JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Abstract

وتاكروليموس الكالسينيورين المانع هو حجر الزاوية في معظم بروتوكولات العلاج المثبطة للمناعة بعد زرع الأعضاء الصلبة في الولايات المتحدة. تاكروليماس هو ضيق مؤشر المخدرات العلاجية ومثل يتطلب مراقبة الأدوية العلاجية وتعديل الجرعة بناء على تركيزات كلها في الحوض الصغير الدم. لتسهيل المخدرات العلاجية الداخل ومراقبة الالتزام، وجمع من بقع الدم المجفف هو مفهوم جذابا. بعد عصا إصبع، والمريض بجمع قطرة دم على ورق الترشيح في المنزل. بعد تجفيفها الدم، وإرساله إلى المختبر التحليلي حيث كميا تاكروليماس باستخدام السائل عالي الأداء اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (HPLC-MS / MS) في توليفة مع يدوية بسيطة من البروتين هطول خطوة واستخراج العمود الانترنت.

لتحليل تاكروليماس، واللكم 6 ملم القرص من مركز المشبعة من بقعة الدم. والمتجانس بقعة الدم باستخدام رصاصة خلاط لالثانية ثم يتم عجلت البروتينات مع الميثانول / 0.2 M ZnSO 4 التي تحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس. بعد vortexing لوالطرد المركزي، ويتم حقن 100 ميكرولتر من طاف في عمود استخراج الانترنت وغسلها مع 5 مل / دقيقة 0.1 الفورميك حمض / الأسيتونتريل (7: 3، ت: ت) لمدة 1 دقيقة. الآخرة، يتم تنشيط صمام التحويل وتحليلها يتم مسح الظهر على العمود التحليلي (وفصلها باستخدام 0.1٪ حمض الفورميك / الأسيتونتريل التدرج). وكميا تاكروليماس في وضع إيجابي متعدد رد فعل (MRM) باستخدام مطياف الكتلة جنبا إلى جنب.

فحص خطي 1-50 نانوغرام / مل. التباين بين فحص (3.6٪ -6.1٪) والدقة (91.7٪ -101.6٪) وفقا لتقييم أكثر من 20 أيام تلبية معايير القبول. متوسط ​​الانتعاش الاستخراج 95.5٪. لا توجد صلة المرحل، التدخلات المصفوفة والآثار المصفوفة. تاكروليماس مستقر في بقع الدم الجافة في RT وفي +4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع. العينات المستخرجة فيالاوتوماتيكى مستقرة في +4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة على الأقل.

Introduction

تاكروليماس هو immonosuppressant قوية 7/1 التي لديها بنية ماكروليد 8 (الشكل 1). نظرا لرابطة الدول المستقلة - تصاوغ العابر للسندات CN أنها تشكل اثنين rotamers في حل 9 التي يمكن أن تكون مفصولة مرحلة عكس الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) التاكروليموس هو محبة للدهون وقابل للذوبان في الكحول (الميثانول: 653 غرام / لتر، والإيثانول: 355 ز / L)، والهيدروكربونات الهالوجينية (كلوروفورم: 573 غرام / لتر) والأثير. وهو قابل للذوبان لماما في الهيدروكربونات الأليفاتية (الهكسان: 0.1 جرام / لتر والمياه (درجة الحموضة 3: 0.0047 جم / L) 9 لا يحتوي جزيء أي حامل اللون والحد الأقصى للأشعة فوق البنفسجية امتصاصه هو 192 نانومتر التاكروليموس الأعمال عن طريق تثبيط الكالسينيورين. وقد تم استعراض آلية العمل في المراجع 10،11. ويستخدم حاليا في أكثر من 80٪ من مرضى زرع الأعضاء الصلبة، في الولايات المتحدة 12.

المؤشر العلاجي للتاكروليماس هو considereد أن يكون ضيقا 13. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العلاقة بين الجرعات تاكروليماس وتركيزات الدم ضعيف والدوائية هو متغير 14،15. مراقبة الأدوية العلاجية لتوجيه تاكروليماس الجرعات في مرضى زرع هو الممارسة السريرية ولالعامة 16-20. الهدف هو الحفاظ على تركيزات تاكروليماس الدم ضمن نطاق العلاجية المحددة مسبقا. تركيزات تاكروليماس الدم أقل من المستوى العلاجي قد يؤدي إلى زيادة نشاط التفاعلات ألو المناعة المزمنة أو الحادة، بينما تركيزات أعلى من النافذة العلاجية تزيد من خطر الإفراط في كبت المناعة والسرطان والسميات، مثل الكلوي، العصبية، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري. عالية التباين داخل الفرد الدوائية التاكروليموس قد يكون ضارا لكلا زرع الأعضاء وبقاء المريض 21،22. في حين تقلب بين الفردية الدوائية تاكروليماس تسببه أساسا الأشكال CYP3A5، أسباب داخل الفردتقلب تشمل، ولكنها لا تقتصر على، المخدرات المخدرات، والمرض للعقاقير والمخدرات التفاعلات الغذاء 14،15. تفتقر أيضا الانضمام إلى مناعة العلاجية نظام المخدرات هو أحد العوامل المساهمة والسبب الرئيسي لفقدان الكسب غير المشروع 23،24.

وتشير هذه الاعتبارات أن المخدرات العلاجية المنزل المتكرر ومراقبة التزام تاكروليماس تركيزات الدم كله قد يكون مفيدا للتأكد من أن المرضى الذين لديهم التعرض تاكروليماس ضمن إطار العلاجي المطلوب في جميع الأوقات. ومع ذلك، والخدمات اللوجستية وتكلفة أكثر تواترا مراقبة الأدوية العلاجية كما هو الممارسة السريرية الحالية 15 باهظة. أحد الأسباب هو أن المريض لديه لمعرفة فصاد أن يكون عينة من الدم الوريدي المطلوب استخلاصها. وقد ظهرت مؤخرا بقع الدم الجافة كمفهوم جذابة 25-28. بعد إصبع بسيطة عصا المريض بجمع قطرة دم على ورقة ورقة فلتر خاصة وبعد أن د بقعة الدمرييد، فإنه يمكن أن ترسل إلى المختبر المركزي لتحليل تاكروليماس وأي مناعة أخرى أن المريض قد تكون آخذة في الوقت الراهن. وقد أصبح هذا ممكنا بفضل تطور فحوصات LC-MS / MS حساسة للغاية ومحددة لتقدير حجم تاكروليماس ومناعة أخرى في حجم الدموية الصغيرة جدا مثل بقع الدم المجفف (عادة 20 ميكرولتر من الدم) 25،29-43. ميزة أخرى هي أنه، استراتيجيات جمع الغازية الحد الأدنى منخفضة عينة حجم مثل بقع الدم المجفف يسهل إلى حد كبير مراقبة الأدوية العلاجية والدراسات الدوائية في الأطفال الصغار 28.

وعادة ما تقاس تاكروليماس في EDTA وريدي كله الدم 15. الأسباب التي تاكروليماس يوزع على نطاق واسع في خلايا الدم وأن الدراسات السريرية وأفادت علاقة أفضل بين تركيزات تاكروليماس الحوض الصغير في الدم من البلازما في الأحداث السريرية 15،18. في المقارنة، وتحليل تاويستند crolimus في بقع الدم المجفف على الدم الشعرية التي يختلط مع مصفوفة ورق الترشيح. هذه تحديات من حيث الإذابة التاكروليموس والتدخلات المحتملة مع تحليل LC-MS / MS. هنا نقدم مقايسة إنشاء والتحقق من صحتها على أساس تجانس بقعة الدم المجفف باستخدام خلاط رصاصة في توليفة مع ارتفاع تدفق عينة العمود الانترنت تنظيف الداخلي وتحليل LC-MS / MS. اعتبارا من اليوم، وقد تم بنجاح استخدام هذا الاختبار لتقدير حجم أكثر من خمسة آلاف تاكروليماس المجففة عينات بقعة الدم لرصد الالتزام في التجارب السريرية.

Protocol

وحددت دي عينات الدم من أشخاص أصحاء من مستشفى جامعة كولورادو (أورورا، كولورادو). واعتبر استخدام الدم عينات البنك التي تم تحديدها دي للدراسات المصادقة وكذلك لإعداد معايرة وعينات مراقبة الجودة "معفاة" من قبل مجلس كولورادو متعدد المؤسسي مراجعة (COMIRB، أورورا، كولورادو).

1. إعداد المراجع وحلول

  1. تاكروليماس الشراء ومستوى داخلي D 2، 13 C-تاكروليموس من الموردين المدرجين في قائمة المواد.
    1. إعداد الحلول الأسهم في الميثانول النقي بتركيز 1 ملغ / مل لتاكروليماس وتركيز 10 ميكروغرام / مل لD 2، 13 C-تاكروليماس. جعل الحلول الأسهم من المواد المرجعية على أساس ثلاثة أوزان مستقلة. قسامة حلول الأسهم وتخزينها في -70 درجة مئوية أو أقل.
  2. يعد حل لترسيب البروتيناتواستخراج تاكروليماس باستخدام الميثانول / 0.2 M ZnSO 4 في الماء (7: 3، ت: ت). يحتوي هذا الحل أيضا معيار D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس بتركيز 2.5 نانوغرام / مل، ويستخدم لاستخراج جميع العينات إلا لاستخراج عينات فارغة (انظر 1.3.3).
    1. يعد هذا البروتين هطول حل حديثا في كل يوم الاستخراج وتعيين انتهاء صلاحية حل في 12 ساعة.
  3. إعداد منحنى المعايرة ومراقبة الجودة عينات (QC)
    1. إعداد الحلول الأسهم التاكروليموس عن طريق إجراء التخفيفات المناسبة من المحلول باستخدام الميثانول النقي.
    2. لإعداد معايرة وعينات مراقبة الجودة، وارتفاع 20 ميكرولتر من محلول المخزون مخففة بشكل مناسب في EDTA الدم كله، في احتضان 37 درجة مئوية تحت لطيف تهتز في حمام مائي للسماح للتوزيع متجانس من تاكروليماس في مكونات الدم الخلوية لمدة 20 دقيقة وقسامة إلى 1.5 مل سليلةأنابيب ropylene مع قاع مخروطي والمفاجئة على الجفن. تأكد من أن الحجم النسبي من المذيبات العضوية لا تتجاوز 5٪.
    3. بقعة 50 ميكرولتر من الدم الكامل ارتفعت في منتصف كل دائرة على بطاقات تصفية باستخدام ماصة.
    4. تجفيف بقع الدم على بطاقات مرشح في RT لمدة 3 ساعة.
    5. إعداد معايير تاكروليماس المعايرة في EDTA البشري الدم الكامل بتركيزات تاكروليماس 1، 2.5، 5، 10، 25، و 50 نانوغرام / مل. إعداد نموذج فارغ لاستخراج مثل معايير المعايرة مع البروتين هطول محلول يحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس ("صفر عينة").
    6. تحضير عينات QC في EDTA البشري الدم كله في تركيزات 0، 2، 4، 20، 40 نانوغرام / مل. إعداد نموذج فارغ. وعلى النقيض من عينات QC التي تستخرج مع هطول الأمطار التي تحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس، استخراج هذه العينة فارغة مع البروتين هطول الحل الذي يفعللا يحتوي على مستوى D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس ("نموذج فارغ").
  4. جمع العينات السريرية
    1. جمع البقع الدموية المجففة كما هو موضح في 43،44.

2. استخراج التاكروليموس المجفف بقعة عينات الدم

  1. تفقد البصر بقعة الدم المجففة لضمان مقبول نوعية العينة وحجم 45.
  2. مركز لكمة من بقعة الدم على بطاقة التصفية مع 6 ملم ثقب كمة.
    ملاحظة: يمكن رصد جودة من اللكمات من قبل وزنها. A كمات المشبعة القرص مرشح يزن في المتوسط ​​5.02 ملغ ± 0.09 ملغ (المدى: 4.83- 5.14 ملغ، ن = 12).
  3. أقراص المكان إلى 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين ذات القاع المخروطي والأغطية الإضافية على.
  4. إضافة 20-30 الرصاص إلى كل أنبوب.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من البروتين هطول الحل (الميثانول: 0.2 M ZnSO 4، 7: 3، والخامس: الخامس مع 2.5 نانوغرام / مل معيار الداخلية) في كل أنبوب. لEXTRعمل عينات فارغة، واستخدام البروتين هطول حل دون المعيار الداخلي.
  6. التجانس الأقراص في الخلاط رصاصة لمدة 1 دقيقة (السرعة القصوى، ووضع "10").
  7. هزة عينات في RT على التعددية أنبوب دوامة (السرعة القصوى، ووضع "10") لمدة 10 دقيقة.
  8. عينات الطرد المركزي في 16000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  9. نقل supernatants في قوارير الزجاج HPLC مجهزة إدراج 300 ميكرولتر. استخدام ما قبل شق الأختام تفلون.
    قد يتم تخزين العينات المستخرجة في -20 درجة مئوية أو أقل حتى تحليل LC-MS / MS: مذكرة.

3. LC-MS / MS تحليل

  1. تحميل 100 ميكرولتر من طاف من العينة المستخرجة على العمود استخراج خرطوشة C8، ويغسل مع 7: 3 نسبة من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الماء: الأسيتونتريل في تدفق 5 مل / دقيقة لمدة 1 دقيقة. وترد اتصالات من صمام التحول في الشكل (2) والتدرج تشغيل بواسطة مضخة الاستخراج في الجدول 1 .
  2. الآخرة، وتفعيل صمام التحويل الناتجة في العودة دافق من التحاليل من قبل العمود على العمود التحليلي.
  3. ضبط ترموستات عمود إلى 65 درجة مئوية.
  4. أزل تحليلها من العمود التحليلي باستخدام معدلات التدفق والتدرج هو مبين في الجدول 1.
  5. ربط العمود التحليلي لمطياف الكتلة جنبا إلى جنب عبر مصدر التأين electrospray توربو. ضبط المعلمات الرئيسية للمطياف الكتلة وفقا للجدول 2.
  6. الكشف عن الأيونات الموجبة ([M + نا] +) في وضع رد الفعل المتعدد (MRM). استخدام التحولات ايون التالية لتقدير: تاكروليماس: م / ض (الكتلة / تهمة) = 826.6 616.2 → وD 2، 13 C-تاكروليماس: م / ض = 829.6 → 619.2.
    ملاحظة: إجمالي وقت التشغيل هو 4.6 دقيقة.

4. الكمي

  1. لكل شوط، وتوليد منحنى المعايرة استنادا إلى معايرة أعدت في 1.3.5 وتدرج في كل شوط التحليلي.
    1. إنشاء منحنى المعايرة بالتآمر تركيزات الاسمية مقابل عامل استجابة الحليلة (قمة منطقة [الحليلة] / قمة منطقة [القياسية الداخلي]) باستخدام برنامج مطياف الكتلة.
    2. تناسب معايرة باستخدام نوبة من الدرجة الثانية في تركيبة مع 1 / X الترجيح.
  2. لتاكروليماس الكمية في بقع الدم المجفف دمج تاكروليماس والقمم القياسية الداخلية في الاستشرابية MRM المستخرج. حساب معامل استجابة لتاكروليماس (قمة منطقة [الحليلة] / قمة منطقة [القياسية الداخلي]) ومقارنتها مع منحنى المعايرة باستخدام برنامج قياس الطيف الكتلي.

5. إجراءات التحقق

  1. الحد الأدنى من الكشف (LLOD) والحد الأدنى للالكمي (LLOQ).
    1. النظر في أقل تركيز تاكروليماس مع نسبة الذروة إلى الضوضاء من 4: 1 كحد ادنى للكشف عن (LLOD). تحديد الحد الأدنى للالكمي (LLOQ) كماأقل تركيز من منحنى المعايرة مع دقة تساوي أو أفضل من ± 20٪ الانحراف عن تركيز الاسمي والدقة مساوية أو أفضل من 20٪ (معامل التباين).
  2. داخل والدقة بين يوم وتوضيحات.
    1. اختبار الدقة والإحكام على أربعة مستويات تركيز 2 نانوغرام / مل (QC1)، 4 نانوغرام / مل (QC2)، 20 نانوغرام / مل (QC3) و 40 نانوغرام / مل (QC4).
    2. إعداد العينات QC في كل يوم في التحقق من صحة الإنسان EDTA الدم كله، يجف على ورق الترشيح، واستخراج وتحليل كما هو موضح أعلاه.
    3. تحديد دقة خلال اليوم والدقة مع 6 عينات في مستوى تركيز QC.
    4. تقييم دقة بين يوم والدقة أكثر من 20 يوما. قياس كل مستوى QC مع 4 عينات كل يوم.
    5. تحليل اثنين من منحنيات المعايرة جنبا إلى جنب مع عينات QC في كل يوم.
    6. حساب دقة خلال اليوم باسم٪ من تركيز الاسمية (ست عينات في مستوى تركيز، يرجى الاطلاع 5.2.2). احسبالدقة ulate كما معامل التباين (CV٪).
    7. النظر في دقة خلال اليوم مقبولا إذا ما وقعت في قبول يحد 85٪ إلى 115٪ من تركيز الاسمية. النظر بدقة خلال اليوم مقبولة إذا كانت مساوية أو أفضل من السيرة الذاتية (معامل التباين) من 15٪.
    8. حساب دقة بين يوم والدقة كمتوسط ​​لكل مستوى تركيز QC تحليلها خلال الأيام التحقق من صحة 20.
    9. النظر في متوسط ​​دقة أمور يوما مقبولا إذا ما وقعت في قبول يحد 85٪ إلى 115٪ من تركيز الاسمية. النظر في الدقة بين يوم مقبولة إذا كانت مساوية أو أفضل من السيرة الذاتية (معامل التباين) من 15٪.
  3. استبعاد التدخلات المصفوفة.
    1. لاستبعاد التدخلات التي قد تكون ناجمة عن إشارات مصفوفة وتحليل فارغة بقع الدم المجفف (8 مختلف الأفراد، ويفضل 4 ذكور و 4 إناث).
    2. تفقد البصر الاستشرابية أيون. إذا قمم في الوقت الاحتفاظتم الكشف عن نافذة تاكروليماس، ودمج ومقارنة مناطقهم تحت المنحنى مع تلك القمم تاكروليماس في عينات فارغة ارتفعت مع تاكروليماس في LLOQ. ليس من المفترض مجال قمم في العينات فارغة لتتجاوز 15٪ من تلك التاكروليموس في LLOQ.
  4. أيون قمع / تعزيز أيون.
    1. استخدام بروتوكول ضخ ما بعد العمود كما هو موضح 45 لتقييم أي تشويش محتمل لتعزيز أيون قمع / أيون الناجمة عن مكونات المصفوفة يبلغ حجمه المشترك.
    2. يبث تاكروليماس بتركيز 10 ميكروغرام / مل يذوب في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪: الميثانول (30:70، ت / ت) بعد العمود بمعدل 10 ميكرولتر / دقيقة.
      1. توصيل ضخ حقنة عن طريق T-قطعة بين العمود التحليلي ومصدر electrospray من مطياف الكتلة.
      2. رصد كثافة إشارة MS / MS من التحولات MRM لتاكروليماس والمعيار الداخلي (م / ض = 826.6 616.2 → وم / ض = 829.6 → 619.2) بعد حقن المقتطفتيد عينات فارغة (ن = 8 عينات من مختلف الأفراد).
        ملاحظة: في حالة عدم وجود تعزيز أيون قمع / أيون لا ينبغي أن تتأثر الإشارة المستمرة الناجمة عن ضخ تحليلها عن طريق الحقن من المصفوفة فارغة، بينما أيون قمع يؤدي إلى تراجع في إشارة والأيونات تعزيز الذروة.
  5. تحمل أكثر.
    1. تقييم المحتملين المرحل من خلال تحليل عينات المستخرجة فارغة بعد أعلى معايرة (50 نانوغرام / مل، ن = 6).
    2. تفقد البصر الاستشرابية أيون. إذا تم الكشف عن قمم ضمن إطار الوقت الاحتفاظ التاكروليموس ودمج ومقارنة مناطقهم تحت المنحنى مع تلك القمم تاكروليماس في عينات فارغة ارتفعت مع تاكروليماس في LLOQ. ليس من المفترض مجال قمم في العينات فارغة لتتجاوز 15٪ من تلك التاكروليموس في LLOQ.
  6. المبالغ المستردة الاستخراج.
    1. تحديد المبالغ المستردة من خلال مقارنة إشارات من التحاليل بعد استخراج QC سامPLES على جميع المستويات التركيز الأربعة (ن = 6 في التركيز) مع تلك فارغة بقع الدم المجفف ارتفعت مع المبالغ المقابلة من تاكروليماس بعد الاستخراج.
    2. إعداد أربع مجموعات من حلقات الجودة (مستويات تركيز: 2، 4، 20، 40 نانوغرام / مل).
    3. إعداد 4 مجموعات أخرى من المقابلة "الانتعاش اختبار عينات" من خلال الكشف عن 50 ميكرولتر من EDTA فارغة الدم كله على بطاقات ورق الترشيح والتجفيف لمدة 2 ساعة.
    4. الآخرة، لكل من QC وفارغة "عينات الاختبار الانتعاش"، قطع بقعة الدم بالكامل على بطاقة مرشح مع مقص ووضع أقراص الناتجة في أنبوب البولي بروبلين ذات القاع المخروطي والمفاجئة على غطاء.
    5. استخراج جميع العينات.
    6. نقل supernatants (400 ميكرولتر) في قوارير الزجاج HPLC.
    7. إضافة محلول المخزون تاكروليماس إلى بياض "الانتعاش استخراج عينات الاختبار" للوصول إلى تركيزات 2 و 4 و 20 و 40 نانوغرام / مل (4 ميكرولتر من 200، 400، 2000، 4000 نانوغرام / مل الأسهم تاكروليماس سولutions إلى 400 ميكرولتر من طاف).
    8. بعد تحليل LC-MS / MS، مقارنة الإشارات في كل من عينات QC و "التعافي اختبار عينات" للتركيز المقابلة (٪ = عينات إشارة الانتعاش ارتفعت قبل ارتفعت عينات استخراج / إشارة بعد استخراج × 100).
  7. سلامة التخفيف.
    1. ارتفعت إنشاء النزاهة تخفيف باستخدام عينات مع تحليلها في 500 و 250 و 100 نانوغرام / مل.
    2. بعد استخراج، وتمييع العينات باستخدام بروتين هطول الحل (01:10، ن = 3 لكل مستوى التركيز).
    3. حساب الانحرافات عن تركيزات الاسمية. النظر في نتائج التي تقع ضمن 85٪ -115٪ من الاسمية مقبولة.
  8. بثبات.
    1. التحقيق بثبات باستخدام عينات مراقبة الجودة على جميع المستويات التركيز الأربعة (ن = 4 في التركيز) تحليلها في مختلف نقاط وقت وتحت ظروف التخزين المختلفة.
    2. مقارنة النتائج بعد التخزين مع القيم الاسمية. النظر صesults التي تقع ضمن 85٪ -115٪ من الاسمية مقبولة.
    3. تحقيق الاستقرار عينة ل1 أسبوع عند درجة حرارة الغرفة، 1 أسبوع في 4 درجات مئوية، 1 شهر في -20 ° C و 1 شهر في -80 ° C.
    4. اختبار الاستقرار تجميد ذوبان الجليد على مدى ثلاث دورات (-20 ° C). اختبار استخراج عينة والاستقرار الاوتوماتيكى عن طريق وضع العينات في الاوتوماتيكى thermostatted تعديلها ل4 ° C. حقن عينات بعد 72 ساعة.

النتائج

الاستشرابية أيون التمثيلية لعينة فارغة، ارتفعت عينة على الحد الأدنى من تقدير وعينة المرضى في الشكل 3.

منحنيات المعايرة

وكان الحد الأدنى للكشف 0.5 نانوغرام / مل وكان الحد الأدنى للالكمي 1.0 نانوغرام / مل. خمسون نانوغرام / مل تم اختيار كأعلى تدريج كما من غير المحتمل أن يكون تم التوصل إليه في العيادة تحت الظروف العادية تركيزات أعلى.

وقد أعدت منحنيات المعايرة حديثا في كل يوم في التحقق من صحة EDTA البشري الدم الكامل، والمجففة على بطاقات الترشيح واستخراج مع الميثانول / 0.2 M ZnSO 4 (70:30 ت / ت) + معيار الداخلية (تركيز النهائي من معيار الداخلية: 2.5 نانوغرام / مل ). للتحقق من صحة يوم 1 (ن = 6 للمعايرة ون = 6 لمستوى QC) وللأيام 2-20 (ن = 2 للمعايرة ون = 4 لكل مستوى QC) تم تحليلها مع تركيز 1، 2.5، 5، 10، 25، 50 نانوغرام / مل لcalibrators. واعتبرت مقبولة ويرد منحنى المعايرة النموذجية في الشكل (4). يعني الدقة من 85٪ إلى 115٪ من الاسمية، ضمن نطاق العمل ل2/3 من معايرة (مع ما لا يقل عن 6 معايرة غير الصفر). وكان معامل ارتباط متوسط ​​(ص) = 0.999 (ن = 40 منحنيات المعايرة).

الدقة والايضاحات

وتظهر النتائج بالتفصيل في الجدول 3.

استخراج الانتعاش

كان متوسط ​​المبالغ المستردة استخراج 98.2٪ (2 نانوغرام / مل)، 92.2 (4 نانوغرام / مل)، 95.5 (20 نانوغرام / مل)، 96.2 (40 نانوغرام / مل).

مصفوفة التداخلات، ايون قمع / ايون تعزيز اختبار عن طريق التسريب المستمر في مرحلة ما بعد العمود والمرحل

تحليل العينات فارغة من ثمانية أفراد مختلفين (ن = 4 إناث و n = 4 ذكور) أظهرت إشارات أقل من 15٪ من LLOQ (1 نانوغرام / مل) في الوقت الاحتفاظ المقابلة لتاكروليماس الذروة مشيرا إلى أن ذروة تاكروليماس الكشف يمكن اعتبار محددة. ويرد مثال ممثل في الشكل (3). تم اختبار التدخلات المحتملة من قبل أيون قمع / تعزيز أيون باستخدام فارغة عينات الدم المجفف من ثمانية أشخاص أصحاء مختلفة. ويرد تجربة ممثل في الشكل 5. لم يلاحظ أي مؤشرات هامة أيون تعزيز قمع / أيون. تم الكشف عن أي صلة المرحل مما أدى إلى قمم تتجاوز 15٪ من إشارة في LLOQ.

النزاهة التخفيف

وكان التحقيق النزاهة تخفيف من خلال تحليل عينات أعدت بتركيزات أعلى من أعلى المعاير (100 و 250 و 500 نانوغرام / مل)، والمخفف 01:10 بالبروتين هطول حل بعد استخراج للوصول إلى تركيزات الهدف من: 10، 25، و 50 نانوغرام / مل. كانت الدقة متوسط ​​تقع ضمن معايير القبول من 85٪ إلى 115٪ من تركيزات الاسمية. جميع التخفيفات قسم التدريب والامتحاناتالتقى تيد معايير القبول (جدول 4).

بثبات

تم التحقيق استقرار تاكروليماس في بقع الدم المجفف من خلال تحليل عينات QC على جميع المستويات الأربعة (ن = 4 / مستوى التركيز)، والتي تم تخزينها تحت ظروف مختلفة.

كانت الدقة متوسط ​​تقع ضمن معايير القبول من 85٪ إلى 115٪ من تركيزات الاسمية. وتظهر نتائج بالتفصيل في الجدول 5. لا خسائر بعد 1 أسبوع من التخزين في RT، بعد 1 أسبوع من تخزين عند 4 درجات مئوية، بعد 1 شهر التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، بعد 1 شهر تخزين في -80 ° C، وبعد 3 تجميد والذوبان دورات، و بعد 72 ساعة من العينات المستخرجة في العينات السيارات في 4 ° C كانت واضحة.

مضخة استخراج التحليلية (شطف) مضخة
الوقت [دقيقة] الماء + حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ الأسيتونتريل معدل التدفق [ميكرولتر / دقيقة] الوقت [دقيقة] الماء + حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ الأسيتونتريل معدل التدفق [ميكرولتر / دقيقة]
0 70 30 5000 0 13 87 1000
1 70 30 5000 2 2 98 1200
1.1 2 98 100 3.5 2 98 1200
3 2 98 100 3.6 13 87 1000
3.1 20 80 2000 4.6 13 87 1000
4 70 30 5000
4.6 70 30 5000

جدول برنامج التدرج 1. لاستخراج والتحليلية HPLC مضخات.

معلمة ضبط
الغاز الاصطدام (CAD) 10
الغاز الستار (CUR) (رطل) 30
ايون مصدر للغاز 1 (GS1) (رطل) 50
ايون الغاز المصدر 2 (GS2) (رطل) 30
البخاخات الحالية (NC) (V) 1
درجة الحرارة (TEM) (° C) 600
IonSpray الجهد (IS) (V) 5500
سخان واجهة (IHE) على
Declustering إمكانية (DP) (V) 136
إمكانية القبول (EP) (V) 10
الطاقة التصادم (CE) (V) 47
تصادم إمكانية خروج الخلية (CXP) (V) 16

الجدول 2. توربو Electrospray واجهة ومطياف الكتلة معلمات. تقابل هذه التسميات لتلك المستخدمة في البرنامج قياس الطيف الكتلي (لمزيد من التفاصيل الصانع، يرجى الاطلاع على قائمة المواد).

يوم التحقق من صحة مستوى QC [٪ من تركيز الاسمية]
2 4 20 40
اليوم 1 93.0 86.3 88.9 93.4
101 90.4 95.3 100
85.6 95.9 99.0 97.5
88.6 93.6 105 103
85.0 97.4 97.2 109
89.1 96.7 100 101
خلال اليوم الدقة [٪] 90.4 93.4 97.6 100.7
يوم داخل الدقة [CV٪] 6.6 4.6 5.5 5.2
يوم 2 92.8 86.0 103 95.4
91.1 88.8 94.7 87.0
88.6 90.9 92.8 94.2
97.2 93.7 94.2 115
خلال اليوم الدقة [٪] 92.4 89.9 96.2 97.9
يوم داخل الدقة [CV٪] 3.9 3.6 4.8 12.2
اليوم 3 97.6 101 98.4 112
104 85.6 102 110
99.2 88.4 99.4 105
96.3 87.2 108 117
خلال اليوم الدقة [٪] 99.3 90.6 102.0 111.0
يوم داخل الدقة [CV٪] 3.4 7.8 4.2 4.5
اليوم 4 95.2 88.6 112 94.5
105 87.3 93.2 116
99.8 96.2 103 103
100 104 97.2 99.4
خلال اليوم الدقة [٪] 100.0 94.0 101.4 103.2
يوم داخل الدقة [CV٪] 4.0 8.2 8.1 8.9
اليوم 5 106 90.4 101 106
108 89.0 106 100
102 101 96.6 128
105 88.8 105 107
خلال اليوم الدقة [٪] 105.3 92.3 102.2 110.3
يوم داخل الدقة [CV٪] 2.4 63 4.2 11.1
اليوم 6 90.9 93.7 119 106
98.8 88.1 96.4 110
94.6 96.3 99.1 108
108 100 102 102
خلال اليوم الدقة [٪] 98.1 94.5 104.1 106.5
البينية يوم الدقة [CV٪] 7.5 5.3 9.8 3.2
يوم 7 85.1 87.5 99.5 95.4
86.4 85.4 94.7 101
94.5 87.3 98.9 94.6
85.5 97.0 101 99.6
خلال اليوم الدقة [٪] 87.9 89.3 98.5 97.7
يوم داخل الدقة [CV٪] 5.1 5.8 2.7 3.2
اليوم 8 86.1 92.5 91.9 102
87.5 91.5 95.2 88.5
115 85.6 92.1 102
85.8 85.9 95.4 108
خلال اليوم الدقة [٪] 93.6 88.9 93.7 100.1
يوم داخل الدقة [CV٪] 15.3 4.1 2.0 8.2
اليوم 9 88.9 91.4 96.9 100
90.0 89.8 95.0 100
69.7 85.9 95.8 109
91.9 87.0 105 101
خلال اليوم الدقة [٪] 85.1 88.5 98.2 102.5
يوما داخل الدقة [CV٪] 12.2 2.9 4.7 4.3
يوم 10 90.9 91.3 96.2 100
97.7 89.5 94.4 100
99.9 109 98.7 96.8
99.1 90.0 95.7 96.1
خلال اليوم الدقة [٪] 96.9 95.0 96.3 98.2
يوم داخل الدقة [CV٪] 4.2 9.9 1.9 2.1
يوم 11 92.7 91.9 88.2 104
96.6 91.2 97.0 110
109.0 92.8 970.6 102
98.3 107 93.7 111
خلال اليوم الدقة [٪] 99.2 95.7 94.1 106.8
يوم داخل الدقة [CV٪] 7.0 7.9 4.6 4.1
يوم 12 87.7 85.5 105 95.3
112 88.1 101 96.1
102 89.1 89.7 97.5
106 92.5 102 104
خلال اليوم الدقة [٪] 101.9 88.8 99.4 98.2
يوم داخل الدقة [CV٪] 10.1 3.3 6.7 4.0
يوم 13 باءت بالفشل 85.7 93.3 102
101 105 88.0 93.9
112 98.0 91.4 102
104 113 104 101
خلال اليوم الدقة [٪] 105.7 100.4 94.2 99.7
يوم داخل الدقة [CV٪] 5.4 11.5 7.3 3.9
يوم 14 91.5 89.1 97.4 93.1
90.4 87.1 93.9 99.8
89.7 97.0 94.8 106
97.4 86.8 89.9 باءت بالفشل
خلال اليوم الدقة [٪] 92.3 90.0 94.0 99.6
يوم داخل الدقة [CV٪] 3.8 5.3 3.3 6.5
يوم 15 92.8 92.8 92.5 95.4
97.5 96.3 96.2 95.5
95.5 108 97.3 99.3
110 109 115 113
خلال اليوم الدقة [٪] 99.0 101.5 100.3 100.8
يوم داخل الدقة [CV٪] 7.7 8.1 10.0 8.3
يوم 16 93.7 97.8 90.7 112
90.3 87.1 باءت بالفشل 101
97.9 88.3 95.5 107
91.4 85.7 89.3 96.7
خلال اليوم الدقة [٪] 93.3 89.7 91.8 104.2
يوم داخل الدقة [CV٪] 3.6 6.1 3.5 6.4
يوم 17 88.0 86.0 93.7 103
89.8 90.8 94.8 93.2
85.9 91.1 99.7 94.8
86.7 88.1 95.6 91.7
خلال اليوم الدقة [٪] 87.6 89.0 96.0 95.7
يوم داخل الدقة [CV٪] 1.9 2.7 2.7 5.3
يوم 18 89.6 85.8 91.0 98.3
89.6 86.2 88.3 93.6
باءت بالفشل 86.7 96.8 104
88.1 85.8 95.2 111
خلال اليوم الدقة [٪] 89.1 86.1 92.8 101.7
يوم داخل الدقة [CV٪] 1.0 0.5 4.2 7.4
يوم 19 98.0 89.7 94.2 102
88.3 86.0 97.6 102
91.6 88.1 95.8 97.5
90.7 90.1 92.8 88.3
خلال اليوم الدقة [٪] 92.2 88.5 95.1 97.5
يوم داخل الدقة [CV٪] 4.5 2.1 2.2 6.6
يوم 20 93.0 87.0 99.4 101
97.3 87.6 95.5 91.9
89.0 88.4 91.2 93.5
104 90.7 97.7 115
خلال اليوم الدقة[٪] 95.8 88.4 96.0 100.4
يوم داخل الدقة [CV٪] 6.7 1.8 3.7 10.5

دقة أمور يوم والدقة
بين اليوم الدقة 95.2 91.7 97.2 101.6
يوما أمور الدقة 6.1 4.5 3.6 4.2

الجدول 3. نتائج عينات مراقبة الجودة أكثر من 20 يوم. يتم تقديم البيانات كنسبة مئوية من الاسمية. العينات المذكورة بأنها "فاشلة" والعينات التي فقدت أخطاء مختبر / الصك. في معظم الاكاديميةوفاق، تم الكشف عن أي قمم في كل أو ذروة قياسية الداخلية كان في عداد المفقودين.

تخفيف 01:10
الاسمي تركيز الهدف بعد التخفيف 50 نانوغرام / مل
98.6
94.5
91.4
دقة [٪] 94.8
عدم الدقة [CV٪] 3.6
تخفيف 01:10
الاسمي تركيز الهدف بعد التخفيف 10 نانوغرام / مل
103
99.5
101
دقة [٪] 101.2
عدم الدقة [CV٪] 1.8
تخفيف 01:10
الاسمي تركيز الهدف بعد التخفيف 25 نانوغرام / مل
91.7
98.2
103
دقة [٪] 97.6
عدم الدقة [CV٪] 5.7

ويرد الجدول 4. نتائج التخفيف النزاهة اختبار. البيانات كنسبة مئوية من الاسمية.

ا
الاستقرار في RT، يوم 1
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
91.9 85.8 86.0 102
86.7 85.7 88.5 102
86.0 85.9 90.1 103
89.2 98.0 90.8 112
٪ من تركيز الاسمية 88.5 88.9 88.9 104.8
عدم الدقة [٪ CV] 2.7 6.1 2.1 4.9
الاستقرار في RT، يوم 3
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
88.6 105 101 113
94.1 100 98.5 103
100 101 106 109
99.5 102 102 108
٪ من تركيز الاسمية 95.6 102.0 101.9 108.3
عدم الدقة [٪ CV] 5.3 2.2 3.1 4.1
الاستقرار في RT، يوم 7
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
105 103 91.7 109
101 107 100 110
102 108 107 105
93.8 105 109 111
٪ من تركيز الاسمية 100.5 105.8 101.9 108.8
عدم الدقة [٪ CV] 4.7 2.2 7.8 2.6
ب
الاستقرار في +4 درجة مئوية، يوم 1
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
101 89.9 95.8 100
88.9 91.0 94.1 99.0
96.2 100 102 96.7
89.5 87.8 95.4 88.6
٪ من تركيز الاسمية 93.9 92.2 96.8 96.1
عدم الدقة [٪ CV] 5.8 5.4 3.5 5.2
الاستقرار في +4 درجة مئوية، يوم 3
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
87.3 85.2 105 95.3
باءت بالفشل 87.8 101 96
101 88.8 89.6 97.5
106 92.2 102 104
٪ من تركيز الاسمية 98.1 88.5 99.4 98.2
عدم الدقة [٪ CV] 9.7 2.9 6.8 4.0
الاستقرار في +4 درجة مئوية، يوم 7
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
94.0 98.5 96.1 110
92.9 96.4 109 109
91.7 96.3 97.9 115
94.7 96.9 99.8 113
٪ من تركيز الاسمية 93.3 97.0 100.7 111.8
عدم الدقة[٪السيرة الذاتية] 1.3 1.0 5.7 2.8
C
الاستقرار في -20 ° C، يوم 3
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
87.3 98.7 111 111
93.5 89.6 108 105
89.5 91.5 107 112
88.2 99.1 108 92.4
٪ من تركيز الاسمية 89.6 94.7 108.5 105.1
عدم الدقة [٪ CV] 2.7 4.9 1.7 تسعة
الاستقرار في -20 ° C، يوم 7
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
96.5 98.7 102 109
94.8 94.6 114 106
95.5 102 98.1 108
107 99.5 115 105
٪ من تركيز الاسمية 98.5 98.7 107.3 107
عدم الدقة [٪ CV] 5.7 3.1 8.5 1.8
الاستقرار في -20 ° C، يوم 30
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
82.3 83.1 90.4 93.2
87.9 85.8 85.3 97.9
85.7 88.6 98.3 98.0
92.0 95.6 110 103
٪ من تركيز الاسمية 87.0 88.3 96.0 98.0
عدم الدقة [٪ CV] 4.1 5.4 10.8 4.0
D </ td>
الاستقرار في -80 ° C، يوم 3
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
87.5 96.5 96.7 باءت بالفشل
باءت بالفشل 97.6 98.7 110
88.8 96.4 106 109
87.3 101 96.5 109
٪ من تركيز الاسمية 87.9 97.9 99.5 109.3
عدم الدقة [٪ CV] 0.8 2.2 4.5 0.6
الاستقرار في -80 ° C، يوم 7
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
باءت بالفشل 98.0 105 99.8
97.1 106 104 105
99.7 102 99.3 102
101 99.9 109 106
٪ من تركيز الاسمية 99.3 101.5 104.3 103.2
عدم الدقة [٪ CV] 2.0 3.4 4.0 2.8
الاستقرار في -80 ° C، يوم 30
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
88.2 85.3 89.6 96.7
96.2 92.6 85.8 94.1
83.9 93.7 91.0 105
95.6 94.0 98.9 102
٪ من تركيز الاسمية 91.0 91.4 91.3 99.5
عدم الدقة [٪ CV] 6.0 4.1 5.5 4.9

ه
الاستقرار ذوبان التجميد -20 ° C، 1 دورة
مستوى QC [نانوغرام / مل] </ td> 2 4 20 40
92.5 86.2 90.2 94.3
89.8 90.5 85.4 104
94.7 88.6 93.4 104
101 89.2 93.7 96.3
٪ من تركيز الاسمية 94.5 88.6 90.7 99.7
عدم الدقة [٪ CV] 4.8 1.8 3.9 5.1
تجميد ذوبان الاستقرار، -20 ° C، 2 دورات
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
99.1 97.6 باءت بالفشل 85.3
93.1 88.1 93.4 92.0
94.9 91.5 85.8 93.9
باءت بالفشل 90.5 86.8 85.4
٪ من تركيز الاسمية 95.7 91.9 88.7 89.2
عدم الدقة [٪ CV] 3.1 4.0 4.1 4.5
تجميد ذوبان الاستقرار، -20 ° C، 3 دورات
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
95.7 باءت بالفشل 86.0 93.3
95.5 87.4 85.0 91.3
90.5 89.1 86.0 86.0
96.9 85.7 90.2 باءت بالفشل
٪ من تركيز الاسمية 94.7 87.4 86.8 90.2
عدم الدقة [٪ CV] 2.8 1.7 2.3 3.8
F
استخراج عينة الاستقرار في +4 درجة مئوية، 24 ساعة
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
122 112 91.0 104
93.5 106 91.8 96.1
111 94.8 98.2 93.5
98.4 97.6 91.3 89.8
٪ من تركيز الاسمية 106.2 102.6 93.1 95.9
عدم الدقة [٪ CV] 12.8 7.9 3.4 6.0
استخراج عينة الاستقرار في +4 درجة مئوية، 48 ساعة
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
106 108 93.7 110
105 98.1 94.6 98.9
103 98.4 95.0 92.6
108 93.1 89.7 85.5
٪ من تركيز الاسمية 105.5 99.4 93.3 96.8
عدم الدقة [٪ CV] 2.1 6.2 2.4 10.4
استخراج عينة الاستقرار في +4 درجة مئوية، 72 ساعة
مستوى QC [نانوغرام / مل] 2 4 20 40
96.5 112 96.4 104
101 95.3 103 95.2
94.2 105 93.5 99.5
100 96.9 92.6 89.3
٪ من تركيز الاسمية 97.9 102.3 96.4 97.0
عدم الدقة [٪ CV] 3.1 7.7 4.7 63

الجدول 5. نتائج اختبار الاستقرار. A: استقرار تاكروليماس على بقع الدم المجفف في RT أكثر من 7 أيام، B: استقرار تاكروليماس على بقع الدم المجففة في الثلاجة (+4 ° C) أكثر من 7 أيام، C: استقرار تاكروليماس على بقع الدم المجفف في -20 ° C أكثر من 1 شهر، D: استقرار تاكروليماس على بقع الدم المجفف في -80 ° C أكثر من 1 شهر، E: استقرار تاكروليماس على بقع الدم المجفف على مدى ثلاث دورات تجميد ذوبان الجليد (-20 ° C)، F : استخراج عينة الاستقرار / الاوتوماتيكى في +4 درجة مئوية خلال 72 ساعة. وتقدم البيانات كنسبة مئوية من تركيز الاسمية. العينات المذكورة بأنها "فاشلة" والعينات التي فقدت أخطاء مختبر / الصك. في معظم الحالات تم الكشف عن أي قمم في كل أو ذروة قياسية الداخلية كان في عداد المفقودين.

figure-results-36124
الشكل 1. هيكل التاكروليموس. الترقيم أتوم يتبع الاتحاد الدولي للالتسميات كيمياء البحتة والتطبيقية (IUPAC). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-36563
الشكل 2. اتصال من صمام التبديل.424fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-36872
الرقم 3. الاستشرابية تمثيلية ايون. (A) اللوني ايون ممثل لعينات دم فارغة رصدت على ورق الترشيح (لمزيد من التفاصيل الصانع، يرجى الاطلاع على قائمة المواد) وتجفيفها. السهم هي المرة الإبقاء على الذروة تاكروليماس، (B) اللوني ايون ممثل الدم فارغة ارتفعت عينات بناء على الحد الأدنى من الكمي (1 نانوغرام / مل) رصدت على ورقة الترشيح والمجففة، و (C) الممثل ايون اللوني من عينة تم جمعها من قبل مريض زرع على ورق الترشيح. هذا هو نموذج القاع وكان تركيز تاكروليماس قياس 2.1 نانوغرام / مل. وقد تم جمع هذه العينة من قبل المريض في المنزل وغير من التجارب السريرية التي كانت التي وافقت عليها جامعة سينسيناتي جنة المراجعة المؤسساتية (سينسيناتي، OH). أعطى جميع المرضى موافقة خطية المناسبة لهم. الاستشرابية أيون هي النسخة الأصلية المطبوعة الرافضة كما تم إنشاؤه بواسطة برنامج قياس الطيف الكتلي (لمزيد من التفاصيل الصانع، يرجى الاطلاع على قائمة المواد). الخطوط الزرقاء والحمراء في الاستشرابية أيون تمثل المعيار D الداخلي 2، 13 C-تاكروليماس وتاكروليماس، على التوالي. ذروة يبلغ حجمه أمام تاكروليماس الرئيسي والقمم القياسية الداخلية هي rotamers. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-38296
الرقم 4. ممثل معايرة منحنى. ويرد الطباعة خارج الأصلية كما تم إنشاؤه بواسطة برنامج قياس الطيف الكتلي.424 / 52424fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-38682
الرقم 5. ممثل ايون المخطط الاستشرابي المقاسة خلال تسريب ما بعد العمود التاكروليموس وحقن لاستخراج عينة الدم فارغ لتقييم مصفوفة التأثير المحتمل (ايون قمع / ايون تعزيز). ويمثل السهم الوقت الاحتفاظ الذروة تاكروليماس. واستند مصفوفة اختبار تأثير على الإجراء الموضح في 46. لا المصفوفة ذات الصلة تم الكشف عن تأثير. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

على الرغم، كما سبق ذكره، فإن مفهوم المخدرات العلاجية ومراقبة التزام تاكروليماس بناء على بقع الدم المجفف جذابة، هناك تحديات التحليلية التي تتجاوز تلك التي ترتبط عادة مع تحليل LC-MS / MS التاكروليموس في EDTA وريدي عينات الدم الكامل. وتشمل هذه، ولكن ليس على سبيل الحصر، أن المصفوفة الدم الكامل الشعرية غارقة في المواد نسالة القطن من المواد بطاقة مرشح المستخدمة هنا وانخفاض حجم الدم (20 ميكرولتر). ومع ذلك، تحليل الإنتاجية العالية في المختبر المركزي يتطلب طريقة سريعة وموثوق بها استخراج الذي ينتج في عينات التي تفتقر إلى التدخلات المصفوفة والآثار مصفوفة جنبا إلى جنب مع القوي ومحددة وحساسة للغاية LC-MS / MS الفحص. الاعتماد على فحص أمر بالغ الأهمية كما أن هناك عادة لا ما يكفي من المواد على بطاقة مرشح لكمات بالفعل غادرت لإعادة التحليل في حالة فشل استخراج / تحليل LC-MS / MS.

وفايبطاقات lter المستخدمة في هذه الدراسة (لمزيد من التفاصيل الصانع، يرجى الاطلاع على قائمة المواد) اختيرت لأن هذه هي ادارة الاغذية والعقاقير وافق الجهاز من الدرجة الثانية، هي في الامتثال لتوجيهات NCCLS LA4-A5 44 و في أوروبا بعلامات CE. إذا ملأ تماما، دائرة واحدة على بطاقة مرشح هتما 903 يحمل ≈50 ميكرولتر الدم 46. ومع ذلك، فإن حجم قطرات الدم التي تم جمعها من قبل المرضى الفردية تختلف والتدريب في الأسلوب السليم أخذ العينات ضروري 46.

الخطوة الهامة الأولى لاستخراج التدريجي لكمات المجففة عينة بقعة الدم التجانس. بناء على خبرتنا، واستخدام الخلاط رصاصة هو أكثر كفاءة وأفضل استنساخه من الأساليب الأخرى المستخدمة لتعزيز كفاءة استخراج مثل صوتنة. كان استخدام الخلاط رصاصة ضروري لتحقيق باستمرار الانتعاش استخراج أكثر من 90٪. لموثوقية الإجراء استخراج، فمن المهم أيضا التأكد من أن جميع أجهزة الطرد المركزي temperatلدى عودتهم للرقابة (4 درجة مئوية) وأن الخطوة vortexing لكانت لا تقل عن 10 دقيقة، مما أسفر عن المبالغ المستردة استخراج أكثر تنوعا وأقل. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن نسبة الميثانول / ZnSO 4 لا تغيير عن الانتعاش تاكروليماس حساس جدا لتكوين الصحيح من البروتين هطول الحل.

التحدي المقبل هو الحصول على استخراج نظيفة خالية مثالي من المواد التي قد تسبب التدخلات مصفوفة والآثار. وبالتالي، لا يعتبر بسيطة من خطوة واحدة بروتين هطول الخطوة بأنها غالبا ما تستخدم لاستخراج تاكروليموس من عينات الدم EDTA خيارا قابلا للتطبيق. بعد هطول الأمطار البروتين باستخدام ZnSO 4 (بما في ذلك إضافة معيار الداخلي المسمى النظائر)، vortexing لوالطرد المركزي، تم حقن supernatants إلى نظام 2D HPLC وعلى عمود استخراج الانترنت. استخراج العمود الانترنت باستخدام التدفقات عالية من 5 مل / دقيقة على خراطيش قبل العمود التقليدية باستخدام بسيط 6 الميناءوقد وصفت تبديل صمام لتحليل تاكروليماس قبل 47. وقد تم اختيار الطور المتحرك بحيث تاكروليماس والمعيار الداخلي تتركز في الجزء الأمامي من العمود استخراج ولم تهاجر عبر العمود خلال خطوة تنظيف. كان استخراج الانترنت المستخدمة في هذا البروتوكول العديد من المزايا بما في ذلك ضخ كميات عينة كبيرة نسبيا دون أن يؤثر ذلك سلبا على تحليل HPLC. للتدفق مرة أخرى بعد إثراء التحاليل على رأس العمود استخراج ("ذروة التركيز") أدت إلى قمم أكثر وضوحا مما يسمح للاندماج أكثر موثوقية من قبل خوارزمية البرنامج وخصوصا لعينة بتركيزات تاكروليماس منخفضة. 48 وقال إن الخطوة تنظيف على الانترنت لا يزيل فقط يحتمل التدخل المركبات مصفوفة، ولكن أيضا إزالة المملحة العينة. مشكلة واحدة مهمة حتى الآن نادرا ما تتم مناقشته لكبيرة الحجم، عالية الإنتاجية فحوصات LC-MS / MS هو الفقدان التدريجي للحساسية النظام LC-MS / MS نتيجة لزيادةتلوث المصدر electrospray خلال تحليل دفعات كبيرة. لم يلاحظ أي آثار مصفوفة كبيرة (أيون تعزيز قمع / أيون). تم تخفيض الأثر السلبي لآثار مصفوفة المحتملة / تجنبها عن طريق الجمع بين ما يلي: هطول الأمطار البروتين الفعال باستخدام الميثانول / ZnSO 4، الطرد المركزي بعد البروتين هطول الأمطار في 16000 x ج، وارتفاع تدفق استخراج الانترنت، واضحة الفصل الكروماتوغرافي التاكروليموس من التدخلات المحتملة يبلغ حجمه المبكر من العمود التحليلي واستخدام المسمى النظير تاكروليماس وفقا لمعايير الداخلي بدلا من المعايير الداخلية المتعلقة هيكليا مثل ascomycin.

وكان الحد الأدنى للالكمي 1 نانوغرام / مل، وبالتالي أقل من أن معظم المناعية التي يكثر استخدامها حاليا لمراقبة الأدوية العلاجية التاكروليموس في عينات الدم EDTA. هذا الحد الأدنى للتقدير غير كافية حتى لما يسمى المانع منخفض الكالسينيورين immunosuppres على المدى الطويلبروتوكولات صيانة SIVE.

بالمقارنة مع سبق وصفها المقايسات LC-MS / MS لتحديد تاكروليماس في الدماء المجففة البقع 29-34،36،39،41،42، مباريات فحص الحالية أو يتجاوز أدائها من حيث الحد الأدنى للتقدير، والانتعاش استخراج والدقة والدقة مع تفادي مفاهيم قد تكون محفوفة بالمخاطر مثل إجراءات البروتين هطول خطوة واحدة والأوقات اللوني القصيرة جدا، والتي عادة ما تعطي نتائج مقبولة خلال المصادقة على أساس عينات الدم من الأشخاص الأصحاء. ومع ذلك، مرضى زرع هي مجموعة معقدة للغاية من المرضى الذين لديهم الأمراض التي تؤثر على تكوين الدم والذين يأخذون أدوية متعددة. هذا يجعل من المستحيل تقريبا لاستبعاد كل التدخلات المحتملة التي قد تكون موجودة في الأفراد المرضى أثناء التحقق من صحة والاستراتيجية الوحيدة القابلة للتطبيق هو إعداد مقايسة في هذه الطريقة أنها تقلل من مخاطر مثل هذه التدخلات المحتملة. المجففة مكتب التخطيط الاستراتيجي الدمنهاية الخبر تواجه تحديات مثل تأثير الهيماتوكريت على لزوجة الدم وبالتالي خصائص انتشار الدم تطبيقها على ورق الترشيح 49. وهذا لم تختبر هنا مرة أخرى كما سبق وصفت هذه الآثار لا تؤثر تحليل تاكروليماس في بقع الدم المجفف في hematocrits وتركيزات تاكروليماس ضمن حدود معقولة سريريا 29،32. وقد تم بالفعل درس أيضا استقرار تاكروليماس في بقع الدم المجفف في درجات حرارة مرتفعة من قبل الآخرين وتاكروليموس في بقع الدم المجفف وجدت لتكون مستقرة لمدة 5 أيام في 37 ° C وحتى 60 ° C 32، وهو أمر مهم للشحن من الدم المجفف البقع في ظل ظروف لا درجات الحرارة التي تسيطر عليها خصوصا خلال فصل الصيف.

هذا الاختبار يعتمد على مزيج من رصاصة خلاط التجانس، وارتفاع تدفق تنظيف العمود الانترنت وتحليل LC-MS / MS قد توفر منصة استراتيجية لتطوير المقايسات bioanalytical لتقدير حجم IMM أخرىunosuppressants، وحده أو في وقت واحد، فضلا عن أنواع أخرى من المخدرات في العينات المجففة بقعة الدم.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
TacrolimusU.S. Pharmacopeial Convention1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.F370002
Red blood cellsUniversity of Colorado HospitalW20091305500 V
PlasmaUniversity of Colorado HospitalW2017130556300Q
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9%Sigma-Aldrich439126-4 L
Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificA955-4
Isopropanol 99.9%, HPLCFisher ScientificBP2632-4
Methanol Optima LC/MSThermo Fisher ScientificA452-4
Water Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificW6-4
Formic acidThermo Fisher ScientificA118P-500
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Zinc sulfateThermo Fisher ScientificZ68-500
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
1.5 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-682-550
10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008651
10 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 10XLS3
100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008653
100 μl pipet tips with filter, sterileNeptuneBT 100
1,000 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2940
2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
2 ml Eppendorf tubeThermo Fisher Scientific02-681-258
20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008652
20 μl pipet tips with filter, sterileGeneMateP-1237-20
200 μl pipet tips with filterMultimax2938T
200 μl pipet tips with filter, sterileMultimax2936J
50 ml Falcon tubeBD Falcon352070
300 μl inserts for HPLC vialsPhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogenizerNext AdvanceBBX24
Centrifuge Biofuge FrescoHeraeus290395
Disposable WipesPDIQ55172
Glass v ials, 4 mlThermo Fisher Scientific14-955-334
Glass vials, 20 mlThermo Fisher ScientificB7800-20
Gloves, nitrileTitan Brand Gloves44-100S
HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clearPhenomenexARO- 9921-13
Lids for HPLC vialsPhenomenexARO- 8952-13-B
Needle, 18 G 1.5Precision Glide305196
Rack for Eppendorf tubesThermo Fisher Scientific03-448-11
Rack for HPLC VialsThermo Fisher Scientific05-541-29
Steel beads 0.9 – 2 mmNext AdvanceSSB14B
Storage boxes for freezers / refrigeratorsThermo Fisher Scientific03-395-464
Standard multi-tube vortexerVWR Scientific Products658816-115
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman 2016-05
AutosamplerCTC PAL PAL.HTCABIx1
Binary pump, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
Binary pump, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
Micro vacuum degasser, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
Column oven,  Agilent 1290 with 2 position Agilent Technologies1290 G1216C
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valveAgilent Technologies1290 G1316C
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mmPhenomenex820950-926
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mmPhenomenex993967-906
Tandem Mass Spectrometer
API5000 MS/MS with TurboIonspray sourceAB Sciex4364257
Mass spectrometry softwareAB SciexAnalyst 1.5.1

References

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
  13. Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
  14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
  16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973(2014).
  45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
  46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

105 LC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved