Bu çalışmada, kriyo-elektron tomografi verilerini segmentlere ayırmak için SciGlass yazılımını kullanan bir protokolü açıklıyoruz. SciGlass, cryo-ET telegramlarını segmentlere ayırmak için sürükleyici ve sezgisel bir arayüz sağlayan sanal gerçeklik tabanlı bir yazılımdır, VR'nin cryo-ET segmentasyon boru hatlarına entegre edilebilecek uygun bir araç olduğunu gösteriyoruz. Cryo-ET, yeniliklerle hızla ilerliyor ve odaklanıyor.
Daha ince numuneler ve daha hızlı veri toplama yöntemleri için ve segmentli parçacık toplamayı geliştirmek için makine öğrenimi algoritmalarını kullanmak için, bilirsiniz, tüm bu gelişmeler daha iyi kriyo-ET ve gerçekten harika biyolojik içgörülerin benimsenmesiyle sonuçlanır. Cryo-ET, düşük verimli kriyo gibi zorluklarla karşı karşıyadır. 500 nanometreden daha kalın numuneler ve düşük kopya sayıları nedeniyle ilgilenilen bölgeleri hedeflemede zorluk için.
Ek olarak, veri işleme bir darboğaz olmaya devam ediyor ve parçacık toplama ve segmentasyon için kapsamlı manuel açıklama gerektiriyor ve kriyo-ET'de ihtiyaç duyduğunuz özel uzmanlığın yanı sıra, genel iş akışını yavaşlatıyor. Sanal gerçekliğin geleneksel yöntemlere kıyasla segmentasyon verimliliğini artırdığını bulduk. Sürükleyici ortamı, boşlukları doldurarak ve yanlış pozitifleri azaltarak otomatik yaklaşımları tamamlar.
Ek olarak, bu VR platformu eğitim ve öğretim için oldukça etkilidir ve bu da onu kriyo-ET veri analizinde çok yönlü bir araç haline getirir. Protokolümüz, manuel ve yavaş, zor süreçleri içeren geleneksel segmentasyonun verimsizliğini ele alır, bu nedenle, sanal gerçekliğin sürükleyici ve sezgisel doğasından yararlanarak, süreci daha hızlı ve daha kullanıcı dostu hale getirerek segmentasyonu kolaylaştırmayı amaçlıyoruz. Başlamak için, ham cryo-ET tomogramlarını TIFF yığınları gibi SciGlass ile uyumlu bir veri formatına dönüştürün.
Parçacıkların siyah üzerine beyaz olduğundan emin olmak için ImageJ kullanarak sinyali ayarlayın. İşlem'e gidin, ardından Kontrastı Artır'a gidin ve Histogramı Eşitle'yi kontrol edin"ve Tüm dilimleri işleyin. Bilgisayarda sanal gerçeklik yazılımını başlatın.
Dosya" menüsüne gidin ve Proje Oluştur'u seçin. Yazılımda Yeni Proje Oluştur'a ve ardından Dosya Ekle'ye tıklayın. TIFF dosyalarının konumuna gidin ve bunları projeye aktarın.
İstendiğinde, No.Next'e tıkladıktan sonra dosyaların bir zaman serisinin parçası olmadığını onaylayın, projeye bir ad atayın ve projeyi proje listesi altında oluşturmak için Kaydet'e tıklayın. Tomogramı açmak ve etkileşimli sanal gerçeklik ortamına yüklemek için projeye çift tıklayın. Sanal gerçekliği veya VR'yi kurmak için VR kulaklığını ve el kumandalarını bilgisayara bağlayın.
VR ortamını kalibre etmek için ekrandaki talimatları izleyin. Segmentasyon için istenen alanın VR ortamının görüş alanında olduğundan emin olmak için sistemi ayarlayın, ardından yazılım arayüzündeki görselleştirme düğmesine tıklayın. Sinyali geliştirmek ve gürültüyü en aza indirmek için kontrast, pencereleme, parlaklık ve eşik kaydırıcıları gibi görselleştirme seçeneklerini ayarlayın.
Tommogramı yaklaştırmak veya daha iyi incelemek için itmek için el kumandalarını kullanın. Sol el kumandasını kullanarak kesme aletini etkinleştirin. Tomogram içindeki farklı dilimleri görsel olarak inceleyin.
Tomogramda, segmentasyonun başlayacağı istediğiniz dilime gidin. El kumandalarını kullanarak açıklama menüsü altındaki ilgi bölgesi veya ROI seçeneğini etkinleştirin. Tomogramda yeşil bir kutu görünecektir.
Yeşil kutunun boyutunu ve konumunu bölümlere ayrılacak alana göre ayarlayın. Şimdi, sol el kumandasını kullanarak ROI'yi kilitleyin. Araç, segmentasyon için boyama moduna geçecektir.
Hassas segmentasyon için tomografiyi yakınlaştırın veya uzaklaştırın. Optimum kontrol için boya fırçası boyutunu saat yönünde veya saat yönünün tersine çevirerek ayarlayın. Mitokondriyal zarlar gibi ilgilenilen bölgeyi üç boyutlu alan içinde dikkatlice bölümlere ayırın.
Segmentasyonu gerçekleştirirken top yarıçapını uygun şekilde ayarlayın. Segmentasyon hatalarını düzeltmek için ikincil denetleyici tetiğini kullanarak silme modunu devreye alın ve silmek için segmentasyonla aynı hareketi kullanın. Tomogram tamamen bölümlere ayrılana kadar tüm bölgeler için segmentasyon işlemini tekrarlayın.
Segmentasyonu tamamladıktan sonra, vurgulamak için tamamlanan projeye tıklayın. Devam etmek için "Projeler" sekmesine tıklayın ve "ROI'ler"i seçin. Birimin tamamını veya belirli bir ilgi alanını dışa aktarmayı seçin ve segmentlere ayrılmış veriler için dışa aktarma konumunu belirtin.
Şimdi, dışa aktarılan bölümlere ayrılmış verileri SciGlass'tan bölümlere ayrılmış verilerin ek analizi için tercih edilen istenen yazılıma yükleyin ve analiz edin. Cryo-ET verilerini hazırladıktan sonra, projeye sağ tıklayın ve Maske Verileri Ekle'ye tıklayın, ardından ilk segmentasyonun kaydedildiği yere gidin ve aynı proje altında içe aktarın. İlk segmentasyonda düzenlemeler yapmak için ROI ek açıklamasını kullanın.
Son olarak, ilk segmentasyonu temizlemek için segmentasyon ekleyin veya silin. Piksel başına 16 angstrom olarak yeniden yapılandırılan tomogramların ağırlıklı geri projeksiyonu, gürültü giderme ve eksik kama düzeltmesini takiben mitokondriyal ve membranöz yapıları ortaya çıkardı. Sürükleyici bir sanal gerçeklik ortamında görselleştirme, histogram eşitlemesi kontrastı artırdıktan sonra membranların ayrıntılı 3D incelemesini mümkün kıldı.
Manuel segmentasyon, membran sınırlarının ve ROI'lerin hassas haritalanması da dahil olmak üzere VR araçlarını kullanarak mitokondriyal ve organel yapılarını yüksek doğrulukla tanımladı. Son 3D görüntüler, dış ve iç zarlar gibi ayrıntılı mitokondriyal özellikleri ortaya çıkardı. Ve düzleştirilmiş ağlara sahip kalsiyum fosfat birikintileri.
