على سبيل المثال ، مواقع إجراء CGRP غير معروفة. تشير فعالية الأجسام المضادة العلاجية التي لا تعبر بشكل ملحوظ حاجز الدم في الدماغ إلى أن CGRP يعمل في المواقع الطرفية ، مثل السحايا و / أو العقد ثلاثية التوائم. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد الإجراءات المركزية في الأعضاء التحايل ، والتي تفتقر إلى حاجز دموي في الدماغ9. على الأقل بالنسبة لرهاب الضوء، نعتقد أن هذا أقل احتمالا بالنظر إلى نتائجنا مع النفور من الضوء باستخدام الفئران المعدلة وراثيا من النستين/hRAMP1 التي يتم فيها التعبير عن hRAMP1 في الأنسجة العصبية10. سيوفر فهم آليات الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي سبلا جديدة لتطوير علاجات الصداع النصفي.

النماذج الحيوانية قبل السريرية حاسمة لفهم آليات المرض وتطوير أدوية جديدة. ومع ذلك ، فإن تقييم الصداع النصفي في الحيوانات يمثل تحديا لأن الحيوانات لا يمكنها الإبلاغ شفهيا عن أحاسيسها بالألم. بالنظر إلى حقيقة أن 80-90٪ من مرضى الصداع النصفي يظهرون رهاب الضوء11 ، يعتبر النفور من الضوء مؤشرا على الصداع النصفي في النماذج الحيوانية. أدى ذلك إلى الحاجة إلى تطوير فحص لتقييم النفور من الضوء في الفئران.

يحتوي فحص الضوء / الظلام على منطقة ضوء ومنطقة مظلمة. يستخدم على نطاق واسع لقياس القلق لدى الفئران بناء على استكشافها التلقائي للبيئات الجديدة التي يتم مواجهتها من خلال نفورها الفطري من الضوء12. بعض الدراسات تحدد 1/3 من الغرفة كمنطقة مظلمة ، في حين أن البعض الآخر يحدد 1/2 من الغرفة كمنطقة مظلمة. غالبا ما يستخدم الإعداد السابق للكشف عن القلق13. على الرغم من أننا اخترنا في البداية غرف الضوء / الظلام متساوية الحجم ، إلا أننا لم نقارن بين الحجمين النسبيين. يمكننا التعليق على أن الحجم الإجمالي لكلا المجلسين ليس عاملا رئيسيا لأن مربع الاختبار الأولي14 كان أكبر بكثير من الجهاز اللاحق15، ومع ذلك كانت النتائج هي نفسها في الأساس.

كان هناك تعديلان حاسمان على هذا الفحص الضوئي / المظلم لتقييم النفور من الضوء هما: حالة الاختبار وشدة الضوء (الشكل 1). أولا، تتعرض الفئران مسبقا للحجرة الفاتحة/المظلمة لتقليل محرك الأقراص الاستكشافي16 (الشكل 1A). تعتمد ضرورة وأوقات التعرض المسبق على سلالات الفئران ونماذجها. عادة ما تتطلب الفئران من النوع البري C57BL/6J تعرضين مسبقين10، في حين أن التعرض المسبق الوحيد لفئران CD1 يكفي17. وبهذه الطريقة ، يمكن الكشف عن السلوك المتردد للضوء في هاتين السلالتين من الماوس. ثانيا، تم تكييف إضاءة الغرفة لتشمل مجموعة قابلة للتعديل من شدة الضوء من الخافتة (55 لوكس) إلى الساطعة (27000 لوكس) حيث يمكن مقارنة 55 لوكس بيوم ملبد بالغيوم الداكن، و27000 لوكس يمكن مقارنتها بيوم مشمس مشرق في الظل10. لقد وجدنا أن شدة الضوء المطلوبة تختلف باختلاف السلالة والنموذج الوراثي. لهذا السبب ، يجب على الأفراد أولا تقييم الحد الأدنى من شدة الضوء لنموذجهم التجريبي.

حتى مع هذه التعديلات على الفحص ، والتي يمكن أن تكشف عن نمط ظاهري متجنب للضوء ، من الضروري اختبار السلوك الشبيه بالقلق للتمييز بين النفور من الضوء بسبب الضوء وحده مقابل القلق. فحص المجال المفتوح هو طريقة تقليدية لقياس القلق بناء على الاستكشاف التلقائي للبيئات الجديدة. وهو يختلف عن الفحص الفاتح / المظلم في أن محرك الأقراص الاستكشافي يقابله النفور الفطري من المساحات المفتوحة غير المحمية. كل من مركز وحواف الغرفة في الضوء ، وبالتالي فإن فحص المجال المفتوح هو فحص قلق مستقل عن الضوء. وبالتالي ، فإن الجمع بين مقايسات الضوء / الظلام والمجال المفتوح يمكننا من التمييز بين النفور من الضوء بسبب تجنب الضوء مقابل الزيادة الإجمالية في القلق.

CGRP هو نيوروبتيد متعدد الوظائف ينظم توسع الأوعية ، و nociception ، والالتهابات 18. يتم التعبير عنه على نطاق واسع في الجهاز العصبي المحيطي والمركزي. يلعب دورا مهما في الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي18. ومع ذلك ، فإن الآلية الكامنة وراء عمل CGRP في الصداع النصفي غير واضحة. من خلال استخدام مقايسات المجال الفاتح / المظلم والمفتوح مع نموذج الاختبار المعدل هذا ، تمكنا من تحديد السلوك المتردد للضوء في الفئران بعد إدارة CGRP الطرفية 10,16 (الشكل 2) والمركزية14,15,16,19. بالإضافة إلى الببتيدات العصبية ، فإن تحديد مناطق الدماغ المشاركة في النفور من الضوء مهم أيضا في فهم الفيزيولوجيا المرضية للصداع النصفي. نوى المهاد الخلفية هي منطقة دماغية تكاملية لمعالجة الألم والضوء19، ويتم تنشيط المهاد أثناء الصداع النصفي20. وهكذا ، استهدفنا نوى المهاد الخلفية عن طريق حقن الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) الذي يحتوي على قناة رودوبسين-2 (ChR2) أو eYFP في هذه المنطقة. من خلال الجمع بين هذا النهج البصري الوراثي مع هذين الاختبارين ، أثبتنا أن التحفيز البصري للخلايا العصبية المعبرة عن ChR2 في النوى المهادية الخلفية أدى إلى النفور من الضوء19 (الشكل 3). في هذه التجربة ، نظرا للتأثير الدراماتيكي على النفور من الضوء المستحضر في هذه الفئران التي تم التلاعب بها بصريا ، تم تخطي التعرض المسبق للغرفة.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة أيوا وتم تنفيذها وفقا للمعايير التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة.

1. فحص الضوء / الظلام

  1. إعداد جهاز غرفة الضوء/الظلام (انظر جدول المواد). جميع المعدات في هذا القسم متاحة تجاريا.
    1. على الرف، ضع المقصورة المخففة للصوت (الداخلية: 59.7 × 38 × 35.6 سم بالعرض × الارتفاع × العمق) التي تحتوي على درج قابل للسحب لسهولة الوصول إلى الغرفة والإدراج الداكن.
    2. قم بتوصيل مصدر طاقة التيار المستمر ومصدر الطاقة المنظم بواسطة التيار المستمر بالحجرة المخففة للصوت.
    3. ضع حجرة الحقل المفتوح الشفافة غير الملحومة (27.31 × 27.31 × 20.32 سم بالطول × العرض × الارتفاع) على درج الحجرة القابل للسحب.
    4. ضع الحشوة البلاستيكية الداكنة السوداء الشفافة بالأشعة تحت الحمراء (28.7 × 15 × 20.6 سم في الطول × العرض × الارتفاع) في غرفة الحقل المفتوحة. تأكد من تقسيم الغرفة إلى منطقتين متساويتين في الحجم: منطقة مظلمة ومنطقة ضوء.
    5. قم بتوصيل ثلاث مجموعات من صفائف الأشعة تحت الحمراء ذات 16 شعاعا على محاور X وY وZ في غرفة المجال المفتوح بوحدة تحكم IR USB عبر الكابلات.
    6. قم بتوصيل وحدة تحكم IR USB بجهاز كمبيوتر.
    7. قم بتثبيت برنامج التتبع على الكمبيوتر الذي يمكنه تسجيل وجمع موقع الماوس ونشاطه.
    8. لإعداد لوحة الضوء، قم أولا بإزالة لوحة ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) (27.70 × 27.70 سم بالطول × العرض؛ 360 مصباح LED، لون متوازن في ضوء النهار، 5600K، انتشار شعاع الفيضان 60 درجة) من هيكلها الأصلي.
    9. قم بتجميع لوحة الإضاءة باستخدام برنامج تشغيل LED والمشتت الحراري ومصدر الطاقة. يمكن توصيل لوحات إضاءة LED متعددة بمصدر طاقة واحد ومشتت حراري وسائق LED لتحقيق تحكم موحد في لوحة الضوء.
    10. قم ببناء منصة أكريليك مخصصة (29.77 × 27.70 × 8.10 سم في الطول × العرض × الارتفاع) تتكون من 7 أرفف متطابقة على فترات 0.53 سم (الشكل 1B). قم بتثبيت رف الأكريليك المخصص بشكل دائم على السقف داخل المقصورة فوق الغرفة.
    11. أدخل لوحة إضاءة LED في الفتحة الواقعة بين الرفوفين السفليين. اضبط لوحة الضوء على ارتفاعات مختلفة (الشكل 1B ، C) ، إذا لزم الأمر (على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم الفئران البصرية الوراثية. وتناقش التفاصيل في القسم 3).
    12. قم بتشغيل المشتت الحراري وبرنامج تشغيل LED ومصدر الطاقة. تأكد من أن سائق LED يمكنه إملاء شدة ضوء LED عن طريق قياس شدة الضوء على أرضية الغرفة وتأكد من أن الأرضية مضاءة بالتساوي.
  2. إجراء الاختبار السلوكي
    ملاحظة: يتم وضع الفئران في دورة ضوئية مدتها 12 ساعة. يتم إجراء جميع التجارب السلوكية خلال دورة الضوء. يتم استخدام الفئران ، بما في ذلك كل من الذكور والإناث ، الذين تتراوح أعمارهم بين 10-20 أسبوعا. في هذا البروتوكول ، تواجه الفئران الساذجة من النوع البري CD1 و C57BL / 6J تعرضين مسبقين للغرفة الفاتحة / المظلمة يليهما التعرض مع العلاج والتعرض بعد العلاج. هناك فاصل زمني مدته ثلاثة أيام بين كل تعرض للسماح للفئران بالتعافي (اليوم 1 و 4 و 7 و 10 كما هو موضح أدناه والشكل 1 أ). ومع ذلك ، لا تتطلب الفئران CD1 التعرض المسبق الثاني ويمكن اختبارها في الضوء الخافت.
    1. في اليوم الأول (المعالجة المسبقة 1)، قم بتشغيل جهاز فحص الضوء/الظلام واضبط شدة الضوء على 27000 لوكس.
    2. افتح برنامج التتبع وقم بإعداد بروتوكول جديد. في إعداد البروتوكول الجديد ، اضبط المدة على 30 دقيقة. في إعداد تحليل جديد ، قم بتعيين حزم البيانات حسب المدة إلى 300 ثانية.
    3. في إعداد منطقة جديدة ، اختر مناطق محددة مسبقا. اختر 2 ثم أفقي. تحقق مما إذا كانت الغرفة مقسمة إلى منطقتين متساويتين في الحجم أفقيا للتسجيل.
    4. اعتاد الفئران على غرفة الاختبار لمدة 1 ساعة قبل الاختبار. أثناء التعود ، حافظ على إضاءة الغرفة حتى لا تعطل إيقاع الساعة البيولوجية للماوس. تأكد من تشغيل جميع المعدات الخاصة بفحص الضوء / الظلام ، مما يسمح للفئران بالتأقلم الكامل مع بيئة غرفة الاختبار.
    5. حدد الحصول على البيانات. أدخل معرفات الماوس. بدء تشغيل البروتوكول.
    6. اسحب الدرج خارج الحجرة المخففة للصوت للوصول إلى الغرفة الفاتحة/المظلمة والإدراج الداكن. التقط الماوس برفق من قاعدة الذيل ، وضعه في المنطقة الخفيفة من الغرفة ، وادفع الدرج داخل الحجرة. تأكد من أن البرنامج يكتشف الماوس على الفور ويبدأ في تسجيل النشاط.
    7. انتظر حتى يتوقف التسجيل تلقائيا بعد 30 دقيقة. أعد الماوس إلى قفصه المنزلي.
    8. قم بتنظيف الغرفة والإدراج الداكن باستخدام مناديل مبيدة للجراثيم ذات رائحة الكحول تحتوي على 55.0٪ كحول الأيزوبروبيل ، و 0.25٪ ألكيل C12-18 ثنائي ميثيل إيثيل بنزيل الأمونيوم ، و 0.25٪ ألكيل C12-18 ثنائي ميثيل بنزيل كلوريد الأمونيوم كمكونات نشطة مضادة للميكروبات للقضاء على أي إشارات شمية تركها الفأر السابق.
    9. في اليوم 4 (المعالجة المسبقة 2)، كرر الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.8.
    10. في اليوم 7 (يوم العلاج)، كرر الخطوتين 1.2.1 و1.2.4. بعد التعود ، قم بإدارة CGRP (0.1 مجم / كجم ، 10 ميكرولتر / جم بناء على وزن جسم الفأر ، الحقن داخل الصفاق (i.p)) ، إمالة رأس الماوس إلى الأمام والحقن في الربع الأيمن السفلي. أعد الماوس إلى القفص المنزلي.
    11. بعد 30 دقيقة، ابدأ تشغيل البروتوكول وقم بتشغيل الماوس في الغرفة الفاتحة/المظلمة كما هو مذكور في الخطوات من 1.2.5 إلى 1.2.7. يمكن تقصير وقت الشفاء في الأقفاص المنزلية بعد الحقن أو تطويله اعتمادا على العلاج21.
    12. قم بتنظيف الغرفة والإدراج الداكن كما هو موضح في الخطوة 1.2.8.
    13. في اليوم 10 (يوم ما بعد العلاج)، كرر الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.8. يمكن إيقاف التجربة مؤقتا عند الخطوة 1.2.13 قبل بدء فحص الحقل المفتوح.

2. فحص الحقل المفتوح

  1. إعداد الجهاز
    1. إعداد غرفة المجال المفتوح: استخدم نفس الحجرة المخففة للصوت وحجرة المجال المفتوحة المستخدمة في فحص الضوء / الظلام ، دون استخدام الإدراج الداكن.
    2. إعداد لوحة الضوء: استخدم نفس الإعداد المستخدم في فحص الضوء/الظلام. تأكد من أن شدة الضوء هي نفسها المستخدمة في فحص الضوء / الظلام.
  2. إجراء الاختبار السلوكي
    1. قم بتشغيل الجهاز. اضبط شدة الضوء على 27,000 لوكس.
    2. افتح برنامج التتبع.
    3. قم بإعداد بروتوكول جديد، وهو نفس البروتوكول المستخدم في فحص الضوء/الظلام باستثناء إعدادات المنطقة الجديدة . اختر 1 متبوعا بالمركز في إعدادات المنطقة الجديدة . اضبط المحيط على بعد 3.97 سم من المحيط والمركز على 19.05 × 19.05 سم.
    4. اعتاد الفئران على الدخول إلى غرفة الاختبار كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
    5. إدارة CGRP (0.1 ملغم / كغم ، 10 ميكرولتر / غرام بناء على وزن جسم الفأر ، i.p.) ، إمالة رأس الماوس إلى الأمام والحقن في الربع الأيمن السفلي. أعد الماوس إلى القفص المنزلي.
    6. بعد 30 دقيقة، ابدأ تشغيل البروتوكول. اسحب الدرج القابل للسحب للخارج خارج الحجرة المخففة للصوت وضع الماوس برفق في منتصف حجرة الحقل المفتوحة. ادفع الدرج داخل الحجرة.
    7. تتبع السلوك لمدة 30 دقيقة. ثم إعادة الفئران إلى أقفاصها المنزلية.
    8. قم بتنظيف الجهاز كما هو موضح في الخطوة 1.2.8.

3. فحص الضوء / الظلام المعدل للفئران البصرية الجينية

  1. إعداد الجهاز
    1. قم بإجراء تعديلين على الإدراج الداكن.
      1. عدل فتحة الإدراج الداكن إلى 5.08 × 5.08 سم (العرض × الارتفاع) باستخدام شق صغير 0.95 × 10.16 سم (عرض × ارتفاع) بين الجزء العلوي وفتحة الإدراج الداكن (الشكل 1D أعلى اليسار).
        ملاحظة: يسمح هذا التعديل للماوس بالانتقال إلى المنطقة المظلمة دون صعوبة عندما يتم توصيل قنية الألياف البصرية الموجودة على رأس الماوس بسلك التصحيح.
      2. قم بتمديد الجزء العلوي من الإدراج الداكن فوق منطقة الضوء كشرفة مثلثة الشكل (H = 6.5 سم) (الشكل 1D أعلى اليمين وأسفل اليسار). قم بقص ثقب دائري (D = 1.7 سم) من الشرفة وأدخل حاملا في الفتحة لوضع وتثبيت المفصل الدوار ، الذي يربط بين الليزر وأسلاك تصحيح الألياف البصرية (الشكل 1D أعلى اليسار وأسفل اليسار).
        ملاحظة: تؤدي التعديلات إلى تغيير طفيف في شدة الضوء التي تصل إلى أرضية المنطقة المظلمة (17 لوكس مع تعديلات مقابل 14 لوكس بدون تعديلات، تقاس في الزاوية الخلفية اليمنى من المنطقة المظلمة تحت 27000 لوكس).
    2. أدخل المفصل الدوار في الحامل الموجود على الإدراج الداكن.
    3. قم بتوصيل سلك تصحيح الألياف البصرية مقاس 30.5 سم بالمفصل الدوار. تأكد من أن المفصل الدوار يمكن أن يدور بسلاسة بحيث يمكن أن يدور سلك التصحيح دون صعوبة أثناء عبور الماوس للغرفة.
    4. بالنسبة لبقية الإعداد، استخدم نفس إعداد الجهاز كما هو مستخدم في القسم 1 (الفحص الفاتح/الداكن).
  2. إجراء الاختبار السلوكي
    ملاحظة: على عكس الفئران من النوع البري، لا تتلقى الفئران البصرية الجينية التعرض المسبق (المعالجة المسبقة 1 و 2).
    1. في يوم الاختبار، أدخل لوحة إضاءة LED في ثاني أدنى فتحة (28.23 سم من أرضية الحدبة) لإتاحة مساحة لتوصيل سلك التصحيح. قم بتشغيل جهاز فحص الضوء / الظلام واضبط شدة الضوء على 55 لوكس.
    2. استخدم نفس إعداد البروتوكول كما هو الحال في 1.2.2 و 1.2.3 باستثناء أنه تم تعيين حزم البيانات حسب المدة إلى 60 ثانية في إعداد التحليل الجديد لتكون متوافقة مع بروتوكول تحفيز الليزر في الخطوة 3.2.3.
    3. قم بتشغيل زر طاقة الليزر. اضبط وحدة التحكم في نبض الليزر للتحفيز لمدة 1 دقيقة تليها 1 دقيقة دون تحفيز أكثر من 30 دقيقة.
    4. اعتاد الفئران على الدخول إلى غرفة الاختبار مع إضاءة الضوء لمدة 1 ساعة قبل الاختبار.
    5. بدء تشغيل البروتوكول. اسحب الدرج القابل للسحب للخارج خارج الحجرة المخففة للصوت للوصول إلى الغرفة الفاتحة/المظلمة والإدراج الداكن.
    6. قم بتقييد الماوس بلطف وقم بإقران قنية الألياف البصرية على رأس الماوس بسلك تصحيح الألياف البصرية عبر غلاف التزاوج (الشكل 1D أسفل اليمين). ضع الماوس برفق في منطقة الإضاءة وادفع الدرج داخل الحجرة. تأكد من أن البروتوكول سيبدأ في تسجيل سلوك الماوس تلقائيا.
    7. في 1 دقيقة، قم بتشغيل وحدة التحكم في النبض ثم قم بتشغيل المفتاح الآمن من الفشل إلى ON. تأكد من أن التحفيز بالليزر لمنطقة الدماغ المستهدفة يحدث كل دقيقة.
    8. بعد 30 دقيقة عندما يتوقف البروتوكول تلقائيا، قم بتشغيل المفتاح الآمن من الفشل إلى إيقاف التشغيل. ثم قم بإيقاف تشغيل وحدة التحكم في النبض.
    9. افصل الماوس وسلك تصحيح الألياف البصرية. أعد الماوس إلى القفص المنزلي.
    10. قم بتنظيف الغرفة والإدراج الداكن كما هو موضح في الخطوة 1.2.8.

4. فحص المجال المفتوح المعدل للفئران البصرية الجينية

  1. إعداد الجهاز
    1. قم بتثبيت المفصل الدوار فوق الغرفة باستخدام حامل ومشبك (الشكل 1E).
    2. قم بتوصيل سلك تصحيح الألياف البصرية بطول 50 سم بالمفصل الدوار. تحقق مما إذا كان المفصل الدوار يمكن أن يدور بسلاسة.
    3. اضبط المفصل الدوار على الارتفاع المناسب على الحامل: تأكد من أن سلك تصحيح الألياف البصرية لا يمكنه الوصول إلا إلى كل ركن من أركان الغرفة ، مما سيساعد على تجنب أي تداخل مع حركة الماوس.
    4. بالنسبة لبقية الإعداد، استخدم نفس إعداد الجهاز المستخدم في القسم 1 (الفحص الفاتح/الداكن)، ولكن بدون الإدراج الداكن.
  2. إجراء الاختبار السلوكي
    1. قم بتشغيل جهاز فحص الضوء / الظلام واضبط شدة الضوء على 55 لوكس.
    2. استخدم نفس إعداد البروتوكول كما هو الحال في فحص الضوء/الظلام المعدل (القسم 3) باستثناء إعدادات المنطقة الجديدة . اختر 1 التالية حسب المركز في إعدادات المنطقة الجديدة . اضبط المحيط على بعد 3.97 سم من المحيط والمركز على 19.05 × 19.05 سم.
    3. قم بتشغيل زر طاقة الليزر. اضبط وحدة التحكم في نبض الليزر للتحفيز لمدة 1 دقيقة تليها 1 دقيقة دون تحفيز أكثر من 30 دقيقة.
    4. إجراء التعود وبقية الاختبار كما هو موضح في الخطوات من 3-2-4 إلى 3-2-10 باستثناء تغييرين على الخطوة 3-2-6: ضع الماوس برفق في منتصف الحجرة بدلا من منطقة الضوء؛ احتفظ بالدرج القابل للسحب خارج الحجرة بسبب توصيل سلك التصحيح برأس الماوس.

النتائج

تم تصميم نموذج الاختبار السلوكي هذا لاختبار السلوك المتردد للضوء. يمكن إجراؤه باستخدام كل من الفئران البرية الساذجة والفئران البصرية الجينية للتحقيق في النفور من الضوء في الوقت الفعلي أثناء تحفيز مجموعة الخلايا العصبية المستهدفة.

تم استخدام هذا الإجراء لدراسة تأثير علاج CGRP المحيطي في الفئران CD1 و C57BL/6J 10,16 والتحفيز البصري للخلايا العصبية في النوى المهادية الخلفية في الفئران C57BL/6J19 على السلوك الكاره للضوء. تم استخدام الفئران ، بما في ذلك كل من الذكور والإناث ، الذين تتراوح أعمارهم بين 10-20 أسبوعا ، في التجارب (الشكل 2A ، الشكل 2B-D ، والشكل 3). كشفت النتائج أن حقن i.p. من CGRP قلل بشكل كبير من مدة الوقت الذي تقضيه في منطقة الضوء في فحص الضوء / الظلام في الفئران CD1 (الشكل 2A) و C57BL/6J (الشكل 2B) ، لكنه لم يؤثر على الوقت الذي تقضيه الفئران في المركز في فحص المجال المفتوح في CD1 (البيانات غير المعروضة) والفئران C57BL / 6J (الشكل 2D)10 ، 16. هذا يشير إلى أن CGRP المحيطي يحفز النفور من الضوء ولكن ليس القلق العام. كما زاد العلاج باستخدام CGRP من مقدار الوقت الذي استراحت فيه الفئران في المنطقة المظلمة ولكن ليس في المنطقة الضوئية في كل من CD1 (البيانات غير معروضة) والفئران C57BL/6J (الشكل 2C).

بالنسبة للبروتوكول البصري الوراثي ، استهدفنا الخلايا العصبية المعبرة عن كالمودولين كيناز II ألفا (CaMKIIa) في نوى المهاد الخلفية عن طريق حقن AAV2-CaMKIIa-hChR2 (E123A)-eYFP أو فيروس التحكم AAV2-CaMKIIa-eYFP19. في الوقت نفسه ، تم زرع قنية الألياف البصرية في نوى المهاد الخلفية. بعد ثلاثة أسابيع من الحقن لإتاحة الوقت الكافي للتعبير عن ChR2 ، أجرينا التحفيز البصري للخلايا العصبية في نوى المهاد الخلفية ولاحظنا انخفاضا مقابلا في المدة التي تقضيها الفئران في منطقة الضوء في فحص الضوء / الظلام في الفئران المحقونة ب ChR2 مقارنة بالفئران التي يتم حقنها بالفيروس (eYFP) (الشكل 3A). لم يكن هناك فرق ملحوظ في الوقت في المركز في فحص الحقل المفتوح بين ChR2 وفئران eYFP الضابطة (الشكل 3C) ، مما يدل على استجابة متجنبة للضوء لم تكن مدفوعة فقط بالقلق 19. وعلاوة على ذلك، لوحظت أيضا زيادة في وقت الراحة في المنطقة المظلمة، ولكن ليس في المنطقة المضيئة (الشكل 3 باء). تم الحصول على نفس النتائج عند استخدام 55 لوكس و 27000 لوكس (الشكل 3). تم تضمين إجراء 55-lux لأن مرضى الصداع النصفي حساسون حتى للضوء الخافت.

figure-results-2799
الشكل 1: الجدول الزمني لفحص الضوء / الظلام والجهاز. (أ) الجدول الزمني لنموذج الاختبار: بعد تعرضين مسبقين للغرفة الفاتحة / المظلمة (قبل 1 و قبل 2) ، يتم إعطاء الفئران CGRP (0.1 mg / kg ، i.p.) متبوعة بقياس ما بعد العلاج (Post). بعد يوم واحد على الأقل من فحص الضوء / الظلام ، يتم إعطاء الفئران CGRP (0.1 mg / kg ، i.p) مرة أخرى ويتم تشغيلها في فحص الحقل المفتوح. قبل: المعالجة المسبقة; Tx: العلاج. الوظيفة: ما بعد المعالجة (B) يتم تثبيت لوحة LED في الجزء العلوي من الغرفة بواسطة رف أكريليك وتضيء منطقة الاختبار. يمكن ضبط ارتفاع لوحة الضوء باستخدام فتحات على ارتفاعات مختلفة. (ج) تحتوي الغرفة الفاتحة / المظلمة على إدراج داكن مع فتحة صغيرة. توجد لوحة إضاءة LED فوق الغرفة. (D) طرق العرض الأمامية والجانبية والعلوية للإدراج الداكن المعدل. يتم تمديد الفتحة في الإدراج الداكن بشق صغير لحركة سلك التصحيح (أعلى اليسار). يمتد الجزء العلوي من الإدراج الداكن فوق منطقة الضوء كشرفة مثلثة الشكل مع حامل للمفصل الدوار (أعلى اليمين وأسفل اليسار). يتم توصيل سلك التصحيح من الألياف البصرية بقنية الألياف البصرية عبر غلاف التزاوج (أسفل اليمين). (ه) فحص الحقل المفتوح المعدل. يحمل الحامل والمشبك المفصل الدوار. يتم سحب الغرفة إلى الجزء الأمامي من المقصورة مع ترك الأبواب مفتوحة للسماح بحرية حركة الماوس مع سلك التصحيح المتصل برأس الماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4444
الشكل 2: تثير إدارة CGRP المحيطية النفور من الضوء في الضوء الساطع في سلالتين من الفئران البرية. تم اختبار الفئران CD1 و C57 / BL6J وفقا للجدول الزمني الموضح في الشكل 1A. (أ) الوقت الذي تقضيه الفئران CD1 في منطقة الضوء لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق على مدى 30 دقيقة (27000 لوكس). يتم عرض بيانات الوقت في الضوء بمرور الوقت أثناء الاختبار (اللوحة اليسرى) وكمتوسط الوقت لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق للفئران الفردية (اللوحة اليمنى). وأجريت مقارنات بين المركبة وCGRP في كل نقطة زمنية، وبين Tx و Pre2 أو Post كما هو مبين بين قوسين. (Veh, n=19; 0.1 مغ/كغ CGRP, n=19) (B) الوقت الذي تقضيه الفئران C57BL/6J في منطقة الضوء لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق على مدى 30 دقيقة (27000 لوكس). يتم عرض بيانات الوقت في الضوء بمرور الوقت أثناء الاختبار (اللوحة اليسرى) وكمتوسط الوقت لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق للفئران الفردية (اللوحة اليمنى) (Veh ، n = 42 ؛ 0.1 mg / kg CGRP ، n = 44). (ج) تم أيضا تحليل الفئران من اللوحة B لسلوك الراحة في المناطق المظلمة والضوئية أثناء فحص الضوء / الظلام. (دال) تم اختبار الفئران من اللوحة باء لاحقا في فحص الحقل المفتوح. النسبة المئوية للوقت الذي يقضيه في وسط الغرفة لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق يزيد عن 30 دقيقة بعد العلاج بالمركبة أو CGRP (0.1 مجم / كجم ، أي p.) (Veh, n=9; 0.1 مغ/كغ CGRP, n=9). يتم عرض النسبة المئوية للوقت في بيانات المركز بمرور الوقت أثناء الاختبار (اللوحة اليسرى) وكمتوسط النسبة المئوية للوقت في المركز لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق للفئران الفردية (اللوحة اليمنى). بالنسبة لجميع اللوحات، يظهر الوسط±SEM، *p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، ****p<0.0001. تم تعديل هذا الرقم من Mason et al. 201710. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6478
الشكل 3: التحفيز البصري للخلايا العصبية المعبرة عن CaMKIIa في نوى المهاد الخلفية يحفز النفور من الضوء في كل من الضوء الخافت والساطع. (أ) النوى المهادية الخلفية للفئران C57BL/6J التي تم حقنها باستخدام ترميز AAV إما ChR2 أو eYFP (عند 55 لوكس: eYFP n = 8 ، ChR2 n = 11 ؛ عند 27000 لوكس: eYFP n = 12 ، ChR2 n = 18) تم تحفيزها بواسطة الليزر الأزرق (473 نانومتر ، 20 هرتز، عرض نبضة 5 مللي ثانية، 10 ميجاوات/مم2). تعرض اللوحة اليسرى الوقت الذي تقضيه الفئران في منطقة الضوء لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق على مدى 30 دقيقة عند 55 أو 27000 لوكس. تم إجراء مقارنات بين مجموعات eYFP و ChR2 في كل نقطة زمنية. تعرض اللوحة اليمنى متوسط الوقت لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق للفئران الفردية. (ب) تم أيضا تحليل الفئران من اللوحة A لسلوك الراحة في مناطق الضوء (اللوحة اليسرى) والظلام (اللوحة اليمنى) أثناء فحص الضوء / الظلام. (ج) تم اختبار الفئران من اللوحة ألف لاحقا في فحص الحقل المفتوح. متوسط النسبة المئوية للوقت المستغرق في وسط غرفة الحقل المفتوح لكل فاصل زمني مدته 5 دقائق على مدى 30 دقيقة (الليزر: 473 نانومتر، 20 هرتز، عرض نبضة 5 مللي ثانية، 10 ميجاوات/مم2). (eYFP n = 8 ، ChR2 n = 9). بالنسبة لجميع اللوحات، يتم عرض الوسط±SEM، *p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، ****p<0.0001. تم تعديل هذا الرقم من Sowers et al. 202019. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يستخدم فحص الضوء / الظلام على نطاق واسع لتقييم السلوك الشبيه بالقلق 12. يعتمد الفحص على النفور الفطري للفئران من الضوء ودافعها للاستكشاف عند وضعها في بيئة جديدة (منطقة الضوء). ومع ذلك ، كما نذكر هنا ، يمكن أيضا استخدام هذا الفحص لتقييم السلوك المتردد للضوء أيضا.

ومن الأهمية بمكان النظر في عدد وضرورة التعرض المسبق قبل الاختبار. هذا يعتمد على سلالة الماوس أو النموذج. على سبيل المثال ، في بروتوكول فحص الضوء / الظلام الخاص بنا ، تتعرض الفئران الساذجة من النوع البري CD1 و C57BL / 6J مسبقا للغرفة الفاتحة / المظلمة مرتين قبل الخضوع لإجراء اختبار العلاج ، في حين أن الفئران البصرية الجينية لا تخضع للتعرض المسبق. أفاد منشور حديث أن التعرض المسبق واحد يكفي لفئران CD1 لإظهار النفور من الضوء بعد إدارة i.p. CGRP 17. وبالتالي ، فإن أهمية معلمة الجدة قد تضاءلت عند وصول يوم العلاج10،16. يمكن أن تكشف التعرضات السابقة للأضواء عن الأنماط الظاهرية التي تتجنب الضوء عن طريق تقليل محرك الأقراص الاستكشافي وبالتالي تغيير التوازن بين الاستكشاف والنفور. في بعض الحالات ، لا يكون التعرض المسبق ضروريا. على سبيل المثال ، مع الفئران المعدلة وراثيا مع زيادة مستقبلات CGRP في الجهاز العصبي ، لم يكن التعرض المسبق ضروريا14. وبالمثل، مع الفئران التي تم التلاعب بها بصريا، حيث تم استهداف الخلايا العصبية المعبرة عن CaMKIIa في نوى المهاد الخلفية للتحفيز البصري، لم يكن التعرض المسبق ضروريا، على الأرجح لأن الاستجابة المترددة للضوء كانت قوية جدا عند التحفيز المباشر للدماغ19. وبالتالي ، يجب النظر بعناية في عدد وضرورة التعرض المسبق للغرفة عند استخدام سلالات أو نماذج مختلفة من الماوس. في الواقع ، قد يقلل التعرض المفرط للفئران للغرفة من السلوك الاستكشافي. سيؤدي ذلك إلى احتلال الفئران للمنطقة المظلمة بشكل تفضيلي ، بغض النظر عن العلاج ، مما يقلل من القدرة على مراقبة استجابة متجنبة للضوء. وعلى العكس من ذلك، قد يؤدي عدم كفاية التعرض المسبق للفحص إلى سلوك استكشافي يخفي سلوكا محتملا يتجنب الضوء.

يعمل التعرض بعد العلاج على تحديد ما إذا كان الفأر قد تعافى تماما من حقن CGRP الذي يتم إعطاؤه قبل 2 أيام. هذا ضروري قبل إجراء فحص المجال المفتوح أو أي فحص آخر للتأكد من عدم وجود تأثير علاجي مطول من شأنه أن يؤثر على الاختبارات السلوكية المستقبلية.

اخترنا مدة بروتوكول مدتها 30 دقيقة بناء على الملاحظات السابقة10. لقد اختبرنا الفئران في فحص الضوء / الظلام لمدة 10 دقائق 15 و 20 دقيقة 16 و 30 دقيقة 10 بشكل منفصل. قلل CGRP من مقدار الوقت الذي تقضيه الفئران في الضوء بين 0-30 دقيقة ، ولكن بعد 30 دقيقة ، فضلت الفئران الضابطة قضاء المزيد من الوقت في الظلام مقارنة ب 0-30 دقيقة ، مما أدى إلى قرار الاختبار لمدة 30 دقيقة. بطريقة مماثلة ، يمكن ضبط مدة الاختبار بالإشارة إلى منحنى الاستجابة الزمنية لنماذج الماوس المختلفة. تجدر الإشارة إلى أن إطالة وقت التعرض للغرفة الفاتحة / المظلمة قد يقلل من الدافع لاستكشاف منطقة الضوء.

قمنا بتحليل العديد من المعلمات المختلفة لتقييم سلوك الحيوان. تتمثل إحدى الميزات الأساسية لفحص الضوء / الظلام في قياس الوقت الذي يقضيه الماوس في منطقة الضوء ، مما يعكس مباشرة النفور من الضوء. يتم استخدام النسبة المئوية للوقت المستغرق في الراحة ، وعدد فواصل الحزم الرأسية (لقياس نشاط التربية) في المناطق الفاتحة أو المظلمة ، وعدد الانتقالات بين المنطقتين لتقييم الحركة. يتم تطبيع وقت الراحة وفواصل الحزم الرأسية إلى الوقت الذي يقضيه في كل منطقة من أجل تجنب الاستنتاجات الخاطئة المتعلقة بالحركة. نحن ندرج جميع الفئران في التحليلات باستثناء: الفئران التي تبقى في منطقة الضوء لمدة 30 دقيقة كاملة من الاختبار ، والفئران التي تقضي أكثر من 90٪ من الوقت في الراحة في المجموع (المناطق الفاتحة والمظلمة على حد سواء) ، والقيم المتطرفة الإحصائية (>3 SDs من المتوسط). عدد الفئران التي يتم استبعادها أقل عموما من 1٪. بالنسبة لفحص المجال المفتوح ، فإن النسبة المئوية للوقت في المركز هي المقياس الرئيسي المستخدم لتقييم السلوك الشبيه بالقلق.

في فحص الضوء / الظلام المعدل ، يمكن أن يؤدي وضع قنية الألياف البصرية في بعض مناطق الدماغ إلى تقييد حركة الماوس بشكل كبير ، وفي بعض الحالات ، يمنع الماوس من الوصول إلى المنطقة المظلمة. وبالتالي ، سيتم تعزيز الدخول إلى المنطقة المظلمة بشكل سلبي ، وبعد محاولات متعددة ، قد يظهر الماوس تفضيلا مستفادا للضوء ، حتى يبقى في منطقة الضوء خلال فترة الاختبار بأكملها. يمكن تصحيح ذلك عن طريق تعديل حجم وشكل الفتحة في الإدراج الداكن. على سبيل المثال ، عندما تم تثبيت قنية الألياف البصرية في مخيخ الفئران البرية C57BL/6J ، واجهت الفئران صعوبة في عبور فتحة الإدراج المظلم. بعد تغيير عرض الفتحة إلى 6.10 سم بدلا من 5.08 سم ، تمكنت الفئران من اجتياز الفتحة بحرية.

يتم استخدام سلك تصحيح الألياف البصرية مقاس 30.5 سم في فحص الضوء / الظلام المعدل ، بناء على حجم غرفة المجال المفتوح ، مما يسمح للماوس بالتحرك بحرية. سيمنع طول السلك الأقصر الماوس من الانتقال إلى الزوايا، بينما قد يتشابك الكابل الأطول ويعيق الحركة. يبلغ طول سلك تصحيح الألياف البصرية المستخدم في فحص الحقل المفتوح المعدل 50 سم. الطول ليس صارما كما هو الحال في الفحص الخفيف / المظلم حيث يمكن ضبط ارتفاع المفصل الدوار وفقا لطول كابل تصحيح الألياف البصرية ، مما يضمن أن الماوس قادر على الوصول إلى زوايا الغرفة.

استنادا إلى تحليلات الطاقة ، هناك حاجة إلى 10-12 فأرا لكل مجموعة لفئران CD1 و C57BL / 6J مع i.p. CGRP ، وللفئران البصرية الوراثية C57BL / 6J للكشف عن نفور كبير من الضوء. ومع ذلك، كان حجم مجموعة C57BL/6J أكبر بكثير من حجم مجموعة CD1 (الشكل 2A، B) لأن الفئران C57BL/6J لم تستجب ل CGRP في مجموعة فرعية من الاختبارات10، مما يعني أنه تم إجراء اختبارات متعددة لحساب هذا التباين العالي في السلوك المتردد للضوء في هذه الفئران. على وجه التحديد ، تم الجمع بين تجربتين لفئران CD1 وتم الجمع بين أربع تجارب لفئران C57BL/6J مع i.p. CGRP (الشكل 2A ، B) 10. سبب هذا التباين غير معروف ، لكن البشر يظهرون أيضا تباينا في استجاباتهم ل CGRP والضوء. الحقن في الوريد (i.v) من نوبات الصداع النصفي الناجمة عن CGRP في حوالي 63 ~ 75 ٪ من مرضى الصداع النصفي ، مع 70 ~ 90 ٪ من المرضى الذين أظهروا نوبات الصداع النصفي تظهر رهاب الضوء22،23،24،25. إجمالا ، فإن الفحص له تباين كبير ، بالإضافة إلى عدد الفئران ، من الضروري إجراء تجربتين على الأقل ويفضل إجراء ثلاث تجارب مستقلة تماما مع مجموعات مختلفة من الفئران.

الفراش غير مطلوب في الغرفة الفاتحة / المظلمة وليس مطلوبا من المجرب التعامل المسبق مع الفئران أو تعويدها. وكتدبير احترازي، يخدم إجراءان ما قبل التعرض غرض تأقلم الفئران مع الإشارات الشمية والفيزيائية للمجرب؛ ومع ذلك ، أظهر Ueno H. et al. أنه لا يوجد فرق في الوقت في الضوء في فحص الضوء / الظلام أو الوقت في الوسط في فحص المجال المفتوح بين الفئران بعد المناولة المتكررة والفئران بدون مناولة 26.

يمكن لفحص المجال المفتوح تقييم مساهمة القلق تجاه النمط الظاهري المضاد للضوء. هناك اختبارات أخرى متعلقة بالقلق تم التحقق منها جيدا ، مثل المتاهة الصفرية المرتفعة والمتاهة المرتفعة زائد 27 ؛ ومع ذلك ، فإن فحص المجال المفتوح هو التحكم الأكثر صلة من الناحية الإجرائية ببروتوكول الضوء / الظلام نظرا لاستخدام نفس غرفة الاختبار لكلا الاختبارين. ومع ذلك ، يمكن تعزيز تقييم القلق من خلال استخدام اختبارات متعددة أو عن طريق قياس معلمات متعددة في اختبار واحد بالنظر إلى أن القلق هو سلوك معقد ومتعدد الأوجه. الأهم من ذلك ، حتى لو لم يكن هناك نمط ظاهري للقلق في فحص المجال المفتوح ، فإن هذا لا يستبعد وجود مكون قلق في النمط الظاهري الذي ينفر من الضوء. على سبيل المثال، قد يؤدي الضوء إلى استجابة للقلق. يشير فحص المجال المفتوح فقط إلى أن القلق وحده لا يقود الاستجابة للضوء. في حين يمكن استخدام دواء مزيل للقلق ، مثل البنزوديازيبام ، في هذا الفحص ، فإن مثل هذا النهج سيكون له مضاعفات ، على سبيل المثال ، تؤثر أدوية مزيل القلق على الحركة. بدلا من ذلك ، اخترنا استخدام الأدوية السريرية المضادة للصداع النصفي ، بما في ذلك سوماتريبتان ، للتحقق من صحة الحالة الشبيهة بالصداع النصفي للنمط الظاهري المناهض للضوء. نجح سوماتريبتان في عكس النفور من الضوء الناجم عن CGRP في كل من الفئران CD1 و C57BL/6J10.

على عكس الفحص الفاتح / الداكن المعدل ، فإن الغرفة الموجودة على الدرج القابل للسحب خارج المقصورة مع أبواب حجرة مفتوحة في فحص الحقل المفتوح المعدل بسبب اتصال سلك التصحيح برأس الماوس. بدلا من 55 لوكس ، يصل ضوء الغرفة إلى أرضية الغرفة في ~ 1000 لوكس. على الرغم من اختلاف شدة الضوء ، إلا أن فحص المجال المفتوح هو اختبار مستقل عن الضوء. وبالتفصيل، أدت زيادة شدة الضوء من 55 إلى 27000 لوكس في فحص الحقل المفتوح إلى اتجاه انخفاض الوقت في المركز في الفئران C57BL/6J، مما يشير إلى أن شدة الضوء قد تؤثر على سلوك الفأر28. ومع ذلك ، فإن الفرق بين المجموعات الضابطة والتجريبية لم يكن كبيرا تحت 55 ولا 27000 lux28. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفرق في شدة الضوء بين 55 و 1000 لوكس هو أكثر دقة بكثير من ما بين 55 و 27000 لوكس. يمكن لعلم البصريات اللاسلكي أن يحل هذه المشكلة لأنه لن يكون هناك سلك تصحيح ، مما يسمح بدفع غرفة المجال المفتوح داخل الحجرة المخففة للصوت.

بالإضافة إلى ذلك ، لا يزال سلك التصحيح يحد من حركة الماوس على الرغم من اختيار الطول الأمثل. في المستقبل ، سيوفر علم البصريات اللاسلكي بديلا غير جراحي للتقنيات البصرية الوراثية القائمة على الكابلات.

تجدر الإشارة إلى أننا استخدمنا الحقن الحاد من CGRP ، والذي يكرر جزئيا فقط إصدار CGRP المطول الذي يصاحب نوبات الصداع النصفي. في حين أننا حققنا CGRP في الفئران لنمذجة الصداع النصفي بناء على فرضية أن مستويات CGRP في البلازما قد زيادت29 وأن i.v CGRP الناجم عن نوبات الصداع النصفي في مرضى الصداع النصفي22،23،24،25،30 ، فإن هذا لن يكرر الحالة في المريض حيث يتم الحفاظ على CGRP عند مستويات عالية لفترة طويلة نسبيا (تم أخذ قياسات المريض في المتوسط بعد 3 ساعات من بدء الصداع النصفي29 )، كما أنه لا يكرر الصداع النصفي المزمن حيث يتم الإبلاغ عن ارتفاع المستويات حتى بين الهجمات31. علاوة على ذلك ، لم يتم اختبار الوسطاء الآخرين الناجم عن الألم في نموذجنا.

قامت مجموعة موجيل بتعديل المتاهة المرتفعة لقياس النفور من الضوء في الفئران، مع إضاءة الأذرع المغلقة بالضوء الساطع وبقاء الأذرع المفتوحة مظلمة32. غالبا ما تم استخدام المتاهة القياسية المرتفعة بالإضافة إلى ذلك للكشف عن السلوك المرتبط بالقلق في الحيوانات. يعتمد هذا الفحص على الصراع بين الرغبة الفطرية للفأر في استكشاف بيئة جديدة ووضعه في وضع مساومة في أذرع المتاهة المفتوحة غير المحمية. في البروتوكول المعدل ، تضطر الفئران إلى الاختيار بين الأذرع المغلقة ، المضاءة بالضوء الساطع ، والأذرع المفتوحة غير المحمية ، المظلمة. يشير التفضيل إلى الأول إلى أن القلق يتغلب على النفور من الضوء بينما يشير التفضيل إلى الأخير إلى أن النفور من الضوء له الأسبقية على القلق. كما أجرت مجموعة موجيل متاهة قياسية مرتفعة لتقييم السلوك الشبيه بالقلق32. الغرض هو نفسه إجراء فحص الحقل المفتوح في بروتوكولنا. أظهرت الفئران المتحولة Cacna1a ، وهي نموذج للصداع النصفي النصفي العائلي ، رهاب الضوء عندما كانت الأذرع المغلقة مشرقة. في المقابل ، لم يتم اكتشاف السلوك الشبيه بالقلق عندما تم إجراء المتاهة القياسية المرتفعة زائد 32. في الفئران ، باستخدام كل من المتاهة المرتفعة المعدلة وفحص الضوء / الظلام ، ثبت أن النتروجليسرين (NTG) كان قادرا على تحفيز رهاب الضوء33,34 ، والذي تم إنقاذه بواسطة sumatriptan34. في إعداد المتاهة القياسية المرتفعة بالإضافة إلى المتاهة حيث يكون الضوء غائبا داخل الأذرع المغلقة ، تسبب NTG في سلوك يشبه القلق في الفئران 34 ، مما يشير إلى أن النفور من الضوء الناجم عن NTG مصحوب بالقلق. على حد علمنا ، لا توجد منشورات تستخدم فحص الضوء / الظلام والمتاهة المرتفعة المعدلة في نفس نموذج الماوس. بشكل عام ، تم إثبات كل من المتاهة المرتفعة المعدلة وفحص الضوء / الظلام المقترح في هذا البروتوكول كمقاييس فعالة للسلوك المتردد للضوء في الفئران.

نحن نستخدم لوحة LED في ضوء النهار بلون متوازن في ضوء النهار (5600K) ، مع انتشار شعاع فيضان 60 درجة ، مما لا ينتج عنه أي تظليل على ارتفاع ~ 30 سم من أرضية الغرفة إما 55 لوكس أو 27000 لوكس. استخدمت دراسات أخرى تبحث في النفور من الضوء فحص الضوء / الظلام مع تعديلات مختلفة. على سبيل المثال ، استخدمت الدراسات شدة ضوء مختلفة لمنطقة الضوء ، تتراوح من مئات إلى آلاف من lux35,36,37; استخدام الضوء بأطوال موجية مختلفة (مثل الأزرق والأصفر)38؛ أو استخدمت درجات حرارة مختلفة من الضوء (بارد ودافئ)39. يجب توخي الحذر من الحرارة التي ينتجها الضوء لأنها يمكن أن تؤثر على درجة حرارة المناطق المظلمة والضوء وتتداخل مع سلوك الفئران ، مما قد يتسبب في تفضيل منطقة معينة. إلى جانب ذلك ، من المهم أيضا استخدام الضوء بزاوية رؤية جيدة لتجنب الظل على أرضية الغرفة. شدة الضوء مهمة للاختبار أيضا. 25,000 -27,000 لوكس يعادل تقريبا ضوء النهار الساطع. من خلال إجراء فحص الضوء / الظلام في مثل هذه الكثافة العالية للضوء ، من الممكن تضخيم تأثير العلاج ؛ ومع ذلك ، من الضروري النظر في تلف الشبكية40 والتأثير السلبي لمثل هذه الكثافة العالية للضوء على استعداد الفأر للذهاب إلى الضوء. أفادت بعض الدراسات أن عيون الفئران المعرضة للضوء المباشر41 والفئران المعرضة للضوء الساطع لعدة ساعات (على سبيل المثال 30000 لوكس لمدة 4 ساعات42) تعرضت لتلف الشبكية. في فحص الضوء / الظلام ، هناك منطقة مظلمة للفأر للهروب من الضوء الساطع إذا رغب الماوس. بالإضافة إلى ذلك ، وجدت الدراسات السابقة أن الفئران في المجموعة الضابطة (الفئران C57BL / 6J) قضت فترة مماثلة من الوقت في منطقة الضوء تحت 55 و 1000 و 27000 lux28. بالنسبة لفئران CD1 ، قضت المجموعة الضابطة حوالي 1/3 من الوقت في الضوء تحت 27000 lux10 وأظهرت البيانات غير المنشورة نتائج مماثلة عند 55 لوكس. ويشير إلى أن 27000 ضوء لوكس من تلقاء نفسه لا يجعل الفئران CD1 و C57BL/6J مكروبة. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند اختيار كثافة ضوء أعلى.

إلى جانب الاختلافات في إعداد الضوء ، اختار الباحثون مجموعة متنوعة من الأساليب في تحليل بيانات الضوء / الظلام. عند تقييم النفور من الضوء ، يتم تضمين مقدار الوقت المستغرق في منطقة الضوء مع إطفاء الضوء (أو مع إضاءة الضوء الأحمر لمنطقة الضوء ، بالنظر إلى أن عيون الفئران أقل تقبلا للضوء الأحمر) في الحساب. على سبيل المثال ، تم استخدام مؤشر النفور = (الوقت في الضوء0 lux-time in lighttest lux) / الوقت في light0 lux من قبل مجموعة Gorin لتقييم النفور من الضوء43. هنا ، يتم تضمين شروط "إيقاف الضوء" أو "الضوء الأحمر" للتأكد من أن تجنب منطقة الضوء مشروط بوجود الضوء بدلا من تفضيل المكان البسيط. أجرينا هذا الإجراء باستخدام حقن i.p. من CGRP ووجدنا أن الفئران التي تتلقى CGRP لم يكن لديها مكان تفضيلي مع الضوء في منطقة الضوء ، مما يؤكد أن النفور الناجم عن CGRP يعتمد على الضوء 16. وأخيرا، استخدمت مجموعة غورين الوقت الذي تقضيه الفئران في محيط منطقة الضوء في فحص الضوء/الظلام كمقياس للقلق36. نحن نستخدم اختبارا تقليديا للقلق ، وهو فحص المجال المفتوح. بغض النظر عن طريقة التحليل التي يتم اختيارها ، تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن تجاهل مساهمة القلق في النفور من الضوء. يحاول هذا البروتوكول تقسيم السلوك الشبيه بالقلق وتجنب الضوء من خلال استخدام اختبارات الضوء / الظلام والمجال المفتوح جنبا إلى جنب.

يتناول هذا البروتوكول استخدام مقايسات المجال الفاتح / المظلم والمفتوح للكشف عن السلوك المتردد للضوء في الفئران. هذا يوفر أداة مفيدة لتحديد آليات الدوائر العصبية ومناطق الدماغ التي تقود رهاب الضوء. يمكن أن يكون نموذج الاختبار خاصا بالصداع النصفي أو يمكن توسيعه إلى اضطرابات أخرى تنطوي على رهاب الضوء. فيما يتعلق بالصداع النصفي ، قمنا باختبار اثنين من الببتيدات العصبية الأخرى المرتبطة بالتسبب في الصداع النصفي: بولي ببتيد الأدينيلات سيكلاز النخامي المنشط (PACAP) والببتيد المعوي النشط للأوعية الدموية (VIP). تم إثبات PACAP و VIP للحث على النفور من الضوء في الفئران CD1 17,21. بالإضافة إلى الصداع النصفي ، يعد رهاب الضوء أيضا أحد أعراض العديد من الاضطرابات الأخرى ، بما في ذلك بطء العين ، وإصابة العين الحادة أو الالتهاب ، ومتلازمات الدماغ الرضحية ، ومرض لايم ، والمهق ، والحثل المخروطي 36. وبالتالي ، يوفر نموذج الاختبار هذا أداة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء الاضطرابات المرتبطة برهاب الضوء. علاوة على ذلك ، فإن إقران الطرق البصرية الجينية بالنهج الدوائية التقليدية سيساعد بلا شك في تطوير علاجات جديدة للاضطرابات المرتبطة برهاب الضوء.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح من NIH NS R01 NS075599 و RF1 NS113839. لا تمثل المحتويات وجهات نظر VA أو حكومة الولايات المتحدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Activity monitorMed Assoc. IncSoftware tracking mouse behavior
Customized acrylic shelfFor adjusting the height of the LED panel
Dark box insertMed Assoc. IncENV-511
DC power supplyMed Assoc. IncSG-500T
DC regulated power supplyMed Assoc. IncSG-506
Fiber-optic cannulaDoricMFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
Germicidal disposable wipesSani-ClothSKU # Q55172
Heat SinkWakefield490-6KConnecting to LED panel
IR controller power cableMed Assoc. IncSG-520USB-1
IR USB controllerMed Assoc. IncENV-520USB
Mating sleeveDoricSLEEVE_ZR_1.25
Modified LED light panelGenaray SpectroSP-E-360DDaylight-balanced color (5600K)
Power supplyMEAN WELL USASP-320-12Connecting to LED panel
Seamless open field chamberMed Assoc. IncENV-510S
Sound-attenuating cubicleMed Assoc. IncENV-022MD-027
Stand and clamp
Three 16-beam IR arraysMed Assoc. IncENV-256

References

  1. Loder, S., Sheikh, H. U., Loder, E. The prevalence, burden, and treatment of severe, frequent, and migraine headaches in US minority populations: statistics from National Survey studies. Headache. 55 (2), 214-228 (2015).
  2. Collaborators, G. B. D. H. Global, regional, and national burden of migraine and tension-type headache, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 954-976 (2018).
  3. GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  4. international headache society. Headache classification committee of the international headache society (IHS). The international classification of headache disorders, 3rd edition. Cephalalgia. 38 (1), 1(2018).
  5. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338-350 (2018).
  6. Rapoport, A. M., McAllister, P. The headache pipeline: Excitement and uncertainty. Headache. 60 (1), 190-199 (2020).
  7. Maasumi, K., Michael, R. L., Rapoport, A. M. CGRP and Migraine: The role of blocking calcitonin gene-related peptide ligand and receptor in the management of Migraine. Drugs. 78 (9), 913-928 (2018).
  8. Caronna, E., Starling, A. J. Update on calcitonin gene-related peptide antagonism in the treatment of migraine. Neurologic Clinics. 39 (1), 1-19 (2021).
  9. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Possible sites of action of the new calcitonin gene-related peptide receptor antagonists. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 3 (6), 369-378 (2010).
  10. Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central cgrp mechanisms. Journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
  11. Russell, M. B., Rasmussen, B. K., Fenger, K., Olesen, J. Migraine without aura and migraine with aura are distinct clinical entities: A study of four hundred and eighty-four male and female migraineurs from the general population. Cephalalgia. 16 (4), 239-245 (1996).
  12. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 9 (1), 37-44 (1985).
  13. Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 13 (2), 167-170 (1980).
  14. Recober, A., et al. Role of calcitonin gene-related peptide in light-aversive behavior: implications for migraine. Journal of Neuroscience. 29 (27), 8798-8804 (2009).
  15. Recober, A., Kaiser, E. A., Kuburas, A., Russo, A. F. Induction of multiple photophobic behaviors in a transgenic mouse sensitized to CGRP. Neuropharmacology. 58 (1), 156-165 (2010).
  16. Kaiser, E. A., Kuburas, A., Recober, A., Russo, A. F. Modulation of CGRP-induced light aversion in wild-type mice by a 5-HT(1B/D) agonist. Journal of Neuroscience. 32 (44), 15439-15449 (2012).
  17. Kuburas, A., et al. PACAP induces light aversion in mice by an inheritable mechanism independent of CGRP. Journal of Neuroscience. , (2021).
  18. Russo, A. F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): a new target for migraine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 533-552 (2015).
  19. Sowers, L. P., et al. Stimulation of Posterior Thalamic Nuclei Induces Photophobic Behavior in Mice. Headache. 60 (9), 1961-1981 (2020).
  20. Afridi, S. K., et al. A positron emission tomographic study in spontaneous migraine. Archives of Neurology. 62 (8), 1270-1275 (2005).
  21. Mason, B. N., et al. Vascular actions of peripheral CGRP in migraine-like photophobia in mice. Cephalalgia. 40 (14), 1585-1604 (2020).
  22. Guo, S., Vollesen, A. L. H., Olesen, J., Ashina, M. Premonitory and nonheadache symptoms induced by CGRP and PACAP38 in patients with migraine. Pain. 157 (12), 2773-2781 (2016).
  23. Christensen, C. E., et al. Migraine induction with calcitonin gene-related peptide in patients from erenumab trials. Journal of Headache and Pain. 19 (1), 105(2018).
  24. Younis, S., et al. Investigation of distinct molecular pathways in migraine induction using calcitonin gene-related peptide and sildenafil. Cephalalgia. 39 (14), 1776-1788 (2019).
  25. Asghar, M. S., et al. Evidence for a vascular factor in migraine. Annals of Neurology. 69 (4), 635-645 (2011).
  26. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Scientific Reports. 10 (1), 3509(2020).
  27. Campos, A. C., Fogaca, M. V., Aguiar, D. C., Guimaraes, F. S. Animal models of anxiety disorders and stress. Revista Brasileira De Psiquiatria. 35, 101-111 (2013).
  28. Kuburas, A., Thompson, S., Artemyev, N. O., Kardon, R. H., Russo, A. F. Photophobia and abnormally sustained pupil responses in a mouse model of bradyopsia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (10), 6878-6885 (2014).
  29. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  30. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
  31. Cernuda-Morollon, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
  32. Chanda, M. L., et al. Behavioral evidence for photophobia and stress-related ipsilateral head pain in transgenic Cacna1a mutant mice. Pain. 154 (8), 1254-1262 (2013).
  33. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  34. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  35. Jacob, W., et al. Endocannabinoids render exploratory behaviour largely independent of the test aversiveness: Role of glutamatergic transmission. Genes, Brain, and Behavior. 8 (7), 685-698 (2009).
  36. Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
  37. Ramachandran, R., et al. Role of Toll-like receptor 4 signaling in mast cell-mediated migraine pain pathway. Molecular Pain. 15, 1744806919867842(2019).
  38. Marek, V., et al. Implication of Melanopsin and Trigeminal Neural Pathways in Blue Light Photosensitivity in vivo. Frontiers in Neuroscience. 13, 497(2019).
  39. Christensen, S. L. T., Petersen, S., Sorensen, D. B., Olesena, J., Jansen-Olesen, I. Infusion of low dose glyceryl trinitrate has no consistent effect on burrowing behavior, running wheel activity and light sensitivity in female rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 80, 43-50 (2016).
  40. De Vera Mudry, M. C., Kronenberg, S., Komatsu, S., Aguirre, G. D. Blinded by the light: retinal phototoxicity in the context of safety studies. Toxicologic Pathology. 41 (6), 813-825 (2013).
  41. White, D. A., Fritz, J. J., Hauswirth, W. W., Kaushal, S., Lewin, A. S. Increased sensitivity to light-induced damage in a mouse model of autosomal dominant retinal disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (5), 1942-1951 (2007).
  42. Song, D., et al. Retinal pre-conditioning by CD59a knockout protects against light-induced photoreceptor degeneration. PloS One. 11 (11), 0166348(2016).
  43. Matynia, A., et al. Light aversion and corneal mechanical sensitivity are altered by intrinscally photosensitive retinal ganglion cells in a mouse model of corneal surface damage. Experimental Eye Research. 137, 57-62 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved