이 작업에서는 소프트웨어 SciGlass를 사용하여 초저온 전자 단층 촬영 데이터를 분할하는 프로토콜에 대해 설명합니다. SciGlass는 cryo-ET 텔레그램을 분할하기 위한 몰입감 있고 직관적인 인터페이스를 제공하는 가상 현실 기반 소프트웨어로, VR이 cryo-ET 분할 파이프라인에 통합될 수 있는 실행 가능한 도구임을 보여줍니다. Cryo-ET는 혁신과 집중으로 빠르게 발전하고 있습니다.
더 얇은 샘플과 더 빠른 데이터 수집 방법, 그리고 세그먼트 입자 선별을 개선하기 위한 머신 러닝 알고리즘을 사용하는 등 이러한 모든 발전은 더 나은 cryo-ET와 정말 뛰어난 생물학적 통찰력의 채택으로 절정에 달합니다. Cryo-ET는 저처리량 cryo와 같은 문제에 직면해 있습니다. 예를 들어 500나노미터보다 두꺼운 샘플의 경우 낮은 복제 수로 인해 관심 영역을 타겟팅하는 데 어려움이 있습니다.
또한 데이터 처리는 여전히 병목 현상으로 남아 있어 입자 선별 및 세분화를 위한 광범위한 수동 주석과 cryo-ET에 필요한 전문 지식이 필요하므로 전체 워크플로우 속도가 느려집니다. 우리는 가상 현실이 기존 방법에 비해 세분화 효율성을 향상시킨다는 것을 발견했습니다. 몰입형 환경은 격차를 메우고 거짓 긍정을 줄임으로써 자동화된 접근 방식을 보완합니다.
또한 이 VR 플랫폼은 훈련 및 교육에 매우 효과적이므로 cryo-ET 데이터 분석에서 다재다능한 도구입니다. 우리의 프로토콜은 수동 및 느리고 어려운 프로세스를 포함하는 전통적인 세분화의 비효율성을 해결하므로 가상 현실의 몰입감 있고 직관적인 특성을 활용하여 프로세스를 더 빠르고 사용자 친화적으로 만들어 세분화를 간소화하는 것을 목표로 합니다. 먼저 원시 cryo-ET 단층촬영을 TIFF 스택과 같은 SciGlass와 호환되는 데이터 형식으로 변환합니다.
ImageJ를 사용하여 신호를 설정하여 입자가 검은색 바탕에 흰색이 되도록 합니다. Process(프로세스)로 이동한 다음 Enhance Contrast(대비 향상)로 이동하여 Equalize histogram(히스토그램 균등화)"을 선택하고 모든 슬라이스를 처리합니다. 컴퓨터에서 가상 현실 소프트웨어를 실행합니다.
파일" 메뉴로 이동하여 프로젝트 만들기를 선택합니다. 새 프로젝트 만들기를 클릭 한 다음 파일 추가"소프트웨어에서. TIFF 파일의 위치로 이동하여 프로젝트로 가져옵니다.
메시지가 표시되면 아니오를 클릭한 후 파일이 시계열의 일부가 아닌지 확인합니다.그런 다음 프로젝트에 이름을 지정하고 저장을 클릭하여 프로젝트 목록 아래에 프로젝트를 만듭니다. 프로젝트를 두 번 클릭하여 단층 촬영을 열고 대화형 가상 현실 환경에 로드합니다. 가상 현실 또는 VR을 설정하려면 VR 헤드셋과 핸드 컨트롤러를 컴퓨터에 연결합니다.
화면의 지시에 따라 VR 환경을 보정합니다. 원하는 세분화 영역이 VR 환경의 시야에 있도록 시스템을 조정한 다음 소프트웨어 인터페이스에서 시각화 버튼을 클릭합니다. 대비, 윈도잉, 밝기 및 임계값 슬라이더와 같은 시각화 옵션을 조정하여 신호를 향상시키고 노이즈를 최소화합니다.
핸드 컨트롤러를 사용하여 단층 촬영을 더 가까이 당기거나 밀어서 더 나은 검사를 할 수 있습니다. 왼쪽 컨트롤러를 사용하여 절단 도구를 활성화합니다. 단층촬영(tomogram) 내의 다양한 절편을 육안으로 검사합니다.
단층촬영을 통해 분할이 시작될 원하는 슬라이스로 이동합니다. 핸드 컨트롤러를 사용하여 주석 메뉴에서 관심 영역(region-of-interest) 또는 ROI(ROI) 옵션을 활성화합니다. 단층 촬영에 녹색 상자가 나타납니다.
녹색 상자의 크기와 위치를 세그먼트화할 영역으로 조정합니다. 이제 왼쪽 컨트롤러를 사용하여 ROI를 잠급니다. 도구는 분할을 위해 페인트 모드로 전환됩니다.
정확한 분할을 위해 단층 촬영기를 확대 또는 축소할 수 있습니다. 최적의 제어를 위해 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 회전하여 페인트 브러시 크기를 조정합니다. 미토콘드리아 막(mitochondrial membranes)과 같은 관심 영역을 3차원 영역 내에서 조심스럽게 분할합니다.
분할을 수행하는 동안 볼 반경을 적절하게 조정합니다. 보조 컨트롤러 트리거를 사용하여 지우기 모드를 사용하여 세분화 오류를 수정하고 세분화와 동일한 동작을 사용하여 지웁니다. 단층촬영이 완전히 분할될 때까지 모든 영역에 대해 분할 과정을 반복합니다.
세분화를 완료한 후 완료된 프로젝트를 클릭하여 강조 표시합니다. 프로젝트를 클릭하십시오."탭을 선택하고 ROIs"계속하려면. 전체 볼륨 또는 특정 관심 영역을 내보내도록 선택하고 세그먼트화된 데이터의 내보내기 위치를 지정합니다.
이제 SciGlass에서 내보낸 세그먼트화된 데이터를 로드하고 분석하여 세그먼트화된 데이터의 추가 분석을 위해 원하는 소프트웨어로 이동합니다. Cryo-ET 데이터를 준비한 후 프로젝트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Add Mask Data를 클릭한 다음 초기 세분화가 저장된 위치로 이동하여 동일한 프로젝트 아래로 가져옵니다. ROI 주석을 사용하여 초기 세분화를 편집합니다.
마지막으로 세분화를 추가하거나 지워 초기 세분화를 정리합니다. 픽셀당 16옹스트롬으로 재구성된 단층촬영의 가중 역투영은 잡음 제거 및 쐐기 보정 누락 후 미토콘드리아 및 막질 구조를 드러냈습니다. 몰입형 가상 현실 환경에서의 시각화를 통해 히스토그램 이퀄라이제이션을 통해 대비를 강화한 후 멤브레인을 세부적으로 3D 검사할 수 있었습니다.
Manual segmentation은 막 경계와 ROI의 정확한 매핑을 포함하여 VR 도구를 사용하여 높은 정확도로 미토콘드리아 및 세포 기관 구조를 설명했습니다. 최종 3D 렌더링을 통해 외막과 내막과 같은 상세한 미토콘드리아 특징이 드러났습니다. 그리고 인산칼슘은 매끄럽게 된 그물망으로 침전됩니다.
