وkinetochore هو المكان الذي يبدأ SAC الاشارة رصد الفصل الإنقسامية من chromatids شقيقة. تم وصف طريقة لتصور التوظيف ودوران واحد من البروتينات kinetochore والتنسيق مع الحركة في كروموسوم ذبابة الفاكهة أجنة باستخدام نظام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر لايكا.

حاجز الجمعية المغزل (SAC) آلية هي إشارة نشط، والذي يراقب التفاعل بين kinetochores كروموسوم وميكروتثبول المغزل للحيلولة دون ظهور طور الصعود حتى ترتبط بشكل صحيح الكروموسومات. الخلايا استخدام هذه الآلية لمنع عدم الاستقرار أو عدم توازن الصبغيات الجينية، وبالتالي السرطان والأمراض البشرية الأخرى مثل العيوب الخلقية ومرض الزهايمر ^1. وهناك عدد من المكونات مثل SAC Mad1، Mad2، Bub1، BubR1، Bub3، Mps1، Zw10، وقد تم تحديد ورود أورورا كيناز باء، وأنهم جميعا البروتينات kinetochore الدينامية ^(2). تشير الدلائل إلى أن kinetochore هو المكان الذي بدأ إشارة ساك. الهدف الرئيسي ساك التنظيمية Cdc20. Cdc20 هي واحدة من وسائل تفعيل APC / C (أ ف naphase romoting C omplex أو yclosome C) ⁽³⁾ وأساسي هو أيضا بروتين kinetochore دينامية ^4-6. عند تفعيلها، وSAC يثبط من نشاط وPC / C لمنع تدمير اثنين من ركائز رئيسية، cyclin باء وsecurin، مما يحول دون انتقال الطورية إلى طور الصعود ^7،8. بالضبط كيف يتم بدء إشارة SAC وتجميعها على kinetochores ونقلت على لآسيا والمحيط الهادئ / C لمنع وظيفتها لا تزال بعيدة المنال.

ذبابة الفاكهة هو نظام لين العريكة جدا التجريبي؛ كائن أبسط من ذلك بكثير وأفضل مفهومة مقارنة مع واحد ولكن الإنسان الذي أسهم في العمليات الأساسية المشتركة. هو، ربما، واحدة من أفضل الكائنات الحية لاستخدامها في التصوير دراسات البيولوجية في الخلايا الحية، وخاصة بالنسبة للالتصور للأحداث الإنقسامية في المكان والزمان، كما أن الجنين في وقت مبكر يذهب من خلال 13 دورات السريع تقسيم النووية بشكل متزامن (8-10 دقائق لكل دورة على درجة مئوية 25)، وتنظم تدريجيا نوى في أحادي الطبقة واحدة فقط تحت القشرة ^9.

هنا، أقدم طريقة الحيوي التصوير باستخدام المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة EXPRESالغناء GFP (الأخضر بروتين فلوري) أو البديل لها استهداف البروتينات من الفائدة وTCS لايكا SP2 نظام ليزر متحد البؤر مجهر المسح لدراسة وظيفة SAC في الذباب، من جراء عرض صور من البروتينات الانصهار GFP من بعض المكونات SAC، Cdc20 وMad2 ، كما في المثال.

1. الذباب المعدلة وراثيا والصيانة

1. الذباب استخدام المعدلة وراثيا في هذه التظاهرة: Ubq-GFP-Cdc20 (II)، Ubq-RFP-His2B (X *)؛ Ubq-GFP-Cdc20 (II *)، Ubq-GFP-Cdc20 (II *)؛ mad2 ^EY ( تم إنشاؤها سابقا الثالث *)، وUbq-GFP-Cdc20 الذباب المعدلة وراثيا في المعمل من خلال نهج موحد بوساطة ف العناصر المعدلة وراثيا ^و10،11 Ubq-RFP-His2B هو هدية من نوع Belaïche يوهانس في كوري UMR CNRS / المعهد 144، باريس، فرنسا. وأدخلت هم الى خلفية متحولة Mad2 عبر معيار ذبابة الفاكهة علم الوراثة. تم شراء mad2 ^EY خط متحولة الأصلي من مركز الأوراق المالية بلومينغتون. لن نناقش الإجراءات المتبعة لرفع transformants في هذا البروتوكول.
   ملاحظة: * يمثل عدد الكروموسومات.
2. الصيانة: تمت المحافظة على الذباب المعدلة وراثيا في 25 درجة مئوية في قوارير من البلاستيك containinز طيران إضافية مع الطعام ومسحوق الخميرة الجافة على القمة. تم استبدال روتينية القارورة كل 3-4 أسابيع تبعا لظروف النمو (الشكل 1).

2. يطير إعداد الطعام (مختبر مقياس)

1. كانت ساخنة مبلغ مناسب من مزيج الغذاء يطير مع التحريك المستمر لإذابة المكونات.
2. تم توزيع حوالي 8-10 مل من هذه الوسيلة كما الطين في كل قارورة من البلاستيك (2.5 سم x قطر طول 8 سم) باستخدام العلمية Jencons مضخة تحوي المحدودة.
3. عندما تم تعيين الطين الطعام وتبريده الى درجة حرارة الغرفة، ثم يتم توصيل القارورة مع القطن المكونات رغوة. وتوضع هذه القوارير الأطعمة في صينية أن مختومة ثم في كيس من البلاستيك والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.

3. صغار البيض مجموعة

1. وتم نقل نحو 50 زوجا من الذباب يوم 2-3 البالغين من العمر إلى قارورة ذبابة المواد الغذائية الطازجة المتوفرة مع إضافية مسحوق الخميرة الجافة على سطحه عند 25 درجة مئوية لمدة العاديجى الأجنة.
2. ثم يتم نقل الذباب إلى قارورة جديدة كل ساعة وترك الأجنة في القنينة لمدة 30 دقيقة للتأكد من الذين تتراوح أعمارهم بين بعض الأجنة التي تم جمعها حول النووي 8-10 دورة تقسيم عندما نوى تهاجر تدريجيا إلى القشرة ومنظمة بشكل جيد واحد أحادي الطبقة. يتم تجاهل عادة جمع الساعة الأولى لأنها غالبا ما تحتوي على أجنة المسنين التي تم الاحتفاظ بها في أجساد النساء عندما كانت الظروف غير مناسبة للوضع.

4. إعداد Coverslips والشرائح

1. تحصل على 50 × 22 ملم ساترة ورطبة قليلا على أربعة أركان على جانب واحد مع كمية صغيرة جدا من الماء باستخدام فرشاة رطبة قلم غرامة ووضعها على شريحة المجهر بحيث ساترة لا يتحرك بسبب التوتر السطحي الشعرية بسبب فيلم السائل رقيقة.
2. تطبيق شريط رقيقة من الغراء هيبتان عبر وسط ساترة، ينبغي أن هيبتان تتبخر في ثانية لمغادرة الغراء في ساترة.
3. خفض آخر ساترة مع قلم الماس إلى مربعات صغيرة (~ 1.5 ملم ^2)، والتقاط واحدة ووضعه على واحدة من نهاية الشريط الغراء (يتم استخدام هذا الخيار لفتح رأس إبرة عندما يطلب microinjection) وانقاذ الآخرين من أجل المستقبل استخدام.
4. أخذ شريحة أخرى مجهر والعصا قطعة من الوجهين شريط لاصق حول 2 سم طويلة لأنها وتقشر ورقة الغلاف. (انظر الشكل 2A & B).

5. Dechorionate الأجنة

1. نقل الذباب إلى قارورة المواد الغذائية الطازجة واستخدام فرشاة مبللة قلم غرامة لنقل حوالي 50 بيضة على الشريط على الوجهين لزجة على الشريحة مع كمية مناسبة من السوائل للسماح على أن يتم نشره البيض خارج. عندما السائل قد تبخرت والبيض التمسك الشريط.
2. تحت المجهر لمسة تشريح البيض عدة مرات على طول المحور الطويل باستخدام الجانب الخارجي من نصف من زوج من ملاقط بلطف حتى المشيماء غير مكسورة ومفتوحة، ولكن ترك الجنين في تشورايون قذيفة لمنع الجفاف السريع. تستمر هذه العملية حتى تمت معالجتها 10-20 من البيض (اعتمادا على عدد من البويضات اللازمة للتجربة واحدة).
3. ويمكن بعد ذلك للأجنة يمكن الحصول عليها وإزالتها من قذيفة المشيماء ووضعها برفق على قطاع الصمغ واحدا تلو الآخر. ويمكن وضع البيض والانحياز سواء من الجانب الطويل للجنين أو موازية لمكافحة بالتوازي مع الجانب طويلة من قطاع الغراء تعتمد على إذا ما أريد لها أن microinjected.
4. ويمكن إما أن الأجنة يمكن تغطيتها مباشرة مع كمية مناسبة من زيت 10S Voltalef (خليط 05:01 من النفط 700 Holocarbon والنفط 27، سيغما) لمنع مزيد من تجفيف للتصوير فوري أو وضعه في غرفة تجفيف ل3-8 دقائق يذوى منهم اعتمادا على مزيد من الرطوبة من الغرفة، والغرض من هذه التجربة. يجب تغطية الأجنة المجففة مع زيت 10S عند الاقتضاء لمنع الإفراط في جفاف إذا كان مطلوبا microinjection. (أنظر الشكل. 2C، D& E).

6. تصوير الجنين

1. يتم تجميع الصور الوقت الفاصل بين واحد أو من الأجنة الحية باستخدام TCS لايكا SP2 مقلوب نظام متحد البؤر المجهري مع PL HCX APO CS 40X 1،25 النفط الهدف غمر (ويمكن استخدام 60 أو أهداف 100X اعتمادا أيضا على الغرض من هذه التجربة، وارتفاع استخدم التكبير لأكثر صور التبييض سوف يحدث).
2. وعندما يتم fluorophores التصوير المتعددة، والتي تداخل الأطياف وشارك في المعبر عنها في الجنين نفسه، جمعت كل الانبعاثات بروتين فلوري الطول الموجي بالتتابع. موجات الإثارة وانبعاث المتوفرة على نظام لايكا SP2 TCS هي: GFP، λ _{تحويلة:} 488 نانومتر، وλ _إم: 500-600 نانومتر. طلب تقديم العروض، λ _{تحويلة:} 543 نانومتر، _وإم λ: 555-700 نانومتر.
3. تم الحصول على عادة صورة واحدة كمعدل وسطي من 2 scanlines بمتوسط ​​بالاشعة إطار-2. هذا يستغرق ما لا يقل عن 6.3 ثانية لمسح ف 512x512ixel الصورة في وضع المسح الضوئي في وقت واحد، وثانية 15،44 لوضع الفحص متتابعة وتنتج جيدة إشارة إلى نسبة الضوضاء. هذه الأوقات يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند إعداد أطر زمنية لجمع صورة مرور الزمن.
4. كان من المقرر عادة إلى الثقب الاتحاد الافريقي 1-2 (مهواة وحدة)، و تم تعديل قوة الليزر إلى أدنى مستوى ممكن لتجنب أي photobleaching كبيرة.

7. استفزاز من قبل SAC Microinjecting الأجنة مع الكواشف المناسبة

1. إعداد إبرة قبل التجربة. نحن نفضل أن سحب الإبرة من الشعيرات الدموية زجاج siliconised (GC-100-10، في جامعة هارفارد) باستخدام المشتعلة / براون micropipette مجتذب (سوتر الصك، الموديل: P-97) مع معلمات: الحرارة = 600، وسحب = 90، فيل = 70 ، دل = 150.
2. ردم إبرة مع 1-2 مل من تركيز المناسب للكاشف في عازلة حقن باستخدام طرف التحميل غرامة (20 ميكرولتر الكثير إيبندورف: W215818J).
3. تركيب إبرة في حو إبرةlder على المجهر مع أنابيب الضغط متصلة سيطرة إيبندورف نظام حقن.
4. العثور على جنين في إطار الهدف 40X والعثور على إبرة ظل دون تغيير البؤري عن طريق تحريك الإبرة في وسط الميدان النظر وخفض تدريجيا الى طائرة التنسيق الصحيح.
5. تحرك الجنين بلطف بعيدا للعثور على مربع صغير من ساترة مكسورة مسبقا التي شنت في نهاية واحدة من قطاع الغراء. بلطف جدا تحرك غيض إبرة حتى أنه يضرب على حافة ساترة المربع الصغير ويكسر برفق فتح.
6. نقل الأجنة إلى العرض مرة أخرى وحدد الجنين من السن المناسب للحقن. أنا عادة حقن الجنين في دورة تقسيم النووية في 5-7 حيث أن هذا هو قبل أن يهاجر إلى الخارج نوى إلى القشرة. يمكن تحديد مراحل دورة انقسام نووي بواسطة المسح السريع للإشارات فلوري من GFP-Cdc20 أو إشارة النووية لل2B RFP-هيستون قبل الحقن ^9.
7. تحرك بعناية امبريس بالقرب من إبرة وتعديل البؤري للجنين على حد سواء، وإبرة في. تحرك الجنين في إبر وحقن قطرة من الكاشف إلى الموضع المطلوب ونقل الجنين بعيدا (أو اتباع التعليمات لنظام microinjection). ويمكن حقن الجنين من الخلفية، أو من الجانب اعتمادا على الغرض من هذه التجربة.
8. حقن مرة واحدة في جنين جاهزة للتصوير في الوقت المناسب. (أنظر الشكل 2F & G)

8. ممثل النتائج

الشكل 1. المواد المطلوبة: 1. غرامة فرشاة القلم، ب. مربع صغير مكسور، نظارات حاوية، ج. 22 × 50 مم ساترة، د. شريحة المجهر، ه. على الوجهين شريط لاصق، و. جاف مسحوق الخميرة في أنبوب اختبار مع ثقوب على الغطاء، ز. خميرةحبيبة تستخدم لصيانة الطيران، ح. يطير قارورة الغذاء، وأنا. نصف من ملاقط المستخدمة لأجنة dechorionate، ي. 1 ملاقط الزوج، ك. هيبتان حاوية سائل الغراء (القارورة الحجمية).

الشكل 2. وتظهر الرسوم البيانية في إعداد coverslips والشرائح في الخطوة 4، dechorionation جنين في الخطوة 5 والاستعدادات لإبرة microinjection في الخطوة 7. أ. أعلى الصورة يظهر ساترة مع شريط من الغراء هيبتان عبر وسط ومربع صغير من ساترة كسر تمسك طرف واحد. في الصورة يظهر أسفل شريحة المجهر مع طبقة رقيقة من الماء في الزوايا الأربع لعقد ساترة. عن سبب استخدام شريحة لعقد ساترة هو الحفاظ على نفس المسافة تقريبا التنسيق كما أن وجدت عندما يكون لديك على الوجهين الشريط على الشرائح، وبالتالي تجنب إعادة تركيز المجهر بينما كنت عه تشريح ونقل الأجنة بين الشريط وساترة. B. شريحة بطول قصير من لاصق شفاف على الوجهين تطبيقها قبل تقشير قبالة ورقة تستخدم لتغطية dechorionating الجنين. C. الصورة على اليسار يظهر الأجنة بقذائف المشيماء سليمة مع تميزت نهايات الأمامي والخلفي، وصورة على اليمين يظهر الأجنة في قذائف المشيماء كسر قبل نقلوا على وساترة مع قطاع الغراء D & E رسم تخطيطي يظهر اثنين.. وسائل لنقل، ووضع ومواءمة الأجنة dechorionated على شرائط الغراء. كانت مغطاة أجنة من النفط 10S بعد فترة جفاف المناسبة. F & G. رسوما بيانية توضح كيفية فتح رأس الإبرة وضعه وذلك لحقن.

ويمكن الصور واحدة أو الفاصل الزمني، تم الحصول عليها من التجارب الموصوفة أعلاه تحليلها مباشرة باستخدام البرمجيات لايكا أو حفظها في ملفات TIF. باعتبارها FO المفتوحةوتناقش rmat المتاحة لمزيد من التحديد الكمي أو التحليلات التحرير باستخدام تحليل صورة أخرى شائعة برامج مثل J صورة، فوتوشوب وMetaMorph الخ وهناك مثالان لتوضيح هذا أدناه:

مثال 1: فيلم الوقت الفاصل بين (الشكل 3) يدل على تجنيد kinetochore دينامية GFP-Cdc20 والحركة كروموسوم في العيش أجنة ذبابة الفاكهة المخلوي. وكانت هذه المنطقة من اهتمام من الصور الأصلية تسلسل الوقت الفاصل مصمم / محمد ومؤتمتة، دفعة تحويلها باستخدام برنامج فوتوشوب. تم تجميعها في الفيلم باستخدام كويك تايم البرمجيات.

الشكل 3. فيلم الوقت الفاصل بين معارض توظيف kinetochore دينامية GFP-Cdc20 والحركة كروموسوم في العيش أجنة ذبابة الفاكهة المخلوي. (أ) أخذت الوقت الفاصل بين الصور من جنين 1 المخلوي المعدلة وراثيا شارك في التعبير عن GFP-Cdc20 (باللون الأخضر)وطلب تقديم العروض، هيستون سجلت 2B (باللون الأحمر) بروتينات اندماج واستخدام نظام لايكا SP2 TCS مبائر على 18 درجة مئوية خلال دورات تقسيم النووية 7-8. واتخذت إطارات كل 10 ثانية. يتم التعامل مع الإطار مع الخلايا بالفعل في الطور الأول باعتباره نقطة الصفر مرة ^10. انقر هنا لعرض فيلم عن 3A الشكل . (B) يمكن GFP-Cdc20 احظت بسهولة في الطور الأول وطليعة الطور التالي kinetochores (B3 و 4، والسهام البيضاء) و استمرت في الطورية وkinetochores طور الصعود (B5 و 6، والسهام البيضاء). يتم استبعاد GFP-Cdc20 من نواة الطور البيني (رأس السهم الأبيض)، وهو يدخل الى النواة التي الطور الأول في وقت مبكر. وتم تحديد morphologies باستخدام لونين التعاون التي تبديها His2BmRFP كعلامات (B8-14). معنى واحد فقط القضبان 5mm.

مثال 2: يمكن دراسة وظائف SAC عن طريق التلاعب في الأجنة عن طريق الأجسام المضادة microinjecting، والبروتينات fluorescently المسمى أو الكيماوياتمركبات لتر من الفائدة التي يحتمل أن تؤدي إلى SAC. لحقن الكولشيسين سبيل المثال ليزيل البلمرة ميكروتثبول حتى استفزاز SAC كما هو مبين في الشكل رقم 4 ^10.

الشكل 4. Mad2 أمر ضروري لالكولشيسين، تم استدعاؤه وظيفة SAC ^10. وعولج الأجنة ^EY mad2 مع الكولشيسين بواسطة microinjection؛ GFP-cdc20؛ mad2 ^{+ / +،} GFP-cdc20؛ (خالية متحولة mad2 ^{- - /)} وGFP-mad2 mad2 ^EY. أخذت الوقت الفاصل بين الصور مبائر قبل (01، 07 و 13) أو بعد حقن (02-06، لوحات أعلى؛ 08-12، لوحات الأوسط، 14-18، لوحات أسفل). GFP-Cdc20 استخدمت (لوحات العليا والمتوسطة) أو GFP-Mad2 (اللوحة السفلية) إشارات kinetochore كعلامات تقدم دورة الخلية. أعلى لوحة، وتبين الأسهم kinetochores اعتقلوا في 02-06. منطقة تميزت سهم في 01 يشير إلى أن قبل اكتشاف العلاج، GFP-Cوتستثنى من DC20 نواة الطور البيني في وقت متأخر. وسط لوحة، في غياب Mad2 الذاتية، GFP-Cdc20 إشارات تواصل التأرجح داخل وخارج النواة، وداخل وخارج kinetochores، على الرغم من الانقسام السيتوبلازمي يبدو أن معيبة، وسيتم كما هو متوقع في الأجنة التي تفتقر ميكروتثبول، في حضور من الكولشيسين (المشار إليها في الأسهم 07-12) مما يشير إلى وظيفة SAC فشلت في القبض على الخلايا في الاستجابة للعلاج. فشل فصل نواة ابنة في صور 10. اللوحة السفلية، رؤوس سهام في 14-18 تشير kinetochores اعتقل مع GFP-Mad2 المتراكمة بروتينات اندماج تشير إلى وظيفية GFP-Mad2 في إنقاذ النمط الظاهري عيب SAC في Mad2 الجنين المسخ. رأس السهم في 13 يشير GFP-Mad2 تراكم في نواة الطور البيني في وقت متأخر. منع = 5mm. وmicroinjected الأجنة مع ~ حجم بيضة 1٪ من حل كولشيسين الأسهم 100mg/ml في برنامج تلفزيوني × 1.

بروتوكول الموصوفة هنا هو طريقة عامة لتصوير الأجنة يطير المخلوي باستخدام TCS لايكا ليزر متحد البؤر SP2 مجهر المسح ويمكن تعديلها لتناسب أنظمة المجهر الأخرى، ويمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة وظائف الجينات الأخرى التي تستخدم أجنة ذبابة الفاكهة المخلوي. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة جوانب كثيرة من حاجز المغزل الجمعية، وديناميات البروتين والتحلل البروتيني بروتين باستخدام الذباب المعدلة وراثيا أو الأجسام المضادة بولكلونل لتصور توطين البروتين في عينات حية أو ثابت ^4،6،12-14.

فمن أبسط للحفاظ على الذباب في قوارير جديدة الغذائية ذبابة عند جمع أعداد صغيرة (~ 10 - 100) من البيض. وهذا يقلل من الازعاج من صنع وإعداد لوحات إضافية أجار عصير التفاح والغرف جمع البيض كما هو موضح في غيرها من المنشورات ^15،16. إضافة مربع صغير من زجاج مكسور ساترة في واحدة من نهاية الشريط الغراء على ساترة يجعل من الاسهل بكثيرلفتح إبرة وتحديد حجم حقن عن طريق ضبط إعدادات النظام microinjection بينما الإبرة وتخبط في مجال النفط 10S. درجة جفاف الجنين من المهم لنجاح الحقن في تجنب التسربات والحفاظ على سلامة الأجنة وخاصة لأولئك التجارب التي تحتاج إلى فترة طويلة من الوقت أو عندما رفع transformants بعد الحقن. ومع ذلك، لا توجد قاعدة ذهبية للبالضبط كيف طويل هو مطلوب جفاف. هذا يختلف من تجربة إلى تجربة ويعتمد على مقدار من الحل حقن والرطوبة في بيئة العمل.

يمكن التلاعب بها وظائف بروتين معين من الاهتمام من قبل microinjecting مثبطات بروتين معين، أحادية أو بولي نسيلي أجسام مضادة ضد بروتين معين، أو الحمض النووي الريبي رسول الببتيدات fluorescently المسمى تحت نوع البرية أو الخلفيات طفرة جينية. كثير من هذه الخطوط أو متحولة GFP الموسومة خطوط المعدلة وراثيا هي مركبات علناوترد ailable من مراكز الأوراق المالية ذبابة الفاكهة ومعظمها في Flybase ( http://flybase.org/~~V ) ويمكن البحث على الانترنت.

ليس لدينا ما يكشف.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول في إطار منحة يلكوم ترست. نشكر السيدة مورين سينكلير للحفاظ على مخزون الطاير وإعداد الطعام ذبابة على مر السنين. ونود أيضا أن نشكر السيد مايكل Aitchison لمساعدته وتقديم الدعم التقني في البلدان النامية من هذا البروتوكول.