JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقتصر المقايسات السمسة لقياس ردود الخلايا القاتلة الطبيعية lytic لفيروس نقص المناعة الخلايا المصابة بواسطة نقاء الخلايا المستهدفة. نظهر هنا عزلة سكان عالي النقاء من HIV - 1 المصابة الانفجارات تي خلية الأولية من خلال الاستفادة من القدرة HIV - 1 - s إلى أسفل تعدل CD4.

Abstract

الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا هي عنصر حيوي للاستجابة المناعية الفطرية إلى الخلايا المصابة بالفيروسات. من المهم أن نفهم قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية للاعتراف وليز HIV - 1 لتحديد الخلايا المصابة في وظيفة أي aberrancy الخلايا القاتلة الطبيعية ضد المصابين بفيروس الإيدز الخلايا يمكن ان تؤدي الى العلاجات التي من شأنها أن تعزز نشاطها لحل الخلايا. هناك حاجة لاستخدام بفيروس نقص المناعة البشرية الأولية تي خلية تفجيرات والخلايا المستهدفة بدلا ثم المصابة - T - خطوط خلية في المقايسات السمسة. تي خلية الخطوط ، حتى من دون إصابة ، معرضة جدا للتحلل الخلايا القاتلة الطبيعية. وعلاوة على ذلك ، فمن الضروري استخدام الخلايا الأولية ذاتي لمنع فئة كبيرة معقدة التوافق النسيجي أنا عدم التطابق بين الهدف والخلايا المستجيب من شأنها أن تؤدي في تحلل. فشلت الدراسات المبكرة تقييم الاستجابات الخلية لحل الخلايا القاتلة الطبيعية للخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية الأولية لإظهار قتل كبيرا من 1،2 الخلايا المصابة. ومع ذلك ، باستخدام HIV - 1 قد اصيبوا بالعدوى الأولية (خلايا تي) والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية المقايسات الفنية صعب بسبب وجود تلوث الخلايا غير المصابة 3. سوف تتعارض هذه الخلية المصابة إلى نسبة الخلايا غير المصابة في نتيجة التباين في قتل الخلايا القاتلة الطبيعية بين العينات التي قد لا تكون نتيجة لتباين في وظيفة الخلية المانحة ناغورني كاراباخ. وبالتالي ، سيكون من المفيد للعمل مع السكان الخلية المصابة تنقيته من أجل توحيد نسب المستجيب لاستهداف الخلايا التجارب بين 3،4. نحن هنا لشرح عزلة سكان عالي النقاء من الخلايا المصابة HIV - 1 من خلال الاستفادة من القدرة HIV - 1 في أسفل تعدل CD4 على الخلايا المصابة وتوافر مجموعات تجارية لإزالة الخلايا الميتة أو التي تحتضر 3-6. ويمكن عندئذ المصابين الأولية المنقى تي خلية تفجيرات استخدامها كأهداف في تحبب إما السامة للخلايا أو مقايسة مع تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية للسكان والمستجيب 5-7. استخدام الخلايا القاتلة الطبيعية كما المستجيبات في مقايسة تحبب بتقييم قدرة كوريا الشمالية على خلية للافراج عن محتويات lytic من 8 lysosomes المتخصصة تسمى "حبيبات لحل الخلايا". بواسطة تلطيخ مع الضد a مترافق ملون تألقي ضد CD107a ، وهو بروتين غشاء الليزوزومية أن يصبح أعربت على سطح الخلايا القاتلة الطبيعية عند حبيبات لحل الخلايا الصمامات إلى غشاء البلازما ، يمكن أن نحدد ما هي النسبة المئوية للخلايا NK degranulate ردا على استهداف الاعتراف الخلية. بدلا من ذلك ، يمكن تقييم نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية lytic في مقايسة السامة للخلايا التي تسمح لتحديد نسبة الخلايا المستهدفة من قبل lysed الافراج عن 51 ساعة معتمدة من داخل الخلية المستهدفة في وجود خلايا NK.

Protocol

1. عزلة الإنسان CD4 + T - خلايا من الدم المحيطي (انظر الشكل 1)

  1. ويتم جمع الدم الوريدي المحيطية (40-60 ملل) في Vacutainer الأنابيب التي تحتوي على الصوديوم الهيبارين (بيكتون ديكنسون).
  2. ثم يتم نقل الدم المحيطية من Vacutainer أنابيب أنابيب إلى 50 مل البوليسترين المخروطية (20 مليلتر من الدم في أنبوب).
  3. RosetteSep يضاف CD4 + T - الخليوي كاشف العزلة (StemCell تكنولوجيز) في حجم مل 1 إلى ما لا يزيد عن 20 مل من الدم في أنبوب 50 مل ويمزج جيدا.
  4. ومن ثم حضنت الخليط في 20-25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. بعد 20 دقيقة ، والكالسيوم والمغنيسيوم الحرة (CMF) الفوسفات مخزنة المالحة [PBS (HyClone] ث / 2 ٪ المعطل للحرارة (56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) مصل بقري جنيني [FBS (HyClone)] يضاف إلى خليط من أجل تحقيق وحدة تخزين النهائي من 40 مل.
  6. والطبقات ثم مخاليط المخفف (30 مل) على أعلى من 15 مل من متوسطة فصل الخلايا الليمفاوية [LSM (Cellgro)] جديدة في أنابيب مخروطية 50 مل البوليسترين.
  7. وطرد بعد ذلك في أنابيب سعة 50 مل ز × 1200 لمدة 20 دقيقة مع قبالة الفرامل.
  8. تتم إزالة 50 مل من أنابيب الطرد المركزي بعناية ، بحيث لا بالانزعاج واجهة بين LSM والمتوسطة. يتم جمع الخلايا في واجهة مع ماصة 10 مل وتوضع في أنابيب جديدة البوليسترين 50 مل المخروطية.
  9. والمخففة التي تم جمعها مع واجهات FBS PBS ث / 2 ٪ إلى الحجم النهائي من 50 مل.
  10. وطرد أنابيب سعة 50 مل يحتوي على واجهات المخفف في ز × 1200 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على.
  11. بعد الطرد المركزي ، ويستنشق في supernatants والكريات معلق في 10 مليليتر من ث PBS / FBS 2 ٪.
  12. ثم يتم الجمع بين الايقاف الخلية في أنبوب واحد مل 50 المخروطية والمخففة إلى 50 ملل مع ث PBS / FBS 2 ٪.
  13. يتم طرد الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية في الجمع بين ز × 300 لمدة 10 دقيقة لإزالة كافة LSM المتبقية.
  14. ويستنشق وطاف ومعلق ثم بيليه في 10 مليليتر من 1640 RPMI المتوسطة (HyClone) تحتوي على 10 ٪ FBS ، 100 U / مل من البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل من الستربتوميسين (HyClone) و 2 مم L - الجلوتامين (CellGro ) (RPMI - كاملة) وعدها باستخدام عدادة الكريات.
  15. ثم يتم ضبط تركيز المنقى CD4 + T - خلايا ل3x10 6 / مل مع RPMI - كاملة.
  16. CD4 + "يتم تحفيز ثم s بواسطة زرع لهم بالإضافة إلى anti-CD3/anti-CD28 الخرز [T - الخلية التوسع كيت (Miltenyi بيوتيك)] في حبات نسبة ثلاثة في زنزانة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5 ٪ 2 C0 الحاضنة.

2. إصابة CD4 + T - خلايا مع HIV - 1 (انظر الشكل 1)

  1. تتم إزالة تعليق الخلية التي تحتوي على حفز خلايا CD4 + T - خلايا من لوحة الثقافة وعدها باستخدام عدادة الكريات.
  2. تضاف CD4 + T - الخلايا (2x10 ~ 6) إلى أنبوب مخروطي 15 مل لاستخدامها كعامل السيطرة المعافين.
  3. ما تبقى من خلايا CD4 + T يوضع تعليق خلية في أنبوب مخروطي 50 مل للعدوى.
  4. ويستنشق الأنابيب التي تحتوي على خلايا CD4 + T - هي طرد خلية في تعليق ز × 300 لمدة 10 دقائق وطاف الثقافة.
  5. وحفزت معلق CD4 + T - خلايا مباشرة في السوائل التي تحتوي على الثقافة virions ثم تدور المصابين في ز × 1200 لمدة 2 ساعة في 20-25 درجة مئوية 9. عادة نحن تصيب CD4 + T - خلايا في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من (5) لسلالة تكرار فيروس نقص المناعة البشرية ناقصة (على سبيل المثال ، DHIV - 3) أو وزارة الداخلية an 0.01 لفيروس النسخ المتماثل المختصة (على سبيل المثال ، HIV - 1 NL4 / 3) . الحجم النهائي هو غير مهم ولكن يجب أن تكون متوازنة لأنابيب الطرد المركزي. يضاف Polybrene (سانتا كروز) إلى السائل الثقافة قبل spinfection عند تركيز 10 ميكروغرام النهائي / مل.
  6. عند الانتهاء من spinfection ، تتم إزالة الخلايا supernatants ومعلق في مناطق ذات كثافة خلية 3x10 6 / مليلتر في RPMI - تستكمل كاملة مع 100 U / مل IL - 2. الخلايا المصابة وغير المصابة هي ثقافة لمدة 72 ساعة إذا تم استخدام النسخ غير كفء لفيروس يصيب الخلية أو 5-7 أيام إذا تم استخدام الفيروس المتماثل المختصة لتصيب الخلايا. وينبغي تغيير كل 48 ساعة وسائل الاعلام خلال الثقافة.

3. عزلة الإنسان الخلايا الطبيعية القاتلة من الدم المحيطي

  1. ويتم جمع الدم الوريدي المحيطي (~ 100 مل) من الجهة المانحة نفسها التي استخدمت لعزل خلايا CD4 + T - الخلايا في Vacutainer الأنابيب التي تحتوي على الصوديوم الهيبارين (بيكتون ديكنسون).
  2. ثم يتم نقل الدم من Vacutainer أنابيب في أنابيب مخروطية 50 مل في 20 مل aliquots.
  3. وVacutainer ثم يتم غسل الأنابيب مع 8 مل من محلول ملح CMF هانكس المتوازن [HBSS (Hyclone)] ويتم نقل يغسل إلى containi conicals 50 ملنانوغرام في 20 مليلتر من الدم المحيطي. حجم الناتج في كل المخروطية هو 35 مل 50 مل.
  4. ومن ثم الطبقات الدم المخفف على أعلى من 15 مل من LSM في أنبوب جديد 50 مل المخروطية وأنابيب في طرد ز × 400 لمدة 30 دقيقة مع قبالة الفرامل.
  5. تتم إزالة الأنابيب بعناية من أجهزة الطرد المركزي ويتم حصادها واجهة الناتجة بين LSM والمتوسطة من كل أنبوب 10 مل باستخدام ماصة ، ووضعها في أنابيب مخروطية 50 مل الطازجة.
  6. يتم غسلها مرة واحدة مع ايقاف خلية HBSS CMF (طرد في ز × 400 لمدة 15 دقيقة مع الفرامل على).
  7. بعد غسل الأولى هي إزالة supernatants ويتم الجمع بين الكريات الناتجة إلى 50 مليلتر واحد المخروطية وغسلها مرتين مع HBSS CMF (طرد في غرام × 30 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على) لإزالة جميع LSM المتبقية.
  8. بعد غسل والأخير هو resupended بيليه في 10 مل من تحلل ACK العازلة (150 ملي NH 4 CL ، 1.0 ملم KHCO 3 و 0.1 ملم EDTA الرقم الهيدروجيني 7.3) وحضنت في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة كانت ضرورية من أجل إزالة تلويث الكريات الحمراء من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC).
  9. بعد 10 دقيقة. يضاف 40 مل من برنامج تلفزيوني CMF إلى تعليق الخلية من أجل وقف تفاعل تحلل.
  10. ثم يتم طرد الأنبوب مع تعليق الخلية التي تحتوي على كرات الدم الحمراء وPBMC lysed في ز × 300 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على.
  11. تتم إزالة وطاف بيليه معلق في 5 مل من برنامج تلفزيوني مع FBS 2 ٪ و 2 ملم وEDTA عدها باستخدام عدادة الكريات.
  12. ثم يتم عزل الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا من PBMC باستخدام عزل الخلايا القاتلة الطبيعية كيت [الاختيارات البشرية السلبية (Miltenyi بيوتيك)] وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
  13. يتم جمعها من خلال تدفق من الأعمدة في أنابيب 15ml وطرد الأنابيب في ز × 300 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على.
  14. تتم إزالة supernatants ومعلق الكريات. يتم الجمع بين الكريات معلق في أنبوب واحد في مجموع حجم 1 مل من متوسطة Iscove في التعديل Dulbecco ل[IMDM (Gibco)] تستكمل مع 10 ٪ المصل + الحرارة المعطل (56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) AB الإنسان (HS) ، وأحصى مع عدادة الكريات.
  15. يتم ضبط حجم الخلية مع التعليق HS IMDM w/10 ٪ بحيث الكثافة النهائية من الخلايا القاتلة الطبيعية هي 3x10 6 / مليلتر. يتم تقسيم خلية في تعليق نصف. مجموعة واحدة من خلايا NK يتلقى 200 U / مل من المؤتلف انترلوكين 2 - الإنسان. ترك مجموعة أخرى من الخلايا في وسيط وبدون العلاج خلوى.
  16. ثم يتم تحضين الثقافات الخلية ناغورني كاراباخ بين عشية وضحاها في 37 ° C CO ، 5 ٪ 2
  17. ثم يتم استخدام هذه الخلايا مثل الخلايا القاتلة الطبيعية الناتجة عن المستجيب إما مقايسة تحبب CD107a أو 51 مقايسة الافراج الكروم.

4. تنقية الخلايا المصابة HIV - 1 (انظر الشكل 1)

  1. يتم إزالة السوائل التي تحتوي على الخلايا المصابة ثقافة من لوحات وطرد في ز × 300 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على.
  2. ويستنشق وطاف ومعلق الكريات في 2 مل من برنامج تلفزيوني مع FBS 2 ٪ و 2 ملم وEDTA الخلايا تحسب على عدادة الكريات.
  3. يتم عزل الخلايا المصابة التي لا تحتوي على HIV - 1 بعيدا عن تلك التي تؤوي الفيروس عن طريق الاستفادة من حقيقة أن HIV - 1 ينظم باستمرار CD4. لهذا الغرض يستخدم CD4 الإيجابية كيت عزل (Invitrogen) وفقا لتعليمات الشركات المصنعة مع الاستثناء الذي يستخدم أحدهما - CD4 حبة في نسبة الخلايا.
  4. عند إزالة CD4 + T - الخلايا ، وإزالة الخلايا الميتة من السكان الخلية المنقى بإيواء الفيروس باستخدام إزالة الخلايا الميت كيت (Miltenyi بيوتيك) وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
  5. يتم طرد تدفق من خلال إزالة الخلايا التالية القتلى في الأعمدة في غ × 300 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على. معلق الكريات إزالة طاف ، في 1 مل كاملة ، RPMI ويتم عد الخلايا.
  6. الخلايا المصابة المنقى الآن جاهز للاستخدام كأهداف في مقايسة تحبب CD107a أو 51 مقايسة الافراج الكروم.

5. CD107a الفحص تحبب (انظر الشكل 2)

  1. تتم إزالة مزارع الخلايا القاتلة الطبيعية من لوحات ويسجل تعليق الخلية.
  2. وطرد تعليق خلية في ناغورني كاراباخ ز × 300 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على.
  3. ومعلق الخلايا القاتلة الطبيعية في إكمال - RPMI وتركيز النهائية المعدلة للخلايا 6 10 / مل.
  4. وطرد من الايقاف الخلية المصابة وغير المصابة عزل خلايا تي التي تم إنشاؤها في الخطوات المذكورة أعلاه في ز × 300 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على.
  5. تتم إزالة Supernatants وكريات معلق في إكمال - RPMI في الخلايا 2x10 6 / مليلتر.
  6. وتستخدم الخلايا K562 بأنها إيجابية الخلايا المستهدفة السيطرة ، كما هي عرضة للتحلل ناغورني كاراباخ. Tوكان طرد في الخلايا ز × 300 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل ، يتم إزالة supernatants ومعلق في كريات RPMI - الكامل في الخلايا 2x10 6 / مل
  7. في 96 - V - 100 لوحة القاع جيدا تضاف MCL الأهداف و 100 المستجيبات MCL إلى الآبار.
  8. وسوف يتم استخدام تحتوي على 100 و 100 المستجيبات mcLof MCL من وسيط وبدون الخلايا المستهدفة للمنظمات غير محددة تحبب الخلايا القاتلة الطبيعية.
  9. إلى كل بئر 10 - mcLFITC مترافق CD107a المضادة (BDIS) يضاف.
  10. ثم يتم طرد في لوحة ز × 20 لمدة 2 دقيقة مع الفرامل على.
  11. والمحتضنة لوحة بالطرد المركزي لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
  12. بعد طرد الحضانة في لوحة ز × 400 لمدة 5 دقائق مع الفرامل على.
  13. تتم إزالة طاف من بيليه.
  14. ثم اتسخت كل بئر مع فريق التالية ملون تألقي ، مترافق الأضداد على الجليد لمدة 20 دقيقة في ما مجموعه 100 العازلة تدفق mcLof (PBS ث / FBS 2 ٪ و 0.1 ٪ نان 3)
    1. anti-CD3/14/20 [بلو مترافق المحيط الهادئ (Biolegend)]
    2. مكافحة CD56 [APC (Biolegend)]
  15. بعد 20 دقيقة الحضانة ، يتم إضافة 200 MCL العازلة من التدفق إلى كل بئر ، وطرد في لوحة ز × 400 لمدة 5 دقائق مع الفرامل على.
  16. ومن ثم تدفق العازلة يستنشق بعناية من كل بئر باستخدام الماصة 2 مل الشفط مزودة غيض 200 micropipet MCL حين التأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
  17. يتم تكرار الخطوة 15 و 16 مرة أخرى.
  18. والكريات معلق في 200 MCL من بارافورمالدهيد 1 ٪ في برنامج تلفزيوني CMF. يتم نقلها بعد ذلك إلى تعليق الخلية أنابيب التدفق.
  19. يتم إحضارها إجمالي حجم ما يصل الى 300 MCL بإضافة ~ 100 MCL بارافورمالدهيد من 1 ٪ في برنامج تلفزيوني CMF لكل أنبوب.
  20. يتم جمع هذه الأحداث (2x10 4) المقابلة لخلايا NK بواسطة تدفق عداد الكريات باستخدام DIVA FACS (BDIS) لاقتناء البرمجيات وتحليلها باستخدام تدفق جو البرمجيات (TreeStar).

6. CD107a المحاصرة الاستراتيجية (انظر الشكل 3)

  1. يتم إنشاء بوابات باستخدام خلية واحدة إلى الأمام على ارتفاع مبعثر (FSC - H) مقابل عرض مبعثر إلى الأمام (FSC - W) المؤامرة.
  2. عن حجم المؤامرة ضد تحبب يتم إنشاء الجانب ضد FSC مبعثر (SSC) مؤامرة على البوابة خلية واحدة. عادة الخلايا الليمفاوية وتحبب منخفضة نسبيا والمتوسطة الحجم الخلية.
  3. ثم يتم رسم الخلايا اللمفاوية في البوابة في مؤامرة نقطة من الخلايا CD3/14/20 ملطخة مقابل CD56 الخلايا الملون إلى بوابة على الخلايا القاتلة الطبيعية في حين حذف حيدات (CD14) ، الخلايا التائية (CD3) وخلايا B - ( CD20).
  4. ثم يتم تقييم السكان CD56 بوابات نقاط البيع لCD107a.
  5. يتم استخدام الخلايا القاتلة الطبيعية من دون أهداف المجموعة إلى تعيين غيتس على ما يعتبر CD107a سلبية.

7 (51). الفحص النسخة الكروم (انظر الشكل 4)

  1. وصفت إصابة الخلايا المستهدفة ب 125 ريال برازيلي 51 mcCi (بيركن إلمر) في saline/10 6 خلايا لمدة 2 ساعة في ما مجموعه 500 MCL عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. كعنصر تحكم إيجابية وصفت 10 6 K562 الخلايا مع 100 ريال برازيلي 51 ساعة لمدة 2 mcCi في ما مجموعه 500 MCL عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. يتم إحضارها إجمالي حجم ما يصل الى 500 - MCL مع RPMI كاملة. يتم حساب حجم من 51 ساعة معتمدة إضافة إلى الخلايا المستهدفة هنا : (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm؟Mode=RadioactivityCalculator)
  2. في حين أن الخلايا المستهدفة هي وضع العلامات ، تتم إزالة الخلايا القاتلة الطبيعية المعزولة سابقا من الثقافة وفرزها. وطرد الثقافات الخلية التي تحتوي على خلايا NK ز × 300 لمدة 10 دقيقة مع الفرامل على.
  3. وتحتوي على كريات معلق الخلايا القاتلة الطبيعية في إكمال - RPMI وتنقسم الى 3 الأنابيب. يتم ضبط كثافة الخلية إلى 10 / 5 مل في أنبوب واحد ، 2.5x10 5 / مل في الأنبوب الثاني و5x10 5 / مل في أنبوب ثالث.
  4. تتم إزالة الخلايا المسمى أهداف من الحاضنة ويضاف 4.5 مل من RPMI - الكامل لكل أنبوب. وطرد بعد ذلك في أنابيب GF × 300 أو 10 دقائق.
  5. يسكب طاف قبالة بعناية حتى لا تعكر صفو بيليه في حاوية للنفايات السائلة المشعة.
  6. يتم تكرار الخطوات من 4 و 5 مرتين لازالة كل الغير ممتص 51 الكروم. يمكن التخلص من غسل Supernatants الثالثة في حاوية للنفايات المشعة غير السائلة.
  7. ثم يتم معلق في استكمال أهداف المسمى - RPMI إلى كثافة الخلية النهائية من 10 / 5 مل.
  8. وaliquoted 100 MCL الأهداف المسمى في الآبار لوحة 96 - V - أسفل جيدا لعدد خلية من خلايا الهدف النهائي 10 / 4 أيضا.
  9. Table1 هو مثال نموذجي للإعداد لإطلاق سراح 51 مقايسة الكروم. ويتم كل مجموعة من ثلاث نسخ.
    3
    1 2 4 5 6 7 8 9
    A K562 E : T (1:1) K562 E : T (1:1) K562 E : T (1:1) K562 E : T (2.5:1) K562 E : T (2.5:1) K562 E : T (2.5:1) K562 E : T (5:1) K562 E : T (5:1) K562 E : T (5:1)
    B UI E : T (1:1) UI E : T (1:1) UI E : T (1:1) UI E : T (2.5:1) UI E : T (2.5:1) UI E : T (2.5:1) UI E : T (5:1) UI E : T (5:1) UI E : T (5:1)
    C HIV - 1 E المصابة : T (1:1) HIV - 1 E المصابة : T (1:1) HIV - 1 E المصابة : T (1:1) HIV - 1 E المصابة : T (2.5:1) HIV - 1 E المصابة : T (2.5:1) HIV - 1 E المصابة : T (2.5:1) HIV - 1 E المصابة : T (1:1) HIV - 1 E المصابة : T (1:1) HIV - 1 E المصابة : T (1:1)
    D
    E
    F K562 النسخة العفوي K562 النسخة العفوي K562 النسخة العفوي واجهة النسخة العفوي واجهة النسخة العفوي واجهة النسخة العفوي HIV - 1 النسخة العفوي المصابة HIV - 1 النسخة العفوي المصابة HIV - 1 النسخة العفوي المصابة
    G K562 النسخة الأقصى K562 النسخة الأقصى K562 النسخة الأقصى واجهة النسخة الأقصى واجهة النسخة الأقصى واجهة النسخة الأقصى HIV - 1 النسخة المصابة Maxmum HIV - 1 النسخة المصابة Maxmum HIV - 1 النسخة المصابة Maxmum
  10. تضاف 100 MCL من الايقاف الخلية NK أعلاه إلى كل الخلايا التي تحتوي على الهدف جيدا.
  11. تضاف 100 MCL من الأهداف إلى الآبار المقابلة في الخلايا التي المستجيب غائبة عن الجماعات عن الحد الأقصى وعفوية. وحضنت المجموعة الإفراج عفوية مع MCL 100 - RPMI إضافية كاملة.
  12. وطرد لوحة 96 - جيدا في غرام × 20 لمدة 2 دقيقة مع الفرامل على.
  13. والمحتضنة لوحة ثم بالطرد المركزي عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لمدة 4 ساعات.
  14. بعد 4 ساعات MCL 5 الحضانة لتخفيف 1:10 من خلايا الدم الحمراء في RPMI - الكامل يضاف إلى كل بئر من الآبار إلا عن الحد الأقصى.
  15. يضاف 100 MCL 10 ٪ سلفات الصوديوم دوديسيل إلى الآبار عن الحد الأقصى.
  16. وطرد لوحة في ز × 400 لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه.
  17. تحصد 100 MCL من الخلايا خالية من كل طاف جيدا وتوضع في أنابيب أشعة غاما مضادة منفصلة (بيركن إلمر). يتم وضع الأنابيب في عداد 2470 غاما التلقائية (بيركن إلمر). وتقاس كمية الكروم 51 الحالي في السائل إلى الثقافة باعتبارها تهم للدقيقة الواحدة من متوسط ​​قراءة 2 دقيقة.
  18. وتستخدم تهمة في الدقيقة (CPM) قراءات من العينات والضوابط لحساب تحلل ٪ معينة باستخدام المعادلة التالية :
    [(CPM التجريبية -- يعني من العفوية CPM) / (متوسط ​​CPM الأقصى -- يعني عفوية CPM)] × 100

8. ممثل النتائج :

figure-protocol-21032
الشكل 1. الخطوات المتبعة في عزل الخلايا القاتلة الطبيعية وتوليد HIV - 1 الخلايا المستهدفة المصابة من الدم المحيطي.

figure-protocol-21302
الشكل 2. الخطوات المتبعة في بناء مقايسة تحبب CD107a باستخدام الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا والمستجيبات K562 ، مصابة CD4 + T - الخلايا والمصابين HIV - 1 - T خلايا كأهداف.

figure-protocol-21631
الشكل 3. التدفق الخلوي ، تبوب استراتيجية لفحص تحبب CD107a (A) المحاصرة على الخلايا واحد واستبعاد أو كتل doublets على قطعة FSC - A (إلى الأمام منطقة مبعثر) مقابل FSC - H (إلى الأمام ارتفاع مبعثر). (ب) رسم خلية واحدة كما ان بوابة FSC - المعزولة مقابل (مبعثر الجانب) SSC على السكان لمفاوية. (C) كما خططوا اللمفاويات بوابة CD3/14/20(خلايا تي ، وحيدات ، الخلايا البائية) مقابل CD56 (خلايا NK) تبوب على السكان POS CD56 NEG andCD3/14/20 (NK البوابة). (D) تآمر ضد كوريا الشمالية كما بوابة CD107a CD56 لتصور الخلايا القاتلة الطبيعية التي degranulated (CD107a POS).

figure-protocol-22375
الشكل 4. الخطوات التي تساهم في بناء لاطلاق سراح 51 مقايسة الكروم باستخدام الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا والمستجيبات K562 ، مصابة CD4 + T - الخلايا والمصابين HIV - 1 - T خلايا كأهداف.

figure-protocol-22728
الشكل 5. نتائج ممثلة لتقييم استجابة السامة للخلايا القاتل الطبيعي ضد HIV - 1 الخلايا المصابة : (أ) قيمت الخلايا القاتلة الطبيعية لقدرتها على degranulate دون أهداف ، واستجابة لK562 خلايا CD4 الابتدائية + تي الخلايا وفيروس نقص المناعة البشرية المصابة الأولية (خلايا تي) وفقا لتقييم نسبة الخلايا القاتلة الطبيعية التي CD107a سطح التعبير. الارقام الواردة في كل رباعي تمثل نسبة مئوية من مجموع الخلايا القاتلة الطبيعية. ب) يتم تقييم الخلايا القاتلة الطبيعية لقدرتها على ليز K562 خلايا CD4 + T - المعافين الخلية وHIV - 1 - T المصابة الخلايا في مقايسة 51 الإفراج الكروم في خلية المستجيب نسب مختلفة لاستهداف الخلايا (E : T).

Discussion

عندما يوظف بشكل صحيح يجب أن المقايسات الموصوفة في هذا البروتوكول تقديم صورة ممثل قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية لdegranulate ضد وليز HIV - 1 الخلايا المصابة (انظر الشكل 5). وينبغي أن تحبب الخلايا القاتلة الطبيعية في التصدي للفيروس الخلايا المصابة والخلايا القاتلة الطبيعية تحلل الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية يكون متناسبا بشكل مباشر 10. نتائج موثوق بها لفحوصات two الخلية NK الوظيفية لقياس ردود السامة للخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية خلايا تعتمد على عزل عالي النقاء الخلايا القاتلة الطبيعية ، فضلا عن سكان عالي النقاء من الخلايا المصابة. طهارة والخلايا القاتلة الطبيعية HIV - 1. الخلايا المصابة هي حاسمة لتحقيق المستجيب دقيقة إلى حد ما لاستهداف نسبة الخلايا وبالمثل ، وإزالة الخلايا الميتة وأفكارك من السكان الخلية الهدف المهم قبل وضع العلامات الكروم 51 أو الحضانة مع الخلايا المستجيب (51). الكروم يمكن استيعابها من قبل الخلايا التي تشهد موت الخلايا المبرمج وجود الخلايا الميتة أو أفكارك خلال النظائر خطوة الوسم وسوف يؤدي إلى الإفراج عن عفوية عالية ، وسوف يشوه تحلل ٪ محسوبة محددة. وعلاوة على ذلك ، قد وجود الخلايا الميتة أو أفكارك الزناد NK تحبب الخلايا مما يؤدي إلى مستويات مرتفعة بشكل غير طبيعي التعبير CD107a. pipetting الدقيق ضروري عند إزالة supernatants خالية من الخلايا بعد حضانة الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المستهدفة في المقايسات 51 الإفراج الكروم ، والاختلافات في حجم طاف إزالتها من كل تتكاثر بشكل جيد وسوف يؤدي إلى انحراف مستوى عال. ويمكن إجراء تعديلات على هذه البروتوكولات لتقييم دور مستقبلات محددة في ناغورني كاراباخ ادى تحلل الخلايا القاتلة الطبيعية من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية التي يحتضنها والمستجيبات أو أهداف مسبقة للثقافة بالتعاون مع الأجسام المضادة لمستقبلات معينة معادية أو يغاندس 6،11. ويمكن استخدام المعالجة خلوى الخلايا القاتلة الطبيعية (على سبيل المثال ، IL - 2 ، IL - 15) لتقييم وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية حفزت 12. وبالمثل ، قد يتم تنفيذ المقايسات الضد السمسة تعتمد الخلية باستخدام هذه البروتوكولات. يمكن أن تضاف لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية الأضداد (على سبيل المثال ، ومكافحة gp120) إلى الخلايا المستهدفة للاعتراف الخلية المنخفض NK مستقبلات القطعة Fc تقارب 13 CD16. هذه المقايسات ، على الرغم من تشكيل لقياس استجابات الخلايا السامة للخلايا NK إلى الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، ويمكن أيضا أن يتم تعديل لقياس قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية لإنتاج السيتوكينات التالية الاعتراف الخلية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. على الرغم من أننا الموصوفة في هذا البروتوكول استخدام الخلايا في المختبر المصابة والخلايا المستهدفة وصفت لنا في الآونة الأخيرة جيل من الخلايا المستهدفة من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. هذا يتطلب عزل خلايا CD4 + T - خلايا تليها توسيع الخلايا على مدى فترة أسبوعين بعد التحفيز مع mitogens في حضور انترلوكين 2 11. بعد فترة اسبوعين للتوسع ، يتم استخدام البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة لعزل الخلايا المستهدفة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)BD Biosciences367874
RosetteSep CD4+ T-cell Isolation KitStem Cell Technologies15062
CMF PBSHycloneSH30256.01
FBSHyclone10437-028
Lymphocyte Separation MediumCellgro25-072-CV
RPMI-1640HycloneSH30096.01
Penicillin / StreptomycinHycloneSV30010
L-glutamineCellgro25-005-Cl
T-cell Expansion KitMiltenyi Biotec130-091-441
CMF HBSS (1x)HycloneSH30588.01
0.5M EDTA46-034-Cl
NK Cell Negative Isolation KitMiltenyi Biotec130-092-657
IMDMGIBCO, by Life Technologies12440-046
CD4+ Positive Isolation KitInvitrogen113.31D
Dead Cell Removal KitMiltenyi Biotec130-090-101
PolybreneSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-134220
CD3 PacificBlueBD Biosciences558117
CD14 PacificBlueBiolegend325616
CD20 PacificBlueBiolegend302328
CD56 APCBiolegend318310
CD69 PEBD Biosciences555531
CD107a FITCBD Biosciences555800
51ChromiumPerkinElmer, Inc.NEZ030002MC
Gamma Counter TubesPerkinElmer, Inc.1270-401
2470 Automatic Gamma CounterPerkinElmer, Inc.2470-0050
FACS DivaBD Biosciences643629
FlowJoTree Star, Inc.FJ-9-1YR

References

  1. Ruscetti, F. W. Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells. J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).
  2. Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets. J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).
  3. Ferrari, G. Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).
  4. Shankar, P. Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection. Blood. 96, 3094-3101 (2000).
  5. Ward, J. HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response. PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).
  6. Ward, J. HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts. Blood. 110, 1207-1214 (2007).
  7. Bonaparte, M. I., Barker, E. Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules. Blood. 104, 2087-2094 (2004).
  8. Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).
  9. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 74, 10074-10080 (2000).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Fogli, M. Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals. PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).
  12. Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells. J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).
  13. Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts. Aids. 18, 1769-1779 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

49 HIV 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved