الذهب Nanorod بمساعدة تحفيز البصري من الخلايا العصبية

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن التدفئة عابرة المرتبطة امتصاص الأشعة تحت الحمراء عن طريق المياه (الطول الموجي> 1،400 نانومتر) يمكن أن تستخدم للحث على إمكانات العمل في الأعصاب الأنسجة ¹ و العابرين الكالسيوم داخل الخلايا العضلية في ^2. وأثار استخدام الأشعة تحت الحمراء اهتماما كبيرا لتقديم الطلبات في الأطراف الاصطناعية العصبية، نظرا لدقة القرار المكانية المحتملين، وعدم وجود اتصال مباشر مع الأنسجة، والتقليل من القطع الأثرية التحفيز، وإزالة الحاجة إلى تعديل وراثيا الخلايا السابقة لتحفيز ( كما هو مطلوب في علم البصريات الوراثي) ^1. على الرغم من كل هذه المزايا، تشير النماذج الحرارية وضعت مؤخرا أن الهدف الأنسجة / الخلايا قد تتأثر الآثار التدفئة التراكمي، عندما تستخدم مواقع التحفيز متعددة و / أو الرسوب عالية ^3،4.

واستجابة لهذه التحديات، وقد اعترفت الباحثون إمكانية استخدام absor خارجياأفراد لتحفيز العصب لإنتاج آثار أكثر محلية التدفئة في الأنسجة. هوانغ آخرون أثبت هذا المبدأ من خلال استخدام الجسيمات النانوية الفريت مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic لتنشيط عن بعد القنوات TRPV1 حساسة للحرارة في HEK 293 الخلايا مع الترددات الراديوية المجال المغناطيسي ^5. على الرغم من أن هذه التقنية قد تسمح لاختراق أعمق (المجالات المغناطيسية تتفاعل ضعيفة نسبيا مع الأنسجة)، وسجلت ردود فقط على مدى فترات من ثانية، بدلا من فترات ميلي ثانية واحدة المطلوبة في أجهزة الكترونية ^5. وبالمثل، فرح وآخرون التحفيز الكهربائي أثبتت من العصبونات القشرية الفئران السوداء مع الجسيمات الدقيقة في المختبر. أظهروا الدقة على مستوى خلية في التحفيز باستخدام فترات نبض بناء على أمر من مئات ميكرو ثانية والطاقات في نطاق μJ، ويحتمل أن السماح لأسرع معدلات الرسوب ^6.

كما تم تطبيق استخدام ماصات خارجي للحثتغيرات شكلية في المختبر. أظهر Ciofani وآخرون زيادة ~ 40٪ في نمو الخلايا العصبية باستخدام كهرضغطية الأنابيب النانوية نيتريد البورون متحمس بواسطة الموجات فوق الصوتية ^(7). وبالمثل، تم الإبلاغ عن endocytosed جزيئات أكسيد الحديد في الخلايا PC12 لتعزيز محوار التمايز بطريقة تعتمد على الجرعة، ويرجع ذلك إلى تفعيل جزيئات التصاق الخلية مع أكسيد الحديد ^8.

في الآونة الأخيرة، ركزت اهتمامها امتصاص خارجي لمساعدة التحفيز العصبي أيضا على استخدام جزيئات الذهب (الاتحاد الافريقي NPS). الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية لديها القدرة على استيعاب بكفاءة ضوء الليزر في ذروة plasmonic وتبدد ذلك في البيئة المحيطة بها في شكل حرارة ^9. بين كافة الأشكال الجسيمات المتاحة، وامتصاص البصرية من نانواعواد الذهب (الاتحاد الافريقي NRS) مباريات مريح النافذة العلاجية من الأنسجة البيولوجية (بالقرب من الأشعة تحت الحمراء - الجرد الوطني، والطول الموجي بين 750-1،400 نانومتر) ^10. وعلاوة على ذلك، في تتمةتحويلة من التحفيز العصبي، واستخدام الاتحاد الافريقي NRS يوفر توافق مع الحياة مواتية نسبيا ومجموعة واسعة من الخيارات functionalization سطح ^11. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن تأثير تنشيطية على التمايز يمكن أن يتسبب التعرض ليزر بعد متواصلة من الاتحاد الافريقي في شمال ولاية أراكان NG108-15 الخلايا العصبية ^(12). وبالمثل، سجلت العابرين الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية مثقف مع الاتحاد الافريقي NRS بعد أشعة الليزر التضمين مع ترددات متغيرة والنبض أطوال ^13. كما تم تسجيل الاستقطاب غشاء الخلية بعد NIR إضاءة ليزر من الاتحاد الافريقي NRS في الثقافات الأولية من الخلايا العصبية العقدية الحلزونية ^14. الأولى من نوعها في تطبيق الجسم الحي مع المشع الاتحاد الافريقي NRS وقد ثبت مؤخرا. بعثة مراقبة الانتخابات وزملاء العمل كشفت الاتحاد الافريقي NRS في ذروتها plasmonic وسجلت زيادة ستة أضعاف في السعة من إمكانات العمل المركب العصبية (CNAPs) وانخفاض ثلاثة أضعاف في العتبة التحفيز في الفئران الأعصاب الوركي. وENويعزى استجابة تعزيز نسبة إلى آثار التدفئة المحلية الناتجة عن الإثارة من NR plasmonic الذروة ^15.

في هذه الورقة، يتم تحديد بروتوكولات للتحقيق في آثار التحفيز الليزر في NG108-15 الخلايا العصبية مثقف مع NRS الاتحاد الافريقي. هذه الطرق توفر بسيطة، لكنها قوية، وسيلة لأشرق السكان الخلية في المختبر باستخدام التقنيات والمواد البيولوجية القياسية. ويستند هذا البروتوكول على الصمام الثنائي ليزر إلى جانب الألياف (LD) التي تسمح التشغيل الآمن والمواءمة للتكرار. إعداد العينة والليزر طرق التشعيع الاتحاد الافريقي NR يمكن تمديد أيضا على الأشكال الجسيمات المختلفة والثقافات الخلية العصبية، التي تنص على أن البروتوكولات التوليف وثقافة محددة معروفة، على التوالي.

1. الاتحاد الافريقي NRS إعداد

ملاحظة: الاتحاد الافريقي NRS يمكن توليفها من قبل عدد من وصفات ^16، أو تم شراؤها من البائعين التجارية.

1. قياس الكثافة البصرية الأولية (OD) من الحل الاتحاد الافريقي NR عبر أشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي، من خلال تسجيل قيم الامتصاص من 300 نانومتر إلى 1،000 نانومتر مع قرار من 0.5-2 نانومتر. تختلف حجم من الحل لاستخدامها مع كفيت المتاحة.
2. تقييم NP التركيز المولي الأولي مع مناسبة تقنية ¹⁷ (مثل الأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي، جسيم واحد الطيف بالحث كتلة البلازما، وانتقال المجهر الإلكتروني) أو استخدام القيم تركيز المقدمة من قبل البائع.
3. يعد حل الأسهم 5 مل عن طريق تمييع العينة الاتحاد الافريقي NR الأولية للتوصل الى OD = 1. للحصول على أفضل التكرار، والحفاظ على ثابت OD لجميع العينات التي تم اختبارها. اتبع بروتوكول بائع التجاري لتركيبة المذيب تمييع. إذا لم تكن متأكدا، واستخدام الماء منزوع الأيونات.
4. الطرد المركزي 1 مل من محلول الاتحاد الافريقي NR مرتين لمدة 15 دقيقة في 7،800 x ج لإزالة أي فائض الكيميائية من الحل. يمكن دورات الطرد المركزي تختلف في القوة والوقت (على سبيل المثال 20 دقيقة في 5،600 × ز) ^18.
5. إزالة supernatants واعادة تعليق في شمال ولاية أراكان في الماء منزوع الأيونات. كما إعادة علقت الجزيئات قد تشكل الحصى في الحل، إعدادهم يوميا للحصول على أفضل النتائج. بدلا من ذلك، تخزينها في الثلاجة لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع. لا تجمد.
6. قبل استخدام في ظل ظروف زراعة الخلايا، يصوتن الحل الاتحاد الافريقي NR لمدة 5 دقائق ثم تعقيم مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة (كثافة الأشعة فوق البنفسجية لا تقل عن 400 ميغاواط ∙ م ^-2 في 254 نانومتر).

2. NG108-15 الخلية العصبية الخط الثقافة والتمايز

1. لخلية ثقافة المتوسط، وإعداد 500 مل من معقم Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تحتوي على 10٪ (ث / ت) مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ (ث / ت) L-الجلوتامين، 1٪(ث / ت) البنسلين / الستربتومايسين و 0.5٪ (ث / ت) الأمفوتريسين B.
   يمكن aliquoted ملاحق، وتخزينها في -20 ° C، وأضاف أن وسائل الإعلام في اليوم المطلوبة: ملاحظة. يمكن أن تكون مبردة مستنبت الخلية في حالة معقمة لمدة أقصاها 1 الشهر.
2. على المدى المتوسط ​​تمايز الخلايا، وإعداد 50 مل من DMEM معقمة تحتوي على 1٪ (ث / ت) L-الجلوتامين، 1٪ (ث / ت) البنسلين / الستربتومايسين و 0.5٪ (ث / ت) الأمفوتريسين B.
3. تنمو الخلايا العصبية NG108-15 في 10 مل من مستنبت الخلية في قوارير T75 المصنوعة من البوليسترين في حاضنة مع جو مرطب (5٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية). عادة، البذور 1.5-2 × 10 ⁵ خلايا في كل قارورة على أن يكون جاهزا في 3-4 أيام. تغيير ثقافة الخلية المتوسطة كل يومين.
   ملاحظة: لمنع الانجرافات وراثية أو الاختلاف، لا تستخدم الخلايا القديمة من مرور 21 للتجارب.
4. عندما 70-80٪ متكدسة في الثقافة، وتغيير المتوسطة مع الطازج الحار مستنبت الخلية. ميكانيكيا فصل الخلايا عن طريق كنوك بلطفالملك أسفل القارورة متموجة. لا تستخدم التربسين.
5. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 600 XG وإعادة تعليق بيليه خلية في 2 مل من المتوسط ​​الدافئة تمايز الخلايا.
6. البذور 2 × 10 ⁴ خلية / سم ² في زراعة الأنسجة البوليسترين 96 لوحة جيدا مع 200 ميكرولتر من تمايز الخلايا المتوسطة. احتضان التجربة لمدة 1 يوم في 5٪ CO _2/37 ° C.
7. إضافة ما بين 3.2 × 10 ⁹ -4.2 × 1 0 ¹⁰ الجسيمات / مل من محلول الاتحاد الافريقي NR في يوم 2 واحتضان لمدة 24 ساعة إضافية. لا تقم بإضافة جزيئات لتجارب السيطرة.
   ملاحظة: كما عنصر تحكم بديلة والاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية مع ذروة امتصاص الطول الموجي متباينة بشكل جيد يمكن استخدامها لأغراض المقارنة ^14. لسلوك الخلية أكثر اتساقا، والحفاظ على كثافة الخلية ثابتة وعدم تعديل السطح جيدا قبل البذر الخلية.

3. ثمرة neurite تعزيز

1. زوجانالليزر مع الألياف الضوئية وضع واحد (الفتحة العددية = 0.13) وإنهائه مع موصل الألياف (وصلات FC هي مريحة ومتوفرة عادة). قياس انتاج الطاقة الليزر مع السلطة متر القياسية. للحصول على أفضل النتائج، مباراة قمة الطول الموجي لليزر إلى الذروة مأكل الرنين من شمال ولاية أراكان.
2. في يوم 3 التالية حضانة NR، وتحديد موصل FC إلى البئر. أشرق عينات والمراقبة على RT لمدة 1 دقيقة في موجة مستمرة، للقوى الليزر المختلفة. السماح للثقافة والمضي قدما لمدة 3 أيام إضافية بنسبة 5٪ CO _2/37 ° C. كرر وأشعة الليزر مدة لا تقل عن 3 قياسات مستقلة.
   ملاحظة: مرة تشعيع مختلفة ويمكن اختيار الترددات النبض، اعتمادا على التطبيق.
3. تميز الليزر من حيث قطرها شعاع الليزر والإشعاع (W ∙ سم ^-2).
   1. لمعيار واحد من الألياف واسطة، واستخدام NA = ن ∙ الخطيئة θ،حيث n هو معامل الانكسار للوسط في استخدام وθ هي الزاوية نصف من مخروط الضوء الخروج من الألياف (انظر الشكل 1A). من علم المثلثات، ص = تان θ ∙ د، حيث r هو نصف قطر شعاع ود هي المسافة بين الألياف والعينة. موصل FC مباريات قطر البئر، وبالتالي إلقاء الضوء على عينة على مسافة ود = 2.70 ± 0.20 ملم. ضوء يخرج من الألياف في الماء (ن = 1.33)، وإعطاء ص = تان (الخطيئة-1 (NA / ن)) ∙ د.
   2. باستخدام المعادلة الأخيرة، وحساب نصف قطر شعاع الليزر، ومنطقة شعاع المقابلة ومتوسط ​​الإشعاع الليزر (قوة الليزر مقسوما على مساحة شعاع) على الهدف (انظر المثال الرسم البياني في الشكل 1B). هذه القيم تمثل متوسط ​​الإشعاع على المنطقة المضاءة.
   3. تقييم الأخطاء للقياسات مع النظرية العامة للنشر الخطأ.
      ملاحظة: المسافة وبإلى صف موصل FC والعينة يمكن أن يقاس صورا للترتيب التجريبي ومرحلة ما بعد المعالجة من الصورة باستخدام البرمجيات المناسبة (مثل يماغيج).
4. في يوم 5، وإزالة تمايز الخلايا المتوسطة من التجارب وتحديد العينات مع 3.7٪ (V / V) حل الفورمالديهايد لمدة 10 دقيقة، ثم permeabilize الخلايا مع 0.1٪ (V / V) تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة.
5. إضافة 3٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA) للعينات لمدة 60 دقيقة لقطع الطريق على غير المتفاعل البروتين مواقع الربط. تسمية عينات ليلة وضحاها مكافحة βIII تويولين (5 ميكروغرام / مل في PBS تستكمل مع 1٪ من BSA) في 4 درجات مئوية.
6. احتضان الخلايا لمدة 90 دقيقة في الظلام مع الأجسام المضادة الثانوية المناسب (على سبيل المثال TRITC مترافق المضادة للماوس مفتش الأضداد) باستخدام تركيز 0،4-2 ميكروغرام / مل في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني. تسمية نواة الخلية مع دابي (0.1 ميكروغرام / مل في المياه غير المتأينة) لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: اقتران الأجسام المضادة وتركيز MIGحزب التحرير تختلف وفقا لبروتوكول الشركة. عينات غسل مع PBS مرتين لمدة 5 دقائق بعد كل مرحلة تلطيخ.
   
7. عينات الصورة عن طريق epifluorescence أو المجهري متحد البؤر باستخدام ما لا يقل عن 20 × الهدف. اختر المجهر مرشحات فقا لذلك إلى الضد الثانوية. اختر مرشح دابي (λ = 358 نانومتر _EX، λ _EM = 488 نانومتر) لتصور نواة الخلية.
8. تحليل الصور من خلال تقييم: أ) الحد الأقصى للطول محوار (سجل طول من غيض من محوار إلى بداية خلايا الجسم)، والثاني) عدد neurites التي لكل خلية العصبية (تلخيص كل من neurites التي لكل خلية) والثالث) النسبة المئوية للخلايا مع neurites التي (تقسيم العدد الكلي للخلايا معربا عن βIII تويولين من العدد الكلي للخلايا مع نواة ملطخة إيجابا) ^19.

التي يسببها الليزر 4. الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ التصوير

1. إعداد 20٪ (ث / ت) محلول المخزون من Pluronic F-127 عن طريق إذابة 2 غرام من المذاب في 10 مل من اللامائية سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). تسخين حل Pluronic F-127 عند 40 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إلى زيادة القابلية للذوبان. إعداده مسبقا في حال تخزينها في RT.
2. في يوم 3 التالية NR الحضانة، وإعداد محلول ملحي متوازن (BSS، 135 مم كلوريد الصوديوم، 4.5 ملي بوكل، 1.5 ملي CaCl _2، 0.5 ملي MgCl _2، 5.6 ملي الجلوكوز، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4) وتستكمل مع 5 ميكرومتر من فلوو-04:00 في DMSO و 0.1٪ (ث / ت) من Pluronic F-127 الحل.
   ملاحظة: حل BSS يمكن أن تكون معدة مسبقا والمبردة لمدة أقصاها 1 الشهر. إضافة المكملات الغذائية (فلوو-4 صباحا لPluronic F-127) في يوم التجربة.
3. إزالة تمايز الخلايا المتوسطة واستبدالها مع حل BSS تستكمل. للحصول على أفضل النتائج مع المجهر متحد البؤر المقلوب، واحتضان الخلايا في شريحة صغيرة أيضا.
4. تحميل NG108-15 الخلايا مع فلوو-04:00لمدة 30 دقيقة في الظلام في 5٪ CO _2/37 ° C. وبعد فترة حضانة، وغسل العينات مرتين مع BSS لإزالة أي fluorophore تفريغ خارج الخلية.
5. زوجين الليزر مع الألياف الضوئية وضع واحد ويلتصق طرف باستخدام التقنيات القياسية. مراقبة غيض مما أدى تحت المجهر الضوئي، لضمان سطح ذات جودة عالية (أي يجب أن يكون طرف عمودي على محور الألياف وشقة على التفتيش المجهري).
   1. قياس انتاج الطاقة الليزر مع السلطة متر القياسية. إدراج الألياف تسليم خفيفة إلى حامل الألياف الضوئية ويضعوا ذلك إلى micropositioner. الرجوع الى براون وآخرون. ⁽²⁰⁾ لمزيد من التفاصيل حول إعداد الألياف البصرية وتحديد المواقع.
      تحذير: اتبع القواعد العامة للسلامة الليزر خلال قياس قوة الليزر (على سبيل المثال لا تنظر مباشرة إلى شعاع الليزر، وارتداء نظارات السلامة الليزر خلال المناولة، ومنع التعرض الضوء الشارد للمستخدمين معامل أخرى) <./ لى>
6. توصيل الذبذبات إلى ليزر محمول لمراقبة التشكيل البصري. استخدام إشارة الثنائية مع ترددات متغيرة (0.5-2 هرتز) وأطوال نبض (20-100 ميللي ثانية). ربط ليزر باستخدام إشارة التشكيل كما الترانزستور الترانزستور المنطق (TTL) مدخلات لالمجهر، وبعد الإعداد هو مبين في Paviolo وآخرون. ^13.
   1. وضع الخلايا تحت المجهر مبائر مقلوب وموقف تسليم الألياف الخفيفة 250 ± 50 ميكرون بعيدا عن الخلية المستهدفة في وضع الإضاءة الإرسال. في هذه المسافة، استخدم المعادلات الواردة في 3.3.1 لحساب نصف قطر شعاع على الهدف.
7. استخدام الليزر الأرجون ايون (488 نانومتر) لإثارة المنضوية فلوو-04:00 صبغ (λ = 494 نانومتر _EX، λ _EM = 516 نانومتر) وLD متزامنة لالإثارة من NRS endocytosed. أداء التصوير في RT العينات وضوابط استخدام ما لا يقل عن 40 × الهدف من خلال جمع السلاسل الزمنية بالاشعةمع 256 × 256 بكسل / قرار الإطار في وضع توصيل مع تواتر لا يقل عن 4 هرتز. إجراء تسجيل دون أي إثارة LD لتحديد أي تدخل ليزر الأرجون أيون (الضوضاء خط الأساس).
8. إزالة الخلفية من البيانات باستخدام المرجحة بتكيف المربعات الصغرى يعاقب خوارزميات ^21. رسم يسببها الكالسيوم ²⁺ الاختلافات بوصفها وظيفة من الزمن. تحليل قمم عابرة في كثافة مضان باستخدام صورة مرحلة ما بعد المعالجة البرنامج من قبل العتبة عند مستوى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري للضوضاء خط الأساس (3σ).

باستخدام بروتوكولات 1، 2، و 3 وصفها هنا، لوحظ وجود تأثير تنشيطية على التمايز في الخلايا العصبية مثقف NG108-15 مع الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (NRS الاتحاد الافريقي، وبولي (styrenesulfonate) -coated الاتحاد الافريقي NRS والمغلفة السيليكا الاتحاد الافريقي NRS) بعد الليزر التعرض بين 1.25 و 7.5 W · سم ^-2. وأظهرت الصور مبائر من rhodamineB المسمى الاتحاد الافريقي NRS أن الجسيمات تم المنضوية من يوم 1 من الحضانة ^12. وقد لاحظت التعريب في الغالب في السيتوبلازم الخلوي، مشيرا إلى أن الآلية المفضلة بالنسبة للامتصاص كانت عبر غشاء خلايا الجسم ^12. وكانت التغيرات المورفولوجية الرئيسية التي تم رصدها بعد حمل التمايز في الخلايا العصبية NG108-15 اعتقال الانتشار، والتعبير عن بروتين βIII تويولين وثمرة من neurites التي، والتي تم تحليلها من حيث الحد الأقصى لطول وعدد ^22.

وأظهرت عينات مثقف مع NRS زيادة طول Neurite النوعي في irradi الليزرمستويات تعصب تقاس هنا (بين 1.25 و 7.5 W · سم ^-2). وأظهرت عينات التحكم (الخلايا المستنبتة دون مصادر القدرة النووية والمشع بنفس قوة الليزر) أي تغير ملموس في الطول. باستخدام جرعة التشعيع 7.5 W · سم ^-2، وطول محوار النهائي من NG108-15 مثقف مع الاتحاد الافريقي NRS كان اعلى ما يقرب من 36٪ (P <0.01) من العينات غير الليزر المشع. لم يرتبط هذا السلوك على وجه التحديد إلى الكيمياء سطح NRS. كانت هذه القيم قدر أكبر من ما يقرب من 20٪ من neurites التي وضعتها NG108 -15 وحده، وتتعرض لنفس القيمة من التعرض ليزر (P <0.05) ^12. هذه النتائج تتفق مع الدراسات التي نشرت سابقا على PC12 الخلايا العصبية مثقف مع الأنابيب النانوية كهرضغطية والمشع مع الأشعة فوق الصوتية ^(7).

وأظهرت التجارب السيطرة من دون الاتحاد الافريقي NRS أيضا بعض التأثيرات المحفزة للضوء 780 نانومتر من حيث النسبة المئوية من الخلايا العصبية مع neurites التي وعدد من شمال شرقurites في الخلايا العصبية. وكان هذا التحفيز أكثر فعالية في انخفاض القوى الليزر (1.25 W ∙ سم ^-2) مع انخفاض لاحق على أعلى طاقة الليزر (7.5 W ∙ سم ^{-2) 12.} وتحفيز معتدل الناجمة عن مصادر القدرة النووية دون أي أشعة الليزر (بولي (styrenesulfonate) -coated وفقط المغلفة السيليكا) تم الكشف في نسبة الخلايا العصبية مع neurites التي ^12. هذه النتائج تتماشى مع الملاحظات التي نشرت مؤخرا أن جزيئات الذهب يمكن أن يزيد نشاط الخلايا العصبية في المختبر ^23،24 الشكل 2 يوضح مثال من الصور epifluorescence من يفرق NG108-15 الخلايا العصبية مثقف وحدها (الشكل 2A) أو مع NRS الاتحاد الافريقي (الشكل 2B ) والمشع مع القوى الليزر المختلفة (مبين في الشكل).

وأشارت أيضا إلى احتمال الكالسيوم داخل الخلايا الافراج المولدة الصورة ²⁺ باستخدام نابض ضوء الجرد الوطني وفقا للبروتوكولات 1 و 2 و4. أيونات الكالسيوم تلعب دورا مهما في الأنشطة الخلوية المختلفة، مثل الانقسام، تقلص العضلات ومحوار تمديد ^25،26. وردا على التحفيز، والكالسيوم ²⁺ الزيادات، تتأرجح والنقصان، مما يؤدي إلى تفعيل، تعديل أو إنهاء وظيفة معينة من الخلايا. وفي الآونة الأخيرة، كما لوحظ الكالسيوم ²⁺ العابرين نتيجة التعرض IR الليزر في العضلية. في هذا العمل، أثارت ردود الكالسيوم ²⁺ بعد تعرض التعرض IR سعة الدنيا وأوقات الانتعاش أسرع من عفوية الكالسيوم ²⁺ العابرين ² الشكل 3 يبين مثال NG108-15 الخلايا العصبية محملة فلوو-4 صباحا لتصوير مع المجهر متحد البؤر. وقد لوحظ فلوو-4 صباحا إلى إدخال غشاء الخلية بطريقة غير التخريبية، مما أدى إلى توزيع موحد عموما المؤشر عبر سيتوبلازم الخلية. تم الكشف عن ضئيلا النووي أو حشوية عضية تلطيخ. كما هو مبين سابقا، كان من المتوقع أن يكون موجودا داخل الخلية ¹² NRS. NG108-15 الخلايا العصبية وحدها أو تعرضت مثقف مع الاتحاد الافريقي NRS وبولي (styrenesulfonate) -coated-الاتحاد الافريقي NRS بعد ذلك إلى irradiances الليزر بين 0.07 J ∙ سم ^-2 و 370 J ∙ سم ^-2، مع تردد الليزر التضمين في نطاق من 0.5-2 هرتز.

ويبين الشكل 4 نماذج تمثيلية لكيفية تعيين السعة الردود بوصفها وظيفة من الزمن. اتساع الكالسيوم ²⁺ استجابة اختلفت مع التعرض اشعاعا (الشكل 4A - C) ولوحظ لا يمكن تشغيلها باستمرار من قبل نبضات الليزر (الشكل 4C) ^13. وكانت التفسيرات الأكثر احتمالا استنزاف عابرة من داخل الخلايا كا ²⁺ مخازن نسبت إلى غير مكتمل الكالسيوم ²⁺ تحميل ² أو كفاءة مختلفة من NR الداخلي في الخلايا العصبية. عندما لم تستخدم NRS في الثقافيهه (تجارب السيطرة، والشكل 4D)، وقد لوحظ أيضا تأثير تنشيطية للضوء 780 نانومتر. ومع ذلك، وهذا ينتج أقل قمم مضان السعة واحتمال أقل من تفعيل (الكشف عنها في 16٪ فقط من العينات التي تم تحليلها). وعموما، تم التوصل إلى احتمال 48٪ من تنشيط الخلايا التي يسببها الليزر NR وعلى الرغم من الأحداث الخلفية نظرا للضوء 780 نانومتر، والتعرض للخلايا NR المعاملة أثبتت كفاءة أعلى التحفيز مع انخفاض طاقة الليزر وقمم أعلى من الاستجابة ^13. في الواقع، تم العثور على استجابة الكالسيوم إلى ذروته عند 0.33 J ∙ سم ^-2 في الخلايا NR المعاملة. ويعزى ذلك إلى تثبيط الحراري ^13. وخلال التجارب، تم الكشف عن أي دليل على blebbing أو أي شكل آخر من أشكال اضطراب غشاء الخلية، وهو ما يتسق مع نتائج هوانغ آخرون أن ذكرت بهتدستركت الخلوي مع كثافة الطاقة العالية نسبيا من 19 W ∙ سم ^-2 بطلب للحصول على 4 دقيقة ²7. لم يتم تسجيل أية النشاط العفوي في الخلايا NR المعاملة دون التعرض ليزر.

الشكل 1: الألياف الضوئية التجريبي الإعداد (A) ومتوسط ​​irradiances الليزر بوصفها وظيفة من قوة الليزر لشعاع الليزر من منطقة يساوي 0.4 مم ² (B). المعلمات شعاع هي (A): زاوية نصف مخروط الحد الأقصى من الضوء الخروج من الألياف (θ)، في دائرة نصف قطرها شعاع (ص) والمسافة بين الألياف البصرية والعينة (د).

الشكل 2: أمثلة من الصور epifluorescence من التمييز بين الخلايا العصبية NG108-15 مثقف وحدها (A) أو مع NRS الاتحاد الافريقي (B) والمشع مع القوى الليزر المختلفة (مبين في الشكل). وكانت عينات طncubated لأشعة الليزر قبل يوم واحد. تم إصلاح الخلايا وصفت لمكافحة β-III تويولين (أحمر) ودابي (الأزرق) بعد ثلاثة أيام من أشعة الليزر. الحانات النطاق هي 100 ميكرون.

الشكل 3: مثال على التمييز بين الخلايا العصبية NG108-15 محملة Fluo4-AM الكالسيوم ²⁺ مؤشر تم التقاط الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مع هدف النفط الغمر 40X.

الشكل 4: أمثلة التمثيلية التي يسببها الليزر الكالسيوم ²⁺ الاختلافات بوصفها وظيفة من الوقت في NG108-15 الخلايا العصبية مثقف في ظروف خالية من المصل لمدة ثلاثة أيام مع (A) بولي (styrenesulfonate) NRS -Au، (B، C) NRS الاتحاد الافريقي، و (D) دون NRS (العينة الضابطة). وكانت هذه النتائجتم الحصول عليها مع نبضات الليزر 100 ميللي ثانية (A، C، D)، و 50 مللي ثانية (B). وكانت الترددات المستخدمة للتجارب (خطوط عمودية متقطع) 1 هرتز (A - C) و 0.5 هرتز (D). وكانت التعرضات الإشعاعية المحسوبة 69.4 J ∙ سم ^-2 (A)، 34.7 J ∙ سم ^-2 (B)، 0.37 J ∙ سم ^-2 (C) وJ 138.87 ∙ سم ^-2 (D). F _ماكس / F ₀ يشير إلى زيادة الحد الأقصى مضان الكشف عنها في NG108 -15 الخلايا العصبية، من معايرة مع ionomycin (مستنسخة بإذن ^13).

البروتوكولات المذكورة في هذا العرض التقديمي تصف كيفية الثقافة والتفريق وبصريا تحفيز الخلايا العصبية باستخدام امتصاص خارجي. خصائص NR (على سبيل المثال الأبعاد والشكل والطول الموجي صدى مأكل والكيمياء السطحية) والمعلمات التحفيز ليزر (مثل الطول الموجي، طول النبض، ومعدل التكرار، وما إلى ذلك) يمكن أن تختلف لتتناسب مع احتياجات تجريبية مختلفة. يمكن رصد التأثيرات على سلوك الخلية باستخدام المقايسات والمواد البيولوجية القياسية. وعموما فإن النهج يوفر بسيطة، لكنها قوية، وسيلة لأشرق السكان الخلية في المختبر، ويمكن أن تمتد إلى الخلايا الأولية، وعينات الأنسجة والدراسات المجراة.

المتطلبات الرئيسية التي تحتاج NRS الاتحاد الافريقي لإرضاء لاستخدامها في التطبيقات البيولوجية هي الاستقرار (الكيميائية والفيزيائية) وتوافق مع الحياة. هذا الأخير أمر بالغ الأهمية بشكل خاص، بسبب وجود السطحي الموجبة (المشتركلاي CTAB) على سطح الاتحاد الافريقي. ومن المعروف CTAB للحث على السمية الخلوية على حد سواء في المختبر ²⁸ و ²⁹ في الجسم الحي، ويستخدم بشكل شائع أثناء عملية التوليف لدفع NR-شكل تشكيل ^30. وغالبا ما تحسين الاستقرار والتوافق الحيوي عن طريق إيداع الطلاء إضافية على سطح الاتحاد الافريقي NR (مثل غليكول البولي ايثلين ومنتجات السيليكا) ^31. لتقييم توافق مع الحياة، فحوصات مختلفة يمكن استخدامها في المختبر (على سبيل المثال الحي / الميت، MTS، MTT، الخ)، في حين غالبا ما يتم إجراء التحليل النسيجي خلال التجارب الأنسجة ^{7،8،12،15.}

وهناك تحد آخر لوجه عند العمل مع المواد النانوية هو صعوبة تحديد تركيزها المولي بشكل صحيح. ومجموعة كبيرة من المصادر في حيث الشكل والحجم والخصائص الكيميائية يجعل التقنيات المتوفرة حاليا فقط مناسبة لفئات معينة من الجسيمات. على سبيل المثال، معيار scatt الضوء الديناميكيتعافي طريقة يفترض أن مصادر القدرة النووية لها شكل كروي والتشرذم الضوء بشكل متساو ^17. ولذلك، تطبيق هذه الطريقة إلى نتائج الاتحاد الافريقي NRS في التناقضات بين تركيز قياس واحد حقيقي. قضية تركيز NP هي إشكالية خاصة إذا المتصلة بمجال النانوي، حيث يحتاج تركيز تدار على أن تسيطر على وجه التحديد من أجل تحقيق أقصى قدر من فعالية عملية (على سبيل المثال لتطبيقات تسليم المخدرات) والحد من سمية المواد متناهية الصغر ^17. في دراسات نشرت هنا، أعطت الكثافة البصرية المستخدمة نتائج جيدة من حيث بقاء الخلية وعدد الجسيمات.

نظرا لخصائص امتصاص الجوهرية، وغالبا ما تستخدم الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية في مزيج مع مصدر الليزر. خلال التعرض، والاستيعاب ونثر نوعان من العمليات الرئيسية المحتمل أن تحدث على سطح مصادر القدرة النووية. إذا كان الطول الموجي ليزر مباريات الطول الموجي مأكل الرنين، وامتصاص كثير من الأحيانيسود على نثر، مثيرة للإلكترونات التوصيل على سطح NP. هذه تشكل الغاز الإلكترون يتحرك بعيدا عن موقف توازنها ويخلق يسمى التذبذب متماسك الرنانة والمحلية الرنين مأكل السطح (LSPR). ثم يتم نقل الطاقة إلى وضوح الشمس شعرية NP شكل حرارة، الذي يتبدد بعد ذلك بسرعة في البيئة المحيطة ^32. منذ الحرارة هو التأثير الرئيسي لوحظ بعد الإثارة من NR LSPR، فإنه من المستحسن لمراقبة بقاء الخلية بعد التعرض ليزر.

تم الافتراض بأن الآثار الملاحظة على ثمرة neurite والكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ مسار كان من المقرر أن التدفئة عابرة الناشئة عن الإثارة من LSPR. هذه الفرضية هي في خط مع تفعيل قناة TRPV1 حساسة للحرارة بعد التعرض المغناطيسي مصادر القدرة النووية الفريت ^5. هذه العملية هي أيضا تتفق مع الملاحظات التي قنوات TRPV4 الحساسة حراريا جيش التحرير الشعبى الصينىذ دورا هاما في تحفيز العصب تحت الحمراء ^33. على المستوى الجزيئي، فقد ثبت مؤخرا أن TRPV4 غير حساس للحرارة إلا بعد تفاعل فسفوإينوزيتيد -4،5 -biphosphate (PIP ₂₎ مع القناة ^34. ولذلك، فمن الممكن أن التدفئة عابرة تنشأ بعد NR الإثارة يمكن أن تكون لتسريع و / أو لحث افتتاح قنوات TRPV4. يمكن تأكيد هذه الفرضية التي كتبها المستقبلية الكالسيوم ²⁺ التجارب باستخدام الكالسيوم ²⁺ - متوسطة مجانا و / أو ضوابط الجزيئية خلال استنزاف PIP _2.

وقد أثبتت مجموعات مختلفة أيضا أن التدرجات صغيرة في درجة الحرارة على نطاق درجات الحرارة الفسيولوجية يمكن أن تستخدم للحث على الاستجابات الأخرى، مثل مخروط النمو العصبية توجيه ²⁵ أو إزالة إستقطاب التيارات في خلايا الكلى الجنينية البشرية ^35. سجل يونغ وزملاء العمل زيادة كبيرة في النشاط الكهربائي في إشارة الأولية السمعية الخلايا العصبية عبادةمحكم مع المغلفة السيليكا الاتحاد الافريقي NRS بعد أشعة الليزر من شمال ولاية أراكان في LSPR. وقد تم قياس التدفئة التي تنتجها الجسيمات المشع ليزر باستخدام تقنيات التصحيح، المشبك ^14. وفي الآونة الأخيرة، بعثة مراقبة الانتخابات وآخرون. سجلت زيادة في السعة من CNAPs بعد التعرض ليزر 3.4 × 10 ⁹ الاتحاد الافريقي NRS عندما perfused لباستمرار على مقربة من غمد من حزمة الأعصاب من الفئران العصب الوركي ^15.

لم يرتبط بتأثير تنشيطية ليزر ديود 780 نانومتر لوحظت خلال التجارب للحرارة الناتجة عن امتصاص الماء، كما هو معروف أن هذا لا يعتد بها في 780 نانومتر ^36. وأفادت النتائج المنشورة سابقا أيضا آثار تنشيطية من 780 نانومتر ضوء على الأنسجة العصبية في الجسم الحي ^37،38. وقد أظهرت الدراسات في المختبر إشراك أنواع الاكسجين التفاعلية في العملية ^39. ومع ذلك، فإن الآليات التفصيلية التي التحفيز NIR يؤثر transcriptio الجينن والأنشطة الخلوية الأخرى هي دون حل في الوقت الراهن. وتشير البيانات الحالية التفاعل بين تأثيرات مختلفة في التحفيز، بما في ذلك امتصاص الفوتون داخل حاملات في الميتوكوندريا (قد يتم استيعاب ما يقرب من 50٪ من الطاقة في 780 نانومتر بواسطة السيتوكروم ج أوكسيديز) ^37،39-41، والتغيرات في نفاذية الغشاء لالكالسيوم ³⁷ وتثبيط النشاط التهابات في الخلايا ^37.

النتائج المقدمة في هذه المخطوطة تثبت أن امتصاص جسيمات متناهية الصغر على وعود كبيرة للتطبيقات المستقبلية في التحفيز البصري للخلايا العصبية. والميزة الرئيسية تكمن في قدرة NIR ضوء لاختراق عمق الأنسجة (إطار العلاجي). تظهر هذه النتائج أن امتصاص جسيمات متناهية الصغر يمكن أن تعزز و / أو استبدال عملية التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء بناء على امتصاص الماء. وبالنسبة للتطبيقات المستقبلية في الأطراف الاصطناعية العصبية، فإنه سيكون من مصلحة للتحقيق functionalizat سطح مختلفةأيونات مع تقارب الكيميائية لمحاور الخلايا العصبية، التي هي الأهداف الرئيسية للعديد من التطبيقات التحفيز البصرية.

The authors have no competing interests to disclose.

فإن الكتاب أود أن نعترف NanoVentures أستراليا لدعم تمويل السفر والبروفيسور جون هايكوك على استضافتها جزئيا هذا البحث في جامعة شيفيلد والسيدة Jaimee ماين لمساعدتها أثناء التصوير.