حمل التهاب السحايا السحائي Serogroup C في الفئران عن طريق تسليم إينتراسيستيرنال

هنا ، ونحن وصف طريقه للحث علي التهاب السحايا المكورات السحائية من خلال طريق إينتراسيستيرنال من العدوى في الفئران الكبار. نقدم بروتوكول خطوه بخطوه للعدوى بالمكورات السحائية من اعداد الاصابه بالعدوى الإينتراسيستيرناله. ثم تسجيل البقاء علي قيد الحياة الحيوانية وتقييم الأحمال البكتيرية في الانسجه murine.

Neisseria النيسريه (المكورات السحائية) هي كائنات مجهريه ضيقه النطاق ، معترف بها عالميا باعتبارها السبب الرئيسي للتهاب السحايا البكتيري. المكورات السحائية هو مستعمر عابر من البلعوم الأنفي البشري من حوالي 10 ٪ من المادة الصحية. في الظروف الخاصة ، فانه يكتسب قدره الغازية لاختراق الحاجز المخاطي ويغزو مجري الدم المسببة لمرض التسمم الدموي. في الحالة الاخيره ، يمكن ان ينشا تعفن الانتان حتى بدون التطور الناتج عن التهاب السحايا. وعلي العكس من ذلك ، يمكن ان تتكاثر البكتيريا بشكل سيئ في مجري الدم ، وعبور حاجز الدماغ الدموي ، والوصول إلى الجهاز العصبي المركزي ، مما يؤدي إلى التهاب السحايا الجرثومي. نماذج murine من التهاب السحايا البكتيري تمثل أداه مفيده للتحقيق في التفاعلات بين المضيف والممرض وتحليل أليات المرضية المسؤولة عن هذا المرض المميت. علي الرغم من انه تم تقييم عده أنظمه نموذجيه تجريبية علي مدي العقود الماضية ، لم يتمكن اي منها من أعاده إنتاج الاحداث المرضية المميزة لمرض المكورات السحائية. في هذا البروتوكول التجريبي ، ونحن وصف اجراء مفصل لتحريض التهاب السحايا المكورة السحائية في نموذج الماوس علي أساس التلقيح إينتراسيستيرنال من البكتيريا. وسجلت علامات غريبه من التهاب السحايا البشري في المضيف murine من خلال تقييم المعلمات السريرية (مثل درجه الحرارة ، ووزن الجسم) ، وتقييم معدل البقاء علي قيد الحياة ، والتحليل الميكروبيولوجي والفحص النسيجي للاصابه بالمخ. عند استخدام إينتراسيستيرنال (ط. cist.) المكورات السحائية ، وتسليم كامله مباشره فيماجنا سينسينا ، مما يؤدي إلى النسخ المتماثل المكورات السحائية فعاله جدا في انسجه المخ. لوحظت زيادة 1,000 اضعاف العد القابل للحياة من البكتيريا في حوالي 18 ح. وعلاوة علي ذلك ، توجد أيضا المكورات السحائية في الطحال ، والكبد من الفئران المصابة ، مما يوحي بان الكبد قد تمثل الجهاز المستهدف للنسخ المتماثل المكورات السحائية.

Neisseria النيسريه هو غرام السلبية β-بروتينيه تقتصر علي الإنسان المضيف ، والمعروف جيدا لكونها واحده من الأسباب الأكثر شيوعا للتهاب السحايا والانتان في السكان البشرية في جميع انحاء العالم. فانه استعمار الجهاز التنفسي العلوي (الأنف والحنجرة) من ناقلات صحية وغير متناظرة (2-30 ٪ من السكان) ، ولكن البكتيريا في بعض الأحيان يفادس الدفاعات المناعية المضيف المختلفة وينتشر من مجري الدم إلى الدماغ مما تسبب في المحلية غير المنضبط التهاب ، والمعروفة باسم السحايا المكورات السحائية. مزيج من العوامل المضيفة والبكتيرية يبدو ان المساهمة في الانتقال من المعلق إلى السلوك الغازي¹.

النيسريه متخصصة حصرا في الاستعمار البشري والعدوى. لديها مجموعه ضيقه المضيف ، التالي ، قد محدوده في الدراسات التي تولد الجسم البشري بسبب عدم وجود نماذج الحيوانية المناسبة التي تتكاثر مرض المكورات السحائية الإنسان. ونتيجة لذلك ، ادي ذلك إلى ثغرات أساسيه في الفهم فيما يتعلق بالتسبب في تسمم الدم والتهاب السحايا الناجم عن المكورات السحائية. وفي العقود الاخيره ، سمح تطوير العديد من النظم المختبرية بتحديد العديد من عوامل المكورات السحائية^2،3،4. علي الرغم من ان هذه الدراسات القيمة قدمت رؤى هامه لفهم دور هذه العوامل لعدوي المكورات السحائية ناجحه ، وهذه النماذج لا تسمح بتقييم عواقب التفاعلات البكتيرية مع الخلطيه والخلوية الجهاز المناعي وحتى اقل مع الانسجه كلها. في الكائنات الحيوانية نماذج العدوى هي ذات اهميه كبيره ، وكذلك لتقييم درجه الحماية التي تمنحها تركيبات اللقاح. وبوصفها من العوامل المسببة للمرض البشري ، فان المكورات السحائية تمتلك محددات مناسبه ضرورية للعدوى الناجحة مثل الهياكل السطحية (اي النوع الرابع وبروتينات التعتيم) وأنظمه امتصاص الحديد للمستقبلات البشرية وبروتينات النقل (اي ترانسفيرين و lactoferrin)^5،6،7 للتقيد بشكل صحيح ، والبقاء علي قيد الحياة وغزو المضيف البشري. وأخيرا ، فان قدرات التباين الجيني للمرض للتهرب و/أو منع الاستجابة المناعية البشرية تساهم بشكل أكبر في الأنواع العالية من تروسم^8،9. ولذلك ، فان عدم وجود عوامل مضيفه محدده ، تشارك في التفاعل ، يمكن ان يعرقل خطوات دوره حياه الممرض ، مما ينشئ صعوبات كبيره في تطوير نماذج حيوانيه صغيره تلخص دوره حياه المكورات السحائية.

علي مدي العقود الماضية ، تم تطوير العديد من النهج لتحسين فهمنا للدورة المعدية المكورات السحائية. وقد وضعت التهابات نموذجين الحيوانية والماوس والفئران ، اما داخل الصفاق (i.p.) أو الإنترانت (ا) ، لإنتاج مرض المكورات السحائية^{10،11،12،13،14 ،15،16،17}. الماوس المختبر هو علي الأرجح واحده من أكثر تنوعا الحيوانية للحث علي العدوى المكورة السحائية التجريبية.

ومع ذلك ، فان الطريقة الi.p.ه للعدوى تؤدي إلى تطور الانتان الحاد علي الرغم من انه لا يحاكي الطريق الطبيعي للعدوى ، في حين ان الطريق الا للعدوى كان مفيدا لتقييم الاصابه بالتهاب المكورات السحائية ، علي الرغم من انه قد يسبب عدوي الرئة قبل الانتان^{10،11،12،13،14،15،16،17}.

وكان نموذج الماوس i.p. مفيده لتقييم الحماية من المكورات السحائية التحدي^10،11،12. وقد تم تطوير نموذج الماوس للاستعمار المكورات السحائية علي أساس المسار الا للعدوى مع الفئران الرضع ، لأنها أكثر عرضه للاصابه بالمكورات السحائية ، لأعاده إنتاج عدوي الغازية محاكاة مسار مرض المكورات السحائية في البشر ^{13،14،15،16،17}. وعلاوة علي ذلك ، لتعزيز تكرار المكورات السحائية في المضيف murine ، تم أيضا تطبيق عدد متزايد من الاستراتيجيات التقنية بما في ذلك أداره الحديد للحيوانات لتحسين العدوى ، واستخدام البكتيريا البكتيرية عاليه ، الماوس-المرور البكتيرية سلاله وكذلك توظيف الرضع أو المناعية الحيوانية يستضيف^{10،13،15،18،19}. التعبير عن العوامل البشرية المحددة مثل CD46²⁰ أو ترانسفيرين²¹ قد زاد من قابليه الفئران لهذه البكتيريا البشرية المدارية ؛ وقد كان العمل من نموذج الجلد الإنسان طعم الغيروي العدوى مفيده أيضا لتقييم قدره التصاق المكورات السحائية إلى الإنسان بطانة^22,23. وبشكل جماعي ، ادي التطور الأخير في الفئران المحورة وراثيا إلى تحسين فهم تولد التهاب السحائي وتفاعلاته المضيفة.

في السابق ، وضعنا نموذج murine من التهاب السحايا المكورات السحائية حيث تم اجراء تلقيح البكتيريا في ماجنا السينية من الفئران الكبار مع الماوس-البكتيريا التي تمر بالفار²⁴. المعلمات السريرية ومعدل البقاء علي قيد الحياة من الفئران المصابة أظهرت إنشاء التهاب السحايا مع خصائص مماثله لتلك التي ينظر اليها في المضيف البشري ، فضلا عن التحليلات الميكروبيولوجية والنسيجية للدماغ. من هذه الفئران المصابة, وكانت البكتيريا, أيضا, تعافي من الدم, الكبد, والطحال, والأحمال البكتيرية من الاجهزه الطرفية ترتبط مع الجرعة المعدية. وعلي وجه الخصوص ، استخدم هذا النموذج لتقييم ضراوة سلاله متحولة ايزوتون معيبه في الناقل L-الغلوتامات GltT²⁴. في الاونه الاخيره ، وذلك باستخدام نموذج الماوس لدينا من التهاب السحايا المكورات السحائية علي أساس ط. cist. الطريق مع زمره C سلاله 93/4286^2،24 ومتحولة ايزوتون معيبه في ترميز الجينات شامل في اطار ل UDP-N-اسيتيل 2-epimerase²⁵، لقد حللنا دور حمض السياليك المكشوفة في إنشاء من المرض في الفئران.

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه واضحة للحث علي التهاب السحايا المكورة السحائية التجريبية علي أساس i. cist. طريق العدوى في الفئران الكبار Balb/c. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص لتوصيف عدوي المكورات السحائية في المضيف murine ، وكذلك لتقييم ضراوة بين سلالات النوع البرية المرجعية والمسوخ المتحولة. ويضمن المسار الداخلي للعدوى الولادة الكاملة لمكورات السحايا مباشره في ماجنا ، والتي بدورها تسهل النسخ البكتيري في السائل النخاعي (الدماغي الشوكي) ويحفز التهاب السحايا مع الميزات التي تحاكي تلك حاضره في أناس^2,24,25,26.

وقد اجري هذا البروتوكول للتقليل من المعاناة الحيوانية وتقليل عدد الفئران وفقا للتوجيه الصادر عن مجلس الجماعات الاوروبيه في 24 تشرين الثاني/نوفمبر 1986 (86/609/EEC). في المجري التجارب المذكورة في هذه الدراسة تمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الاخلاقيه لرعاية الحيوانية والاستخدام (Prot. عدد 2, 14 ديسمبر 2012) ووزارة الصحة الايطاليه (Prot. عدد 0000094/01/2013). وينبغي تنفيذ جميع الإجراءات داخل مجلس السلامة الاحيائيه 2 (BSC2) في غرفه BSL2 ، وينبغي التخلص من النفايات المحتملة المصابة في حاويات مخصصه.

1. عدوي الفئران مع النيسريه serogroup ج سلاله

تحذير: النيسريه هو من المحتمل ان يكون الممرض الضارة ويجب اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع هذه الكائنات المجهرية. يتطلب التجريب بأكمله احتواء مستوي السلامة البيولوجية 2 (BSL2). يجب علي الباحث المشارك في الدراسات الحيوانية ارتداء معدات الوقاية الشخصية القابلة للتصرف لمده التجربة.

1. اعداد البكتيريا لدراسات العدوى المجرية
   1. اختيار مستعمره واحده من الثقافة النيسريه Neisseria الطازجة علي GC (المكورات العقديه) لوحه أجار تستكمل مع 1 ٪ (المجلد/المجلد) Polyvitox الملحق وتطعيم في 10 مل من مرق GC.
   2. تنمو البكتيريا في 37 درجه مئوية في حاضنه المداري شاكر مع سرعه 220 دوره في الدقيقة. الحفاظ علي التحقق من متعاطي الثقافة مع مقياس طيفي. تنمو الثقافة حتى المرحلة الاسيه المبكرة في كثافة بصريه OD_600nm من 0.7 ، المقابلة ل ≈ 7 × 10⁸ كفو/مل.
   3. بمجرد الحصول علي متعاطي المطلوبة ، وجعل الأسهم المجمدة عن طريق أضافه 10 ٪ الجلسرين. الاستغناء عن 1 مل من الثقافة في التخزن. تخزين قوارير في-80 درجه مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظه: علي الرغم من انه من الأفضل استخدام الثقافة البكتيرية الطازجة ، واستخدمت المخزونات المجمدة لتبسيط وتوحيد التجربة في الجسم المجري. وعاده ما تستخدم المخزونات المجمدة في غضون 6 أشهر تقريبا من الاعداد.
   4. قبل العدوى ، وذوبان البكتيريا المجمدة في درجه حرارة الغرفة.
   5. حصاد الخلايا البكتيرية عن طريق طرد لمده 15 دقيقه في 1,500 x g وأعاده التعليق في 1 مل من مرق GC الطازجة التي تحتوي علي الحديد ديكديتان (5 مغ/كغ).
      ملاحظه: يتم اعداد مرق GC مع أضافه الحديد ديكدكتان (5 مغ/كغ) من أجل صالح النسخ المتماثل من المكورات السحائية في الانسجه المضيف^14,18,27.
   6. قبل استخدام, تنفيذ التهم القابلة للحياة من البكتيريا لتحديد العدد الدقيق لل CFU للعدوى. للقيام بذلك ، والتقاط 10 μL من تعليق البكتيرية والمضي قدما مع التخفيفات التسلسلية ونشر كل تمييع علي لوحات أجار GC واحتضان في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO₂، ل 18-24 h.
2. الحقن داخل السيسينال من الفئران
   ملاحظه:يتم تنفيذ الاجراء بأكمله في مجلس الوزراء تدفق الرقائقي للحفاظ علي ظروف العقيم.
   1. منزل الفئران المختبر (8 الأسبوع ، الإناث Balb/c) تحت ظروف محدده خاليه من العوامل المسببة للمرض. توفير الكريات الغذائية والمياه الاعلانيه libitum.
   2. تسويه الكائنات في البيئة الجديدة لمده أسبوع واحد قبل بدء التجربة.
   3. قبل بدء التجربة ، وزن وتقييم درجه حرارة الجسم.
      ملاحظه: وتزن الفئران الإناث بالنسبة للإناث البالغة من العمر ثمانيه أسابيع في المتوسط حوالي 19 غراما. متوسط درجه الحرارة من الفئران مختبر فسيولوجيا تتراوح من 36-38 درجه مئوية²⁴.
   4. التوفف الحيوانية من الرقبة ، وتنظيف منطقه البطن مع الايثانول 70 ٪ وحقن i.p. الحديد ديديكستان (المذاب في 1 ٪ العازلة المالحة الفوسفات ، 250 مغ/كغ) في الربع الأيمن السفلي من البطن murine باستخدام 25 G ابره 0.5 مم x 16 مم ، حوالي 2-3 ساعة قبل الاصابه.
      ملاحظه: تم اجراء الحقن داخل الربع الأيمن السفلي من البطن المريد لتجنب تلف أعضاء البطن مثل المثانة البولية ، الأعور ، الخ. يفضل الاداره من [ايرون سورس] خارجيه, في الشكل من حديد [ددكسن], إلى الماشية قبل التلوث الضرب جرثوميه في المضيفة^14,18,27.
   5. بعد 2-3 h ، اجراء التخدير الحيواني مع الكيتامين (50 مغ/كغ) و اكسيليازين (3 ملغ/كغ) وزيوت التشحيم العيون.
   6. التحقق من عمق التخدير عن طريق ضمان عدم وجود استجابه الم عند معسر اصبع القدم.
   7. وضع الماوس في استلقاء القصيه وتمتد بعناية الأطراف والعمود الفقري العنقي للحفاظ علي الاعمده الفقرية في موقف مستقيم.
   8. تخلط برفق التعليق البكتيري للحفاظ علي تعليق ثابت قبل تحميل حقنه من 30 G ابره x 8 ملم.
      ملاحظه: اعداد تعليق البكتيرية أقرب ما يمكن إلى وقت الحقن. وفي الوقت نفسه ، تخزينه في درجه حرارة الغرفة.
   9. استنادا إلى آخر ذوبان البكتيريا عيار (كفو/مل) ، والمضي قدما في حساب إجمالي كفو لاستخدامها ، فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للحيوانات للاصابه (cfu الجرعة البكتيرية لكل عدد من الماشية). المضي قدما في حساب حجم الدقيق الذي سيؤخذ من القارورة للحصول علي مجموع cfu تطبيق نسبه بين الذوبان البكتيرية آخر (cfu/مل) ومجموع cfu مفيده للعدوى ن الفئران (بعد ذوبان البكتيريا عيار cfu : مل = إجمالي كفو: x). وضع المجلد النهائي فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للحيوانات المصابة.
      ملاحظه: في هذه التجارب ، تم استخدام مجموعه واسعه من عيار من 10⁴ إلى 10⁹ لكل الحيوانية.
   10. نظفت المنطقة جراحيه مع 70% ايثانول.
   11. تحديد نقطه الحقن مع مساعده من ابره وحقن CFU الراسخة من المكورات السحائية (سلاله نوع البرية وسلاله متحولة ايزوتون) ، أو المرق GC تستكمل مع الحديد ديكستان (5 مغ/كغ) كعنصر تحكم ، في حجم إجمالي من 10 μL في ماجنا الفئران من خلال ثقب لدغ القذالي باستخدام 30 G ابره x 8 ملم.
       1. قم باجراء الحقن السيسينال عن طريق وضع الابره عند تقاطع الجمجمة ، وتحديدا في الفضاء تحت العنكبوتية الظهرية. Ventroflex الراس لجعل هذه المساحة يمكن الوصول اليها²⁸.
       2. لفتره وجيزة ، ووضع الحيوانية في الركود الجانبي ، وعقد أذان للخروج من الطريق والمرن الرقبة باعتدال (90 إلى 100 درجه). تاكد من ان خط منتصف الرقبة والراس (من الأنف إلى القذبوت) في وضع مواز تماما إلى الطاولة.
       3. المس اجنحه الأطلس وتاكد من انها تتداخل ، والقضاء علي دوران محوري. وعاده ما يمكن لمس المسافة البادئة الطبيعية علي خط الوسط حيث الابره هي الأكثر احتمالا لدخول ثقب القذالي.
       4. تخلص من الحقنه والابره بأمان بعد حقن الفئران مع النييسريه.
   12. وضع الحيوانية في القفص وانتظر الصحوة والانتعاش الكامل للحركة.
   13. الحفاظ علي أقفاص مع الفئران المصابة تحت مجلس الوزراء تدفق الرقائقي.
   14. رصد الفئران ، 24 ساعة بعد العدوى ، لعلامات السريرية من الغيبوبة وفقا لمقياس غيبوبة²⁹. مقياس غيبوبة: 1 = غيبوبة ، 2 = لا يقف تستقيم بعد ان تحولت علي ظهره ، 3 = يقف تستقيم في غضون 30 ثانيه ، 4 = يقف تستقيم في غضون 5 ثانيه ، الحد الأدنى من الانشطه الاسعافيه ، 5 = العادي.
        ملاحظه: عندما كان في الحيوانية وسجلت الم ، تسكين مع ميلوكسيكام (5 مغ/كغ i.p. لمده الدراسة) كان يدار.
   15. المضي قدما للبقاء علي قيد الحياة الحيوانية أو كفو التهم المقايسة علي الماشية المصابة كما هو مفصل في الخطوة 2.
   16. أداء القتل الرحيم من الفئران مع درجه من 2 عن طريق خلع عنق الرحم وسجل كميت للتحليل الإحصائي.

2. بقاء الحيوانية والتهم كفو

1. بقاء الحيوانية
   1. اعداد التطعيم البكتيرية في جرعات مختلفه (تتراوح بين 10⁴ إلى 10⁹ كفو لكل ماوس) لتصيب الماشية من قبل i. cist. الطريق (انظر الخطوة 1.2).
   2. تطعيم الفئران التحكم مع مرق GC ، تستكمل مع الحديد ديكدكتان (5 مغ/كغ) ، بنفس الطريقة.
   3. رصد الحيوانية للاعراض السريرية: الفراء تكدرت ، مظهر منحني ، انخفاض حرارة الجسم ، وفقدان الوزن ، والخمول ، أو موريبوند^{24،25،26،30}، كل يوم في جميع انحاء التجربة بأكملها ل 168 h (7 أيام) علي الأقل مرتين في اليوم لمده التجربة.
   4. قياس وزن الجسم ودرجه الحرارة باستخدام التوازن الرقمي وترمومتر المستقيم ، كل يوم علي التوالي.
   5. سجل بقاء الفئران لمده أسبوع.
      ملاحظه: تسجيل الوفاة الطبيعية للعدوى بعد الحيوانية في حين ان الكائنات التي تصل إلى قيمه غيبوبة من 2 أو ان البقاء علي قيد الحياة أكثر من 168 h من الملاحظة سيتم رحيم.
   6. تخدير الفئران مع قيمه غيبوبة من 2 أو ان البقاء علي قيد الحياة علي مدي وقت الملاحظة مع الكيتامين (50 ملغ/كغ) و اكسيليازين (3 مغ/كغ) وتطبيق مرهم العيون.
   7. تحقق من ان استجابه الم غائبه عن طريق قرصه اصبع القدم.
   8. أداء القتل الرحيم من الفئران عن طريق خلع عنق الرحم وسجل كميت للتحليل الإحصائي.
2. تقييم وحدات تشكيل مستعمره (كفو) التهم في الاجهزه الطرفية
   1. استخدام جرعه بكتيرية شبه مميته (5 × 10⁵كفو/الفئران) علي أساس نتائج بقاء الحيوانية لتطعيم الماشية من قبل i. cist. طريق (انظر القسم الفرعي 1.2).
   2. مراقبه درجه حرارة المستقيم كل يوم خلال العدوى واجراء التخدير من الحيوانية في 48 h بعد العدوى كما هو مذكور في الخطوة 2.
   3. المضي قدما في تطهير الايثانول 70 ٪ من الصدر وسحب 600-700 μL من الدم عن طريق ثقب القلب من تجويف الصدر باستخدام 25 G ابره 0.5 مم × 16 ملم.
   4. جمع الدم في أنبوب يحتوي علي 3.8 ٪ سيترات الصوديوم وتخزين في-80 درجه مئوية لحساب الخلايا البكتيرية في وقت لاحق قابله للحياة.
   5. أداء خلع عنق الرحم للتضحية الحيوانية. تاكيد الوفاة تسجيل عدم وجود نبضات القلب ، بعد التضحية بالماوس وفقا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والاخلاقيه ذات الصلة.
   6. وضع الماوس في موقف ضعيف واستخدام مقص وملقط للمضي قدما في قطع من الفراء علي طول الطائرة السهمي من الجسم. إصلاح الجلد مع الفراء علي جانبي الجسم مع دبابيس.
   7. قطع الغشاء الصفاقي باستخدام مقص حاد. استخدام مقص وملقط المتاح لإنتاج الاجهزه (علي سبيل المثال ، الطحال والكبد) ووضع كل واحد في طبق بيتري العقيمة مع 1 مل من مرق GC تستكمل مع 10 ٪ (المجلد/المجلد) الجلسرين.
   8. التخلص بأمان الجسم الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC.
   9. تجانس الأعضاء ميكانيكيا في درجه حرارة الغرفة مع المكبس من حقنه 5 مل لمده 2-3 دقيقه تقريبا حتى يتم تشكيل تعليق خليه واحده ونقله في أنبوب.
   10. وضع أنبوب مع عينه الانسجه المتجانسة علي الفور علي الجليد الجاف.
       ملاحظه: يمكن تخزين عينات في-80 درجه مئوية في أنبوب معقم 2 مل لأداء الخلايا البكتيرية قابله للحياة التقييم في النقاط اللاحقة.
   11. جعل لوحات أجار GC مع المضادات الحيوية عند الحاجة. تجفيف لوحات قبل الاستخدام قبل احتضان في 37 درجه مئوية ل 2-3 h.
   12. اعداد المخففات التسلسلية 10 اضعاف من العينات في مرق GC من كل الانسجه المتجانسة ولوحه علي لوحات أجار GC. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO₂.

3. اعداد انسجه المخ لعدد كفو

1. استخدام جرعه بكتيرية شبه مميته (5 × 10⁵ كفو/الفئران) علي أساس نتائج بقاء الحيوانية لتطعيم الماشية من قبل i. cist. طريق (انظر القسم الفرعي 1.2).
2. اجراء التخدير من الحيوانية في الوقت المحدد العدوى كما هو مذكور في الخطوة 2.
3. أداء القتل الرحيم للحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم.
4. نظفت المنطقة جراحيه مع 70% ايثانول.
5. قطع راس الماوس باستخدام مقص كبير.
6. Resect الفراء والجلد مع مساعده من مقص الجراحية الصغيرة وغرامه ملقط الصلب يميل ، والمضي قدما نحو الأعلى من الجمجمة لتكون قادره علي رؤية بوضوح الغرز وتوجيه افتتاح جمجمة.
7. ادراج غيض من مقص صغير من خلال ماغنوم الفوران لفتح الجمجمة.
8. تقطع نحو مركز الجمجمة وعبر الخط الأوسط من العظم الجداري إلى الجانب الآخر من الجمجمة. تقطع برفق علي طول الحافة الجانبية للخياطة الأفاريز.
9. رفع الجمجمة بدءا من الزاوية الجدارية الخلفية وسحبها قطريا إلى الأعلى لاكتشاف الدماغ ، وذلك باستخدام ملقط يميل غرامه.
10. تاكد من ان انسجه المخ ليست مرتبطة بأي عظم في الراس ، عندما يتم رفع الجمجمة.
11. استخدام ملقط المتاح لأزاله اي النسيج الضام بين الجمجمة والدماغ ، لضمان ان يتم أزاله انسجه المخ جنبا إلى جنب مع الجمجمة.
12. لا تسمح انسجه المخ تجف كثيرا. وضع الدماغ ، وذلك باستخدام ملقط المتاح ، في طبق بيتري مع 1 مل من مرق GC تستكمل مع 10 ٪ (المجلد/المجلد) الجلسرين.
13. تجانس الدماغ ميكانيكيا مع المكبس من حقنه 5 مل (انظر الخطوة 2.2.9). نقل العينات إلى أنبوب معقم 2 مل وتخزين-80 درجه مئوية لتقييم الخلايا البكتيرية القابلة للاستمرار في وقت لاحق كما نوقش في الخطوة 2.2.

بقاء الفئران المصابة النيسريه نوع البرية وسلالات متحولة ايزوتون.
و neisseria النيسريه سلالات المستخدمة في هذه النتائج التمثيلية هي زمره C مرجع سلاله 93/4286 (ET-37) ومتحولة ايزوتون 93/4286ωشامل في اطار التي تم الحصول عليها عن طريق التنشيط التنظيمي لجين شامل في اطار ، والترميز و UDP-N-اسيتيل الجلوكوزامين 2-epimerase ، ان الخرائط في التجميع كبسوله²⁵. لتقييم درجه ضراوة من سلاله شامل في اطارالمعيبة في نموذج murine الحالي ، تم تقييم الجرعة المميتة قادره علي تحديد وفاه 50 ٪ من الحيوانية المصابة (LD₅₀). لهذا الغرض تم أصابه ثلاث مجموعات من الحيوانية داخل الداخل مع جرعات تتراوح بين 10⁴ إلى 10⁶ كفو من سلاله نوع البرية 93/4286 ومع جرعات سلاله متحولة 93/4286ωشامل في اطار بين 10⁷ إلى 10⁹ كفو . عموما ، حدث انخفاض في المعلمات السريرية (علي سبيل المثال ، وزن الجسم ودرجه الحرارة) وزيادة معدل الوفاات خلال الأول 72 ح بعد الاصابه. و LD₅₀ لسلاله نوع البرية تناظر التحدي المكورات السحائية من 10⁴ كفو ، في حين ان معدل الوفاات مع جرعه 10⁵ كفو كان يساوي 83.4 ٪ ومع 10⁶ كفو من 100 ٪ (الشكل 1a). علي العكس من ذلك ، للحصول علي LD₅₀ لسلاله متحولة 93/4286Ωشامل في اطار، فقد كان من الضروري جرعه من 10⁸ كفو (الشكل 1b) ، وهو مبلغ من 10,000 طيات اعلي بالمقارنة مع سلاله نوع البرية.

تقييم النيسريه القابلة للحياة CFU في انسجه المخ الماوس.
لمتابعه حركيه العدوى في انسجه المخ من الحيوانية المصابة ، تم اجراء فحص الدورة الزمنيه مع نوع البرية أو سلاله شامل في اطار متحولة²⁵. بعد الأول. حقن مع 5x10⁵ كفو من 93/4286 أو 93/4286Ωشامل في اطار سلالات ، كان هناك زيادة سريعة من البكتيريا نوع البرية في انسجه المخ الوصول إلى اعلي الأرقام في حوالي 24 ساعة بعد الاصابه (الشكل 2a) ؛ علي العكس من ذلك في الدماغ من الفئران تحدي مع متحولة شامل في اطارالمعيبة ، انخفضت التهم القابلة للاستمرار تدريجيا مع مرور الوقت حتى إلى 2.026 سجل كفو ± 1.774 72 h آخر العدوى (الشكل 2a). وقد أظهرت التجربة ان 33.3 ٪ من الفئران متحولة التحدي أظهرت أزاله البكتيرية من موقع العدوى ، في حين ان العدوى مع سلاله نوع البرية لم يتم القضاء عليها من دماغ الماشية.

تقييم حموله المكورات السحائية في الطحال والكبد 48h بعد التحدي.
وقد أجريت هذه التجربة لتقييم أزاله البكتيريا من الفئران المصابة 48 h بعد التحدي في الاجهزه الطرفية. لهذا الهدف ، تم أصابه مجموعتين من الفئران مع 5 × 10⁵ كفو من اما 93/4286 أو 93/4286Ωشامل في اطار سلالات ، وتم تقييم التهم البكتيرية قابله للحياة في الطحال والكبد من الفئران المصابة²⁵ (الشكل 2b). بعد 48 h من حقن المكورات السحائية ، تم مسح متحولة شامل في اطار-معيبه تماما في الطحال والكبد ، في حين ان الكائنات المصابة بسلاله نوع البرية عرضت اطار العدوى الجهازية المستمر. القيم المتوسطة لل CFU بعد 48 h كانت في الواقع لا تزال 3.212 سجل CFU ± 3.354 و 6.949 سجل كفو ± 1.37 في الطحال والكبد ، علي التوالي. كان الفرق في الأحمال البكتيرية في انسجه الكبد من مجموعتين الحيوانية ذات دلاله احصائيه (مع P < 0.001).

الشكل 1: بقاء الفئران المصابة 93/4286 نوع البرية أو شامل في اطار-معيبه النيسريه سلالات. (ا) أصيبت ثلاث مجموعات من الفئران البلب/c (ن = 6/الجرعة) ط. cist. مع 10⁴، 10⁵، و 10⁶ كفو/الماوس من سلاله نوع البرية 93/4286 و (ب) مع 10⁷، 10⁸، و 10⁹ كفو/الماوس من متحولة شامل في اطار-معيبه. ورصدت الفئران لمده أسبوع ، وسجلت البقاء علي قيد الحياة. يتم التعبير عن النتائج والبقاء علي قيد الحياة في المئة علي جرعات مختلفه مع مرور الوقت ، وسجل القيمة p الرتبة < 0.05 للفئران المصابة سلاله نوع البرية. وقد تم تعديل هذا الرقم من Colicchio وآخرون²⁵. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تقييم الأحمال البكتيرية مع مرور الوقت في الفئران الملقحة مع 93/4286 أو 93/4286Ωشامل في اطار سلالات. (ا) الدورة الزمنيه من الأحمال البكتيرية في انسجه المخ التالية لل cist. العدوي. تم أصابه مجموعتين من الفئران Balb/c (ن = 20/المجموعة) من قبل cist. الطريق مع 5 × 10⁵ كفو من اي سلاله نوع البرية 93/4286 أو شامل في اطار-متحولة المعيبة. تم التضحية الحيوانية 4 ، 24 ، 48 ، و 72 h بعد العدوى. تم حصاد الادمغه ، متجانسة ميكانيكيا في GC المتوسطة ، وتم تحديد التهم القابلة للاستمرار. يتم التعبير عن النتائج كما يعني السجل ± SD من أرقام كفو لكل جهاز في نقاط زمنيه مختلفه بعد التلقيح. تشير العلامات النجميه إلى اهميه احصائيه (* * ، P < 0.01). (ب) الأحمال البكتيرية مع مرور الوقت في الطحال والكبد. تم أصابه مجموعتين من الفئران Balb/c (ن = 5/المجموعة) ط. cist. مع 5 × 10⁵ كفو من اي سلاله نوع البرية 93/4286 أو شامل في اطار-متحولة المعيبة. وكانت الرحيم الحيوانية 48 h بعد العدوى. تم حصاد طحال والكبد ، متجانس ميكانيكيا ، وتم تحديد التهم القابلة للاستمرار. يتم التعبير عن النتائج كارقام سجل كفو لكل عضو. القضبان الافقيه تشير إلى جذوع البكتيريا المتوسطة. تشير العلامات النجميه إلى اهميه احصائيه (* * * ، P < 0.001). وقد تم تعديل هذا الرقم من Colicchio وآخرون²⁵. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

في هذه الدراسة ، ونحن وصف بروتوكول تجريبي للحث علي التهاب السحايا المكورات السحائية في الفئران الكبار من قبل i. cist. تلقيح بكتيريا المكورات السحائية. علي حد علمنا ، لم يتم تطوير اي نموذج آخر من التهاب السحايا المكورات السحائية في الفئران المختبرات المصابة بواسطة i. cist. طريق في الماضي ، وقد تم استكشاف هذه الطريقة لتوفير نماذج من التهاب السحايا المكورة السحائية في كل من الفئران³¹ والأرنب³². ومن المعروف جيدا ان اعلي معدل لمرض المكورات السحائية يوجد بين الأطفال الصغار والمراهقين والبالغين الشباب^33،34،35؛ لهذا السبب ، في نموذج الماوس لدينا التهاب السحايا ، بدلا من التركيز علي الأطفال حديثي الولادة أو الرضع ، تم توظيف 8 الحيوانية العمر الأسبوع المناعية.

في نموذجنا التجريبي ، قررنا استخدام i. cist. لأنه يضمن الإفراج عن المكورات السحائية مباشره في ماجنا نا لذلك تسهيل النسخ المتماثل البكتيرية في السائل الدماغي الشوكي. هذا الطريق من التلقيح من الناحية الفسيولوجية يمكن الوصول اليها أكثر²⁸ واقل صدمه من الطريق تحت العنكبوتية داخل الجمجمة, تستخدم بالفعل لتطوير التهاب السحايا بسبب العقديه spp. ^36,37. علي الرغم من انه لا يمثل الطريقة الطبيعية للاصابه بالمكورات السحائية ، فان حقن البكتيريا في هذه المنطقة كان مفيدا لتحريض التهاب السحايا المكورة السحائية ، كما هو مبين من خلال بقاء الماوس ، والأحمال البكتيريا ، والمعلمات السريرية ، وأيضا عن طريق تحليل نسيجي^24,25,26. ومن المثير للاهتمام ، السلالة المرجعية 93/4286 التهاب السحايا المستحث مع ميزات المحاكاة التي لوحظت في الامراض البشرية^24،25،26.

لإنشاء عدوي موحده murine وضمان سلامه الباحثين ، كان يفضل ان تبدا من المخزون المجمدة معاير من البكتيريا بدلا من نمو بكتيرية جديده^{24،25،30، 38}، علاوة علي ذلك ، قررنا استخدام جرعه شبه مميته من المكورات السحائية الحية بهدف الحد من النتائج المميتة السريعة والسماح بتطور تلف المخ^{2،24،25،26}. ومع ذلك ، لتحديد الجرعة المعدية المناسبة لسلالات مختلفه ، يجب اجراء التجارب الاوليه. في هذه الدراسة ، اختبرنا a زمره C سلاله مرجع 93/4286 وسلاله متحولة ايزوتون 93/4286ωشامل في اطار مع جرعه من 5 × 10⁵ كفو/الفئران.

علي الرغم من ان هذا النموذج لا يحاكي المراحل الاوليه من الاستعمار وغزو المكورات السحائية ، فان العزلة البكتيرية تنمو بشكل جيد ليس فقط في السائل الدماغي الشوكي ، ولكنها أيضا قادره علي البقاء في مقصورات الطحال والكبد. خلال مرحله نقص المناعة من العدوى المتسلسلة ، يبقي معظم الحديد المشتق من الورم الدموي ممزوجا مع ألفيتين الكبدي. كما فيريتين يمكن استخدام المكورات السحائية للحصول علي الحديد³⁹، الكبد يشكل الجهاز المستهدف للنسخ المتماثل البكتيرية.

وفي هذا الاجراء التجريبي ، استخدمت سلاله الماوس الفطرية/c في استبدال سلاله القرص المضغوط-1 التي كانت تستخدم أصلا لتطوير نموذج التهاب السحايا السحائي²⁴. واتسمت الفئران التي تولدت بالتفوق بتباين جيني واسع قد يكون أكثر ملاءمة للكشف عن عده اثار في مجموعهمتغيرة مثل السكان^{البشريين 40 ،41}. ومع ذلك ، فان هذا التباين يحتاج إلى حجم عينه اعلي للحصول علي اهميه احصائيه كافيه وقد يتداخل مع توحيد الإجراءات والدراسات المستهدفة.

علي الرغم من المجموعة المضيفة الضيقة من المكورات السحائية ، لضمان تكرار البكتيريا في المضيف murine وتعزيز ضراوة المكورات السحائية ، وتدار الحديد ديكدكان للحيوانات قبل العدوى^6،14. وأخيرا ، بالمقارنة مع نموذج تجريبي آخر من التهاب السحايا ، لم يتم التعامل مع الحيوانية مع اي المضادات الحيوية ، لعدم التاثير علي مسار المرض و/أو الملف الشخصي للاستجابة التهابيه²⁶.

حتى الآن ، وقد أبرزت دراساتنا ان الأول. cist. نموذج هو وظيفي للحث علي كل من التهاب السحايا ومرض المكورات السحائية الغازية بالمقارنة مع i.p. أو ا نماذج من العدوى ، والتي تتميز بحدوث الانتان وبكتيريا الدم قبل ان يتم تاسيس مرض السحايا^{10،11 ،12،13،14،15،16،17}. ولذلك ، فان هذا النموذج العدوى استنادا إلى تحريض التهاب السحايا في المضيف murine ، يمكن ان تكون مفيده ليس فقط لتقييم استراتيجية علاجيه مبتكره لمنع النسخ المتماثل البكتيرية مباشره في السائل الدماغي الشوكي ولكن أيضا لتحليل فعاليه المناعي السلبي المحتمل علاج ضد مسببات الامراض البشرية.

ومع ذلك فان عدوي المكورات السحائية هي عمليه متعددة الخطوات ، والتي تشمل البلعوم الأنفي الاستعمار ، والوصول إلى مجري الدم ، وعبور حاجز الدماغ الدموي والانتشار غير المنضبط في النهاية في السائل الدماغي الشوكي ، ونموذجنا يستنسخ فقط بعض جوانب عدوي المكورات السحائية ، من أجل تخريب جزء من هذه القيود نموذج الحيوانية المحورة وراثيا قد تكون مفيده لتقليد المرض البشري للمرض المكورات السحائية.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

تم دعم الدراسات جزئيا بواسطة PRIN 2012 [منح عدد 2012WJSX8K]: "نماذج التفاعل المضيف microbe في التهابات المخاطية: تطوير استراتيجيات علاجيه جديده" وبواسطة PRIN 2017 [2017SFBFER]: "نهج متكامل لمعالجه التفاعل بين التكيف ، والظروف المجهدة ومقاومه مضادات الميكروبات من مسببات الامراض الصعبة ".