In questo lavoro, descriviamo un protocollo che utilizza il software SciGlass per segmentare i dati di tomografia crioelettronica. SciGlass è un software basato sulla realtà virtuale che fornisce un'interfaccia immersiva e intuitiva per la segmentazione dei telegrammi crio-ET, dimostriamo che la realtà virtuale è uno strumento praticabile che può essere integrato nelle pipeline di segmentazione crio-ET. Cryo-ET sta avanzando rapidamente con, sai, innovazioni e mirate.
Per campioni più sottili e metodi di raccolta dati più rapidi, e l'utilizzo di algoritmi di apprendimento automatico per migliorare il prelievo di particelle segmentate, tutti questi progressi culminano in una migliore crio-ET e nell'adozione di intuizioni biologiche davvero eccezionali. Cryo-ET affronta sfide come la crioterapia a bassa produttività. Per campioni più spessi di 500 nanometri e difficoltà a individuare le regioni di interesse a causa del basso numero di copie.
Inoltre, l'elaborazione dei dati rimane un collo di bottiglia, che richiede un'ampia annotazione manuale per il prelievo e la segmentazione delle particelle, insieme alle competenze specialistiche di cui hai bisogno nel crio-ET, quindi tutto ciò rallenta il flusso di lavoro complessivo. Abbiamo scoperto che la realtà virtuale migliora l'efficienza della segmentazione rispetto ai metodi tradizionali. Il suo ambiente immersivo integra gli approcci automatizzati colmando le lacune e riducendo i falsi positivi.
Inoltre, questa piattaforma VR è molto efficace per la formazione e l'istruzione, il che la rende uno strumento versatile nell'analisi dei dati crio-ET. Il nostro protocollo affronta l'inefficienza della segmentazione tradizionale, che include processi manuali e lenti e difficili, quindi sfruttando, sai, la natura immersiva e intuitiva della realtà virtuale, miriamo a semplificare la segmentazione rendendo il processo più veloce e più facile da usare. Per iniziare, converti i tomogrammi crio-ET grezzi in un formato di dati compatibile con SciGlass, come gli stack TIFF.
Impostare il segnale utilizzando ImageJ per assicurarsi che le particelle siano bianche su nero. Passa a Elabora, seguito da Migliora contrasto e seleziona Equalizza istogramma ed elabora tutte le sezioni. Avvia il software di realtà virtuale sul computer.
Vai al menu File" e seleziona Crea progetto. Fare clic su Crea nuovo progetto, quindi su Aggiungi file"nel software. Individuate la posizione dei file TIFF e importateli nel progetto.
Quando richiesto, verificare che i file non facciano parte di una serie temporale dopo aver fatto clic su No.Avanti, assegnare un nome al progetto e fare clic su Salva" per creare il progetto nell'elenco dei progetti. Fare doppio clic sul progetto per aprire il tomogramma e caricarlo nell'ambiente interattivo di realtà virtuale. Per configurare la realtà virtuale, o VR, collegare il visore VR e i controller manuali al computer.
Segui le istruzioni sullo schermo per calibrare l'ambiente VR. Regolare il sistema per assicurarsi che l'area desiderata per la segmentazione si trovi nel campo visivo dell'ambiente VR, quindi fare clic sul pulsante di visualizzazione nell'interfaccia del software. Regola le opzioni di visualizzazione come contrasto, finestra, luminosità e cursori di soglia per migliorare il segnale e ridurre al minimo il rumore.
Usa i controller manuali per avvicinare il tomogramma o spingerlo via per un migliore esame. Attiva lo strumento di taglio utilizzando il controller sinistro. Ispezionare visivamente le diverse fette all'interno del tomogramma.
Navigare attraverso il tomogramma fino alla sezione desiderata in cui inizierà la segmentazione. Attiva l'opzione regione di interesse, o ROI, nel menu delle annotazioni utilizzando i controller manuali. Nel tomogramma apparirà una casella verde.
Regola le dimensioni e la posizione della casella verde in base all'area da segmentare. Ora, blocca il ROI usando il controller sinistro. Lo strumento passerà alla modalità di disegno per la segmentazione.
Ingrandisci o riduci il tomografo per una segmentazione precisa. Regola le dimensioni del pennello con rotazioni in senso orario o antiorario per un controllo ottimale. Segmentare attentamente la regione di interesse, come le membrane mitocondriali, all'interno dell'area tridimensionale.
Regolare il raggio della sfera in modo appropriato durante l'esecuzione della segmentazione. Attiva la modalità di cancellazione utilizzando il grilletto del controller secondario per correggere gli errori di segmentazione e usa lo stesso movimento della segmentazione per cancellare. Ripetere il processo di segmentazione per tutte le regioni fino a quando il tomogramma non è completamente segmentato.
Dopo aver completato la segmentazione, fare clic sul progetto completato per evidenziarlo. Fare clic sulla scheda Progetti"e selezionare ROI"per procedere. Scegli di esportare l'intero volume o una regione specifica di interesse e specifica la posizione di esportazione per i dati segmentati.
Ora, carica e analizza i dati segmentati esportati da SciGlass nel software desiderato di scelta per un'ulteriore analisi dei dati segmentati. Dopo aver preparato i dati crio-ET, fare clic con il pulsante destro del mouse sul progetto e fare clic su Aggiungi dati maschera, quindi navigare fino al punto in cui viene salvata la segmentazione iniziale e importarla nello stesso progetto. Attiva l'annotazione ROI per apportare modifiche alla segmentazione iniziale.
Infine, aggiungi o cancella la segmentazione per ripulire la segmentazione iniziale. La retroproiezione ponderata dei tomogrammi ricostruiti a 16 angstrom per pixel ha rivelato strutture mitocondriali e membranose in seguito al de-noising e alla correzione del cuneo mancante. La visualizzazione in un ambiente immersivo di realtà virtuale ha consentito un'ispezione 3D dettagliata delle membrane dopo che l'equalizzazione dell'istogramma ha migliorato il contrasto.
La segmentazione manuale ha delineato le strutture mitocondriali e degli organelli con elevata precisione utilizzando strumenti VR, inclusa la mappatura precisa dei confini della membrana e delle ROI. I rendering 3D finali hanno rivelato caratteristiche mitocondriali dettagliate come le membrane esterne e interne. E depositi di fosfato di calcio con maglie levigate.
